II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4.4.Kết quả ựinh danh các chủng vi khuẩn probiotic bằng phản ứng PCR
4. KẾT QUẢ
4.4.Kết quả ựinh danh các chủng vi khuẩn probiotic bằng phản ứng PCR
Nhằm thử nghiệm ựịnh danh nhanh, chắnh xác các chủng vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử, chúng tôi ựã tiến hành khảo nghiệm việc sử dụng cặp mồi Universal 27F + 1497R) (Weisburg et al, 1991) và 1492R (Frank et al, 2008) ựể nhân ựặc hiệu các ựoạn gene mã hóa 16S rRNA. Bên cạnh ựó, chúng tôi còn tiến hành sử dụng cặp mồi 27F Bif + 1497R (Frank et al, 2008) ựể tiến hành khuyếch ựại ựoạn trình tự ựặc hiệu cho các loài thuộc chi Bifidobacteria. Trình tự các ựoạn mồi này ựều nằm trên vùng bảo thủ ở hai ựầu ựoạn gene 16S rRNA dựa trên kết quả căn trình tự các ựoạn 16S rRNA ở cơ sở dữ liệu về trình tự gene 16S rRNA của dự án về cơ sở dữ liệu về trình tự các ựoạn gene
ribosome II (Ribosomal database project II) (Frank et al, 2008). Thêm nữa, chúng tôi ựã sử dụng cặp mồi LactoF và LactoR (Frank et al, 2008; Fraccia et
al, 2010). đây là những mồi ựược thiết kế tại vùng gene 16S rRNA ựặc thù cho các loài thuộc chi Lactobacillus (Tannock, 1999). Kết quả ựược thể hiện theo ảnh ựiện di kiểm tra sản phẩm sau:
Hình 4.4A: Ảnh ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi 16SB, 16SC, 16SL.
Chú thắch: Trong ựó 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, M lần lượt tương ứng với LTM1.1, LTM1.2, AIG1.1, AIG1.2, AIG1.3, AIG.1.1, AIG.12, AIG1.3, Ladder và 1, 2, 3 là mồi 16 S B; 4, 5, 6 là mồi 16S L 7, 8, 9 là mồi 16 S C. Ladder mix của 100 bp và 1kb.
Hình 4.4B: Ảnh ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR
250bp 1500bp 9 10 11 12 13 14 15 16 23 24 25 26 27 28 31 M 1 2 3 4 5 6 7 8 17 18 19 20 21 22 29 30 250 bp 1500 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 250 bp 9 10 11 12 13 14 15 16 23 24 25 26 27 28 31 M 1 2 3 4 5 6 7 8 17 18 19 20 21 22 29 30
* Chú thắch: Trong ựó 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 20,21, 22, 29, 30 tương ứng với mẫu E.coli, Ecoli, BA1.1, BA1.2, AIG1.1, AIG1.2, ATB1.1, ATB1.2, LTM1.1, LTM1.2, LTM1.3, LTM1.4, LTM1.5, LTM1.6, BIA1.1, BIA1.2 ựược chạy với mồi 16 S L; 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 lần lượt ứng với các mẫu E.coli, Ecoli, BA1.1, BA1.2, AIG1.1, AIG1.2, ATB1.1, ATB1.2 ựều ựược chạy với mồi 16 S C và 23, 24, 25, 26, 27, 28, 31, M lần lượt tương ứng với các mẫu LTM1.1, LTM1.2, LTM1.3, LTM1.4, LTM1.5, LTM1.6, BIA1.1, BIA1.2, Ladder ựều ựược chạy với mồi 16 S B
Theo kết quả trên, các chủng BIA 1.1, BIA1.2; AIG1.1, AIG1.2, ATB1.1, ATB1.2, LTM1.1, BA1.1, BA1.2 khi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi Lacto-F và Lacto-R ựều cho vạch băng trong ảnh kắch thước khoảng dưới 250 bp, phù hợp với kắch thước nhân ựược của các chủng thuộc chi Lactobacillus,
Bifidobacterium (Fracchia et al, 2010; Stoyanovpski et al, 2009; Frank et al, 2008). Kết hợp với kết quả ựánh giá hình thái, chúng tôi khẳng ựịnh các chủng BIA1.1, BIA1.2; AIG1.1, AIG1.2, là các chủng thuộc chi Lactobacillus, chủng LTM1.1, LTM1.2 thuộc chi Bifidobacterium và isolate BA1.1, BA1.2 thuộc chi
Bacillus. Tuy nhiên, chủng E. coli ựược sử dụng làm ựối chứng cũng có xuất hiện băng có kắch thước khoảng 250 bp. Chúng tôi ựã tiến hành kiểm tra các ựoạn mồi trên với trình tự 16S rRNA của 1 chủng thuộc vi khuẩn E. coli ựược công bố trên gene bank và phát hiện các cặp mồi này ựều có thể nhân lên 1 ựoạn có kắch thước tương ựương. đồng thời so sánh trình tự cặp mồi trên với trình tự
gene 16S rRNA của vi khuẩn Bifidobacterium cũng cho kết quả tương tự. Do vậy, có thể cặp mồi này không ựặc hiệu cho việc phát hiện và phân biệt loài thuộc chi Lactobacillus bằng phương pháp PCR. Mặc dù, các cặp mồi này ựã từng ựược sử dụng ựể phân biệt các loài thuộc chi Lactobacillus trong nhiều nghiên cứu (Stoyanovpski et al., 2009; Frank et al. 2008).
đối với cặp mồi 16S chung, trừ 4 mẫu ATB 1.1, ATB1.2 và AIG 1.1, AIG1.2 không có băng, các chủng khác ựều xuất hiện băng có kắch thước khoảng 1500 bp. điều này có thể do cặp mồi chung có trình tự tương ựồng với chỉ khoảng 400000 trình tự 16S rRNA ựược công bố trong dự án về cơ sở dữ liệu về gene mã hoá rRNA. Do ựó, có thể các cặp mồi không nhân ựược ựoạn trình tự của 4 mẫu trên do không ựược thiết kế ựặc hiệu.
đối với cặp mồi 27F Bif và 1492R, do cặp mồi này có chung mồi reverse, ựồng thời mồi forward chỉ thay ựổi 3 hoặc 4 nu trong trình tự, trong khi trình tự ựầu 3Ỗ của mồi 27F Bif lại giống với mồi 27F C, vì vậy cặp mồi 16S B có thể nhân lên các ựoạn trình tự mà cặp mồi 16S C khuyếch ựại ựược.
* định loại sơ bộ 6 chủng vi khuẩn probiotic:
Căn cứ vào khoá phân loại của Bergeys (1982) và Okada (1992) và trên cơ sở các ựặc ựiểm hình thái, sinh lý và sinh hóa và kết quả của phản ứng PCR chúng tôi ựã sơ bộ ựịnh danh ựến chi của 6 chủng vi khuẩn probiotic như sau:
- Chủng LTM1.1 thuộc chi Bifidobacterium
- ChủngATB1.1, AIG1.1, BIA1.1 thuộc chi Lactobacillus
- Chủng BLC1.1, CO1.1, thuộc chi Bacillus
đây là các chủng vi khuẩn thường ựược nghiên cứu liên quan ựến Probiotic và cũng chưa có tài liệu nào công bố là các chủng này gây hại cho sức khoẻ con người và gia súc, gia cầm.