Một số thành phần lignocellulose của một vài nguyên liệu thực vật được Kumar, 2009 khảo sát [110] và chỉ ra trong Bảng 1.1:
Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong một số loại sinh khối
Nguyên liệu lignocellulose
Hàm lượng (%)
Cellulose Hemicellulose Lignin
Gỗ cứng 40-55 24-40 18-25
Gỗ mềm 45-50 25-35 25-35
Cỏ 25-40 35-50 10-30
Rơm lúa mì 30 50 15
Lá 15-20 80-85 0
Bảng 1.1 cho thấy, thành phần lignocellulose ở các cây thân gỗ gồm khoảng 40- 45% (trọng lượng khô) cellulose, 24-40% hemicellulose (ít pectin hơn vì các khoảng trống giữa các sợi cellulose nhỏ) và lignin (chiếm tới 18-25% trọng lượng khô). Vì vậy, cấu trúc tế bào ở gỗ cứng bền vững hơn rất nhiều so với lá không có hoặc rất ít lignin. Do sự phức tạp của cấu trúc thực vật nên sự phân giải của lignocellulose là một quá trình đa enzyme liên quan đến sự biến đổi thủy phân và oxy hóa.
1.2.1.1. Quá trình oxy hóa loại lignin
Lignin là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thấm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật. Lignin là sản phẩm ngưng tụ của 3 thành phần chủ yếu gồm trans--coumaryl, trans-coniferyl, và trans- sinapyl alcohol theo tỷ lệ khác nhau [39].
Hình 1.4a. Các đơn vị cơ bản của lignin [39]
lưới polymer - lignin.
Hình 1.4b. Cấu trúc của lignin [39]
Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhưng không nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên kết. Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và 4-O-methylglucuronic acid là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua 4-O-methyl-D-glucuronic acid), hay glycoside (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin) [63].
Các ligninase là các enzyme phân hủy lignin. Ba enzyme quan trọng được công nhận rộng rãi có khả năng oxy hóa lignin là LiP (lignin peroxidase), MnP (mangan peroxidase) và Laccase (polyphenol oxidase) [55]. Nấm đảm Basidiomycetes (nấm mục trắng -white rot fungy) và nấm mục nâu là nhóm sản sinh hiệu quả nhất của các ligninase.
Phân hủy lignin được khởi động thông qua việc sản xuất oxy tự do gốc tự do nấm mục trắng (white rot fungy) và nấm mục nâu (brown rot fungy). Các gốc oxy được sản xuất thông qua các phản ứng Fenton và sau đó tấn công các phần lignin của vách tế bào thực vật và tạo điều kiện cho các protein enzyme khác xâm nhập cấu trúc lignocellulose [63].
Trong số 3 enzyme, laccase (EC 1.10.3.2, p- diphenol oxidase) là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Không giống như lignin peroxidase và peroxidase mangan, laccase có lợi thế hơn peroxidase trong việc sử dụng oxy như một cofactor, có khả năng xúc tác cho quá trình oxy hóa của các hợp chất hữu cơ trong sự vắng mặt của H2O2 hoặc Mn2+, cho phép laccase được áp dụng hiệu quả trong công nghiệp, bao gồm tẩy trắng trong công nghiệp giấy, loại màu của thuốc nhuộm, loại bỏ các loại thuốc diệt cỏ từ ngũ cốc cây trồng và phân hủy sinh học và bioconversion thực phẩm và chất thải nông nghiệp [95]. Chính quá trình oxy hóa mở vòng thơm của các enzyme phân giải lignin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các enzyme cellulase và hemicellulase tấn công, phân giải các bó sợi cellulose, hemicellulose vốn bị lignin che chắn [39].
1.2.1.2. Quá trình phân giải cellulose
Cellulose là polymer được cấu tạo từ các mắt xích β-D-Glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật [79].
Hình 1.5a. Công thức hóa học của cellulose [79]
Cellulase là enzyme phân hủy các phần cellulose. Cơ chế tác dụng của cellulase không hoàn toàn rõ ràng, Zhang & cs. xem xét cơ chế hóa học được chấp
nhận rộng rãi nhất là sự hiệp đồng của 3 loại enzyme chính.
Hình 1.5b. Cơ chế phân giải cellulosecủa hệ enzyme cellulase [80]
+ Enzyme nội bàoEndoglycanase hay 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): Enzyme nội bào endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận.
+ Exoglucanase: exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) mà giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose. + β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21): giải phóng phân tử D-glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác.
1.2.1.3. Quá trình phân giải hemicellulose
Khác với cellulose, hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon (gồm glucose, mannose và galactose) và đường 5 carbon (gồm xylose và arabinose) và một vài acid [110].
Ở thực vật bậc cao, thành phần cơ bản của hemicellulose là xylan liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-D-xylopyranose. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác.
Hình 1.6a. Cấu trúc polymer xylan [110]
Hemicellulase là enzyme phân hủy hemicellulose. Do tính chất biến động nhiều hơn, có nhiều enzyme hoạt động trên hemicellulose. Xylanase và mannanase là những enzyme phân giải liên kết β-1,4 trong xylan và mannan và giải phóng oligosaccharide mà có thể thủy phân tiếp thành xylose và mannose bởi β-xylosidase và β-mannosidase [39].
Hình 1.6b. Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan
Ac: nhóm acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-O-Me-GlcA: α-4-O- methylglucuronic acid
với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên.
Vi sinh vật phân giải hemicellulose: hemicellulose khác cellulose vì chứa cả đường pentose và hexose và cũng thường chứa axit uronic. Những vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thì cũng có khả năng sử dụng hemicellulose. Tuy nhiên, không phải tất cả các loài sử dụng được hemicellulose đều có khả năng thủy phân cellulose. Một số loài VSV phân giải hemicellulose là Butyrivibrio fibrisovens, Lachnospira multiparus và Bacteroides ruminicola…
Enzyme phân giải cellulose, hemicellulose là nhóm enzyme ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp (chỉ sau protease) với các chế phẩm enzyme dạng bột, dịch [14]. Novozyme là công ty sản xuất enzyme lớn với một số sản phẩm thủy phân cellulose và hemicellulose như Cellic CTec2, Cellic Ctec3, Cellic Htec2 (cellulase và xylanase), Cellulase 1.5 LFG, Novozyme 188 (β-glucosidase), Novozyme NS50013 (Cellulase), Novozyme NS5001 (β-glucosidase), Novozyme NS50012 (hỗn hợp glucosidase, xylanase). Cellic Htec2 là hỗn hợp đa enzyme bao gồm cellulase và xylanase đã được ứng dụng rất nhiều trong chuyển hóa cellulose của rơm rạ, rong biển thành bioethanol cho hiệu quả thủy phân cao, phổ cơ chất rộng [29].