II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.3.2. Phương pháp phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật
3.3.2.1. Phương pháp phân lập
a. Phương pháp phân lập vi sinh vật:
* Phân lập vi khuẩn lactic:
để phân lập vi khuẩn lactic từ các chế phẩm probiotic sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước vô trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng ựộ 10-3 và 10-5 trên ựĩa Petri chứa môi trường MRS. Nuôi cấy vô trùng ở 370C trong 48 giờ. Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên ựĩa Petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong). Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng. Mỗi mẫu phân lập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới kắnh hiển vi.
* Phân lập vi khuẩn Bacillus:
Phân lập vi khuẩn Bacillus tương tự như phân lập vi khuẩn lactic. Sau khi pha loãng, dịch mẫu ựược gạt trên ựĩa Petri chứa môi trường LB. Nuôi ở 370C trong 48 giờ. Lựa chọn các khuẩn lạc khô, màu xám nhạt, hơi nhăn, mép quăn bám chặt vào môi trường. Tách và thuần khiết các khuẩn lạc.
* Phân lập Aspergillus oryzae:
Aspergillus oryzae ựược phân lập theo phương pháp cấy trải trên môi trường PDA ựặc (phương pháp Koch). Lấy 50ộl dịch mẫu bánh men rượu hoặc mốc trương ựã ựược pha loãng ở nồng ựộ 10-4 - 10-6 cấy vào ựĩa petri; nuôi ở nhiệt ựộ 28ỨC Ờ 30ỨC trong 3 Ờ 4 ngày. Chọn các khuẩn lạc có màu xanh hoặc vàng cau, tách và thuần thiết các khuẩn lạc.
b. Phương pháp phân loại vi sinh vật
* Phân loại vi khuẩn
Quan sát hình thái
để quan sát hình thái vi khuẩn dùng phương pháp nhuộm ựơn: Nhỏ một giọt nước cất lên lam kắnh, dùng que cấy lấy một ắt khuẩn lạc hoà tan và giàn ựều. Cố ựịnh vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa ựèn cồn. Nhuộm vết bôi bằng cách nhỏ vài giọt Fuschin lên vết bôi và giữ trong khoảng 2-3 phút. Rửa nước trên vết nhuộm cho ựến khi nước chảy ra không còn màu thuốc nhuộm. Làm khô tiêu bản trên ựèn cồn. Soi trên kắnh hiển vi ở vật kắnh 100x.
Nhuộm gram
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn ựặt lên phiến kắnh. Cố ựịnh tiêu bản bằng ngọn lửa rồi nhuộm thuốc ựầu bằng dung dịch tắm kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước. Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút. Rửa bằng nước, phủ lên vết bôi dung dịch ethanol 95% : aceton (1:1) trong khoảng 1 phút. Lại rửa bằng nước. Sau ựó nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu ựỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây - Rửa qua nước, ựể khô, soi kắnh.
Phản ứng catalase : Tiến hành: Nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn, quan sát sự xuất hiện bọt khắ bằng mắt thường.
Phương pháp sinh học phân tử: Phản ứng PCR (polymerase chain reaction):
* Thành phần phản ứng: Thành phần Thể tắch (ộl) H2O 10X buffer 19.8ộl 2.5ộl dNTP 2.0 mM 0.7ộl Primer 1ộl Taq polymerase 1ộl Template 0.5ộl * Chu trình nhiệt: 950C - 5 phút 950C Ờ 1 giây 560C - 45 giây 720C Ờ 1.5 phút 720C - 10 phút 40C - ∞ 40 chu kỳ * Primer: Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR N
o ID Sequence PCR data Ref
1 27f 5'AGAGTTTGATCMTGGCTCA G3'. 20 bases (M=A/C) Lane, D. J. (1991). 2 27f Bif 5' AGGGTTCGATTCTGGCTCAG 3'. 20 base, bifidobacteriaceae specific Jeremy A. Frank et al. (2008) 3 Lacto R 5' GYCCATTGTGGAAGATTCCC 3'.
20 bases (Y=T/C) Jeremy A. Frank
et al. (2008) 4 1492 R 5'TACGGYTACCTTGTTACGA CTT3' 22 bases (Y=T/C) Jeremy A. Frank et al. (2008)
* Chú thắch: 1,4 là mồi chung, 2 là mồi Bifidobacterium và 3 là mồi Lactobacillus.
* Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng ựiện di trên agarose 1,5%:
đun tan 1.5% agarose (dung dịch 50X TAE: 1.4 ml, nước cất: 70ml, agarose: 1.05g) ựể ấm, ựổ vào khuôn, ựợi cho nguội và ựặt tấm gel vào trong máy ựiện di, ngập trong 300 ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 ộl dung dịch 5X loading buffer với 5l mẫu trộn ựều, nhỏ vào giếng. Chạy ựiện di bằng dòng ựiện một chiều với ựiện thế 100V, cường ựộ dòng ựiện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng ựộ 0,5 ộl/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
* Phương pháp ựịnh danh sơ bộ nấm mốc Aspergillus oryzae bằng quan sát
ựặc tắnh hình thái:
Quan sát ựại thể nấm mốc
Nấm mốc, sau khi cấy chuyển sang thạch nghiêng, ựược tiến hành tạo khuẩn lạc như sau: một ắt bào tử nấm từ ống giống ựược cho vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng, lắc ựều tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm ựiểm vào mặt thạch ở giữa ựĩa petri. Tiến hành cấy trên 3 ựĩa. Lưu ý không ựể ựiểm chấm loang trên mặt thạch. Nấm ựược ủ trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 300C trong 5 ngày. Quan sát và mô tả ựặc ựiểm khuẩn lạc: kắch thước, màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, ựặc ựiểm dạng sợi nấm mọc ở trên mặt khuẩn lạc.
Quan sát vi thể nấm mốc
Làm tiêu bản tạm thời ựể quan sát ựược ựặc ựiểm của sợi khắ sinh, cuống ựắnh bào tử và bào tử (màu sắc, hình dạng).
Tiến hành lau cồn cho lam kắnh và lamen trước khi làm tiêu bản. Cho 1 giọt nước hoặc glycerol 50% hoặc xanh methylen (pha thành 3 dung dịch riêng biệt: dung dịch 1: 0,9g Na2HPO4 trong 500ml nước cất, dung dịch 2: 13,6g KH2PO4
trong 500ml nước cất, dung dịch 3: 0,1g methylen xanh hòa vào 500ml nước cất. Hỗn hợp có: 0,25ml dung dịch 1 + 99,75ml dung dịch 2 + 100ml dung dịch 3
(Lương đức Phẩm, 2009)) vào giữa lam kắnh, lấy 1 lượng nhỏ nấm mốc hòa vào 5ộl nước/ glycerol 50%/xanh methylen cho ựều. đặt lamen nghiêng 1 góc 45Ứ so với mặt lam kắnh sau ựó thả từ từ ựể không tạo bọt khắ trên tiêu bản. Dùng giấy thấm nước xung quanh lamen. đem tiêu bản soi dưới kắnh hiển vi và quan sát
3.3.2.2. Phương pháp chọn lọc các vi sinh vật có ựặc tắnh probiotic
a. Xác ựịnh hoạt tắnh enzyme ngoại bào
Hoạt tắnh enzyme ựược xác ựịnh bằng phương pháp ựục lỗ. Phương pháp như sau: Bản thạch thử hoạt tắnh enzyme (cơ chất: tinh bột, cellulose, gelatin) ựược ựổ trên ựĩa Petri, sau khi môi trường ựã ựông cứng tiến hành ựục lỗ thạch. Nhỏ dịch enzyme vào các lỗ ựã ựục, ựể ở 370C trong 24 giờ, sau ựó nhuộm bằng thuốc thử Lugol ựể vòng phân giải cơ chất hiện rõ. đo vòng phân giải D - d (mm), D là ựường kắnh vòng ngoài, d là ựường kắnh lỗ nhỏ dịch.
b. Hoạt tắnh kháng vi khuẩn kiểm ựịnh
Chủng vi sinh vật ựã tuyển chọn ựược nuôi cấy lắc trong môi trường dịch thể thắch hợp, với tốc ựộ 200 vòng/phút, ở 37oC trong 48h. Ly tâm dịch nuôi cấy ựó với tốc ựộ 10.000 vòng/15 phút, thu dịch trong.
Cấy gạt các vi khuẩn kiểm ựịnh lên trên ựĩa Petri ựã ựổ thạch thường sau ựó ựục lỗ thạch bằng nút khoan. Nhỏ 0,05 ml dịch trong thu ựược vào các lỗ thạch, ựể khuếch tán từ 4 - 8h ở 4oC. Sau ựó, chuyển sang tủ ấm 37oC. Quan sát vòng kháng khuẩn sau 24h. Hoạt tắnh kháng kháng khuẩn ựược tắnh bằng: D Ờ d (mm). Trong ựó: D là ựường kắnh vòng vô khuẩn (mm), d là ựường kắnh lỗ thạch (mm), d = 9mm.
c. Khả năng chịu dịch mật
đối với mật lợn: Mật ựược lấy từ những con lợn khỏe mạnh, không mắc bệnh. Pha môi trường MRS, LB lỏng có bổ sung mật lợn ở các nồng ựộ là: 40%, 50%, 60% và 70% (môi trường dinh dưỡng MRS 2x và LB 2x), hấp vô trùng. Nuôi cấy các chủng vi khuẩn từ chế phẩm trên khoảng 24h, tiến hành hút dịch
nuôi cấy trải trên môi trường MRS, LB ựặc ủ trong 24h và quan sát khả năng sinh trưởng.
đối với mật gà: Cũng tiến hành tương tự như ựối với mật lợn nhưng với nồng ựộ 40%, 50%, 60%, 70% và 80%.
Thắ nghiệm trên ựược ựối chứng với chủng vi khuẩn E.coli (E.coli cũng ựược bố trắ thắ nghiệm như các chủng trên).
d. Thắ nghiệm ựánh giá khả năng chịu pH
Chuẩn bị môi trường MRS (LB) lỏng, ựiều chỉnh ở các pH khác nhau (từ pH2 ựến pH5) bằng HCl 1N và NaOH 1N. Khử trùng ở 1210C/15 phút. Nhỏ 1% dịch giống VK vào các ống nghiệm trên, nuôi cấy lắc ở 37oC/48h
đánh giá khả năng chịu pH bằng ựo OD (620 nm) và bằng phương pháp cấy gạt trên ựĩa thạch: hút 0,1 ml dịch nuôi cấy, cấy gạt trên môi trường thạch MRS (LB) ở 37ỨC, sau 48h quan sát và ựếm khuẩn lạc.