từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia
Quá trình nghiên cứu chiết xuất tinh dầu quế có enzyme hỗ trợ được thực hiên theo sơ đồ sau:
Hình 3.1. Qui trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất tinh dầu
Laccase Htec 2 Nguyên liệu cành lá quế, vỏ
quế Xay, nghiền Sơ chế Xác định thành phần sinh hóa Cellulose Pentose Ligin HC trích ly Thủy phân
Tinh dầu (EAD)
Tinh dầu (HD) Cất cuốn hơi nước Laccase + Htec 2 Xác định hàm lượng đường Xác định hàm lượng lignin
Hàm lượng tinh dầu
Thành phần hóa học
Hoạt tính sinh học Đánh giá
Thời gian chưng cất Cất cuốn
3.1.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền và tinh dầu của mẫu cành lá và mẫu vỏ quế C. cassia
3.1.1.1. Phân tích thành phần chất nền của mẫu cành lá và mẫu vỏ quế C. cassia
Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 5 g bột nguyên liệu đem phân tích hàm ẩm theo TCVN 1867:2001. Từ đó, xác định hàm lượng hàm lượng cellulose, pentose, hàm lượng ligin, hàm lượng các chất trích ly theo khối lượng khô tuyệt đối.
3.1.1.2. Xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu của mẫu cành lá và mẫu vỏ quế C. cassia
- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất cuốn hơi nước (Dược điển Việt Nam IV [2].
Thí nghiệm 100 g bột cành lá quế, vỏ quế ngâm với nước ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ nguyên liệu - nước 1:5, thời gian ngâm 24 h (cành lá quế), 72 h (vỏ quế). Nguyên liệu cho vào bình cầu dung tích 2 l, bổ sung thêm nước cất sao cho khối lượng cất chiếm 50% thể tích bình. Tinh dầu thu được nhờ hệ thống cất tinh dầu Clevenger, sản phẩm thu được được làm khan bằng Na2SO4.
Hàm lượng tinh dầu (%) = Khối lượng tinh dầu (g) x 100 Khối lượng nguyên liệu (g)
- Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định bằng GC-MS (mục 2.3.2.1).
3.1.2. Nghiên cứu tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu
3.1.2.1. Nghiên cứu mối tương quan giữa mức độ thủy phân và hiệu suất thu tinh dầu quế C. cassia
Bột cành lá quế, vỏ quế bổ sung thêm nước theo tỷ lệ tương ứng là 1:5 và 1:7, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24 h ủ đối với cành lá quế và 72 h ủ đối với vỏ quế, điều chỉnh bình thủy phân đến nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động thì bổ sung enzyme. Quá trình thủy phân diễn ra trong bể ổn nhiệt, tốc độ khuấy đảo nguyên liệu 120 vòng/phút. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế chỉ ra ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế
TT Thông số quá trình Phương án bổ sung enzyme
Laccase Htec2 Laccase-Htec2
1 pH 3-8 3-8 3-8
2 Nhiệt độ 30-60oC 30-60oC 30-60oC
3 Tỷ lệ E/S 0.2-1 ml/g 0.5-2% Laccase: 0.2-1,0 ml/g,
Htec2 0.5-2% 4 Tốc độ khuấy 120 vòng/phút 120 vòng/phút 120 vòng/phút
5 Thời gian thủy phân 6 h 6 h 6 h
Các thông số sau đây được xác định trong mỗi thực nghiệm:
* Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu sau khi xử lý enzyme (µg/ml). Các thí nghiệm với 10 g nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước. Khử trùng ở nhiệt độ 120oC/30 phút. Quá trình thủy phân diễn ra trên máy khuấy từ gia nhiệt (IKA -Đức) với các thông số theo các phương án xử lý (Bảng 3.1). Sau 6 h thủy phân, 10 ml dịch sau thủy phân được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch thủy phân được xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS trên máy so màu UV-VIS Double Beam, Model UVD-3200 Labomed đo ở bước sóng 540 nm. Hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình thủy phân được tính toán theo đường chuẩn glucose theo mục 2.3.3.1.
Hàm lượng đường khử = Hàm lượng đường sau thủy phân - Hàm lượng đường khử trước thủy phân (μg/ml).
* Hàm lượng lignin trong nguyên liệu sau khi xử lý enzyme (% tính trên khối lượng nguyên liệu khô).
Toàn bộ phần cặn không tan sau ly tâm được rửa nhiều lần bằng nước cất, sấy khô đến trọng lượng không đổi ở nhiệt độ 60oC. Xác định hàm lượng lignin còn lại trong nguyên liệu.
* Hàm lượng tinh dầu (% tinh dầu tính trên khối lượng nguyên liệu khô gió). Mẫu thí nghiệm với 100 g nguyên liệu/mẻ trong cốc có mỏ 1000 ml, bổ sung thêm 500 ml nước. Quá trình thủy phân diễn ra trong bể ổn nhiệt (Memmert- Đức), khuấy đảo hỗn hợp bằng máy khuấy cơ (IKA- Đức), tốc độ 120 vòng/phút với các thông số theo các phương án xử lý (Bảng 3.1).
Sau thủy phân, hỗn hợp nguyên liệu được đem đi chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trên bộ cất Clevenger [2]. Sự gia tăng hàm lượng tinh dầu so với đối chứng không sử dụng enzyme được xác định theo công thức:
Tỷ lệ gia tăng hàm lượng tinh dầu %= ℎ𝑒−ℎ0
ℎ0
Trong đó: he (%): Hàm lượng tinh dầu theo phương pháp enzyme hỗ trợ h0 (%): Hàm lượng tinh dầu không sử dụng enzyme
3.1.2.2. Nghiên cứu thời gian cất tinh dầu
Hàm lượng tinh dầu của mẫu xử lý enzyme thu được sau khi chưng cất 2h, 3h, 4h... được xác định. Mẫu không enzyme cũng được tiến hành song song.
3.1.2.3. Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu
Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu tinh dầu khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau được xác định bằng phương pháp GC-MS trên máy sắc ký khí Agilent HP mode 7890A gas chromatograph trang bị cột tách mao quản (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm) Hewlett Packard HP5-MS (5% phenyl methyl siloxane), kết nối với máy đo phổ khối Agilent 5973 mass spectrometer.
3.1.2.4. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu
Mẫu tinh dầu có sử dụng và không sử dụng enzyme được xác định một số hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính kháng u, hoạt tính chống oxy hóa (tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các HCTN), hoạt tính kháng viêm tại phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.
* Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Trước khi tiến hành thí nghiệm, các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng theo tiêu chuẩn McFarland 0,5 (khoảng 108 VSV/ml). Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu MIC.
* Xác định khả năng gây độc tế bào
Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến pha log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở các thang nồng độ khác nhau. Mỗi giếng thử
gồm tế bào, môi trường nuôi cấy và mẫu thử, được ủ trong tủ ấm CO2 ở 37oC/48 trong72h. Sau cố định tế bào và nhuộm bằng thuốc nhuộm SRB, đọc kết quả trên máy đọc Elisa bước sóng 515 nm, từ đó xác định tỉ lệ CS (Cell survival, tế bào sống sót). Giá trị IC50 được xác định bằng phần mềm TableCurve v4.0 (Systat Software Inc.).
* Xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7
Tế bào RAW 264.7 được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h. Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm, chứng dương là cardamonin. Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).
* Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết được xác định bằng thử nghiệm trên hệ DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), dựa trên nguyên tắc DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hòa. Khả năng hấp thụ của DPPH ở 515 nm được đo bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng. Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình của 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05). Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve v4.0.
3.1.3. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá và vỏ quế
3.1.3.1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân * Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH
Thực hiện 07 thí nghiệm, mỗi mẫu 10g bột nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như nhiệt độ 40oC, bổ sung enzyme theo Bảng 3.1, thay đổi các giá trị
pH từ 3,0-8,0 (bước nhảy 1) bằng axit HCl 0.01N và NaOH 0.01M. Chỉnh pH bằng máy đo pH.
Sau 6 giờ thủy phân, tiến hành đo hàm lượng lượng đường khử bằng phương pháp DNS. Hàm lượng đường sinh ra càng lớn, khả năng thủy phân càng hiệu quả, lựa chọn pH 5 thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Thực hiện 07 thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm 10g bột nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, bổ sung enzyme theo Bảng 3.1, thay đổi các giá trị nhiệt độ từ từ 30- 60oC, bước nhảy 5oC.
Sau 6 giờ thủy phân, tiến hành đo hàm lượng lượng đường khử. Hàm lượng đường sinh ra càng lớn, khả năng thủy phân càng hiệu quả, lựa chọn nhiệt độ 450C thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme /cơ chất
Ảnh hưởng của tỷ lệ Laccase / cơ chất
Thực hiện 06 thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm được thực hiện với 10g bột nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, nhiệt độ 45oC, bổ sung enzyme Htec2 1%, thay đổi tỷ lệ enzyme laccase bổ sung: 0.1 - 0.7 ml/g cơ chất. Tương tự, xác định hàm lượng đường khử sau 6 giờ thủy phân.
Ảnh hưởng của tỷ lệ Htec2 / cơ chất
Thực hiện 06 thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm được thực hiện với 10g bột nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, nhiệt độ 45oC, bổ sung enzyme Laccase phù hợp, thay đổi tỷ lệ enzyme Htec2 bổ sung: 0.5% - 1,75% (w/w), bước nhảy 0.25%. Tương tự, xác định hàm lượng đường khử sau 6 giờ thủy phân, kết quả lựa chọn tỷ lệ enzyme phù hợp.
100 g bột nguyên liệu cho vào cốc có mỏ 1000 ml, bổ sung 500 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, nhiệt độ 45oC, bổ sung enzyme Laccase, Htec 2 phù hợp. Ở các thời điểm khác nhau của quá trình thủy phân, hút 5 ml dịch thủy phân đem ly tâm và xác định hàm lượng đường khử sinh ra. Lựa chọn khoảng thời gian phù hợp mà cho hàm lượng đường khử sinh ra là lớn nhất.
3.1.3.2. Tối ưu hóa bằng qui hoạch hóa thực nghiệm
Sau khi khảo sát lựa chọn được vùng tối ưu ảnh hưởng đến mức độ thủy phân cành lá quế bởi hệ enzyme Laccase-Htec2, để tìm điều kiện tối ưu chính xác trên cơ sở mô hình tính toán, chúng tôi áp dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm. Các bước thực hiện theo mục 2.3.7.2.
3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna
3.2.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nềncủa bột gỗ gió bầu A. crassna
Thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A. crassna cũng được phân tích tương tự như đối với mẫu cành lá quế và vỏ quế được trình bày ở mục 3.11.
3.2.2. Nghiên cứu thăm dò tác động của việc xử lý enzyme Laccase- Htec2 lên quá trình chưng cất tinh dầu từ bột gỗ gió bầu A. crassna
Hai thực nghiệm được tiến hành song song, trong đó bột gỗ gió bầu đều được ngâm trong nước (tỉ lệ bột gỗ - nước là 1:7) trong 2 tuần. Tiếp theo, mẫu đối chứng được chưng cất ngay sau khi ủ, mẫu nghiên cứu được xử lý với hệ enzyme Laccase- Htec2 ở pH 5.2, nhiệt độ 440C, tốc độ khuấy 120 vòng/phút, tỷ lệ enzyme Laccase/S 0.7 ml/g, Htec2 / cơ chất 1.5% và thời gian thủy phân 8 giờ rồi đem cất lôi cuốn hơi nước trong thiết bị Clevenger để thu lấy tinh dầu.
Hàm lượng tinh dầu sau chưng cất được xác định tương tự như đối với nguyên liệu quế. Thành phần tinh dầu từ gỗ gió bầu A. crassna có và không có enzyme hỗ trợ được xác định bằng GC-MS.
3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares
Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.2. Quy trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ Đầu cá ngừ Xác định thành phần hóa học Sơ chế Protamex Thủy phân Alcalase Xác định hiệu suất Protein Lipid Tro Bromelain Xác định TP axit béo Lọc Xương Dịch thủy phân Nước Papain Ly tâm Lipid Dịch protein hoà tan Cặn protein không tan Xác định hàm lượng protein Axit béo FFA
Axit béo giàu n-3PUFFA Lipase CRL Xác định chỉ số axit Ure/ethanol
3.3.1. Nghiên cứu thành phần chất nền và lipid tổng của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam
3.3.1.1. Nghiên cứu thành phần chất nền.
08 mẫu đầu cá ngừ thuộc 08 loài cá ngừ (đã bỏ mang, mắt) được rửa sạch, chặt nhỏ và xay nhuyễn thành hỗn hợp đồng nhất. Sau đó phân tích hàm lượng nước, tro, protein tổng, lipid tổng.
3.3.1.2. Nghiên cứu khảo sát thành phần axit béo
Thành phần axit béo của các mẫu lipid được xác định bằng GC-MS. Hệ số đánh giá = % lipid tổng * % n-3 PUFA
3.3.2. Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T. albarcares
3.3.2.1. Mối tương quan giữa mức độ thủy phân và hiệu suất chiết xuất lipid
Mỗi mẫu thí nghiệm 100 g đầu cá ngừ đã xay nhỏ, bổ sung thêm nước, đánh tan để đồng nhất mẫu. Quá trình thủy phân được thực hiện trong cốc có mỏ. Nâng nhiệt độ lên 80-90oC trong 15 phút để diệt vi sinh vật. Sau đó, hạ nhiệt độ về nhiệt độ thủy phân thì bổ sung enzyme. Các enzyme được sử dụng để đánh giá mức độ thủy phân đầu cá ngừ bao gồm 02 enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật (Protamex và Alcalase) và 02 enzyme có nguồn gốc từ thực vật (Bromelain và Papain). Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và chiết xuất lipid được khảo sát sơ bộ và chỉ ra ở Bảng 3.2
Bảng 3.2. Một số thông số của quá trình thủy phân bởi enzyme protease
Thông số Protamex Alcalase Bromelain Papain
Tỷ lệ NL/nước 1:1-1:5 1:2 1:1-1:5 1:2 1:1-1:5 1:2 1:1-1:5 1:2 pH 4-7 (6.5) 5-9 (8.0) 4-7 (5.0) 4-7 (5.0) Nhiệt độ (30-60) 45oC (30-60) 50oC (30-60) 50oC (30-60) 50oC Tốc độ khuấy 200 rpm 200 rpm 200 rpm 200 rpm Tỷ lệ E/S 0.5-1.5% (0.5) 0.5-1.5% (0.5) 0.5-1.5% (1%) 0.5-1.5% (1%)
Sau quá trình thủy phân, enzyme được bất hoạt bằng cách nâng nhiệt độ lên 85-90oC trong 15 phút trong bể ổn nhiệt. Sau đó, hỗn hợp được lọc qua rây để tách riêng phần xương và dịch lọc. Phần dịch lọc được đem ly tâm lạnh 4oC ở tốc độ 10. 000 vòng/phút trong 30 phút. Sau khi ly tâm thu được 3 phần: phần dầu, phần protein