Protease hay peptidase (EC.3.4.) là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất tương tự thành các axit amin tự do hoặc các peptide phân tử thấp.
H2N - CH - CO - NH - CH - CO - ... - NH - CH - COOH
H2N - CH - COOH + H2N - CH - CO.... NH - CH - COOH
Hình 1.7. Phản ứng thủy phân protein của enzyme protease
Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại. Trong trung tâm hoạt động của chúng có chứa gốc axit amin đặc hiệu. Đối với hydrolase thường chứa hai nhóm chức. Ví dụ: + Vòng imidazol của histidin + Nhóm hydroxyl (một số axit amin: serine, threonine) Sự tương tác giữa hai nhóm đặc hiệu (-OH, - imidazol) đã hình thành tâm ái nhân. Xung quanh trung tâm hoạt động của hydrolase còn chứa nhiều các axit amin, vai trò của serine có chứa nhóm - OH có tác động rất lớn làm thay đổi trung tâm hoạt động theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Do cấu trúc bậc 3 của phân tử protein-enzyme mà nhóm hydroxyl của serine và vòng imidazol của histidin gần nhau, tạo ra liên kết hydroxyl giữa gốc - OH của serine với nitơ bậc 3 của histidin. Nhờ quá trình đó mà nhóm hydroxyl xuất hiện tính chất ái nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của cơ chất.
Các enzyme protease sử dụng phân tách các liên kết peptid đã được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm từ rất lâu đời. Chủ yếu là protein thực vật và sữa. Từ những năm 1960, protease được ứng dụng để thủy phân các protein từ cá nhằm hướng tới nguồn dinh dưỡng giá rẻ. Các protein thủy phân từ cá (FPH- fish protein hydrolysate) đã được tách chiết bằng phương pháp này đã rất thành công trong sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất protein cô đặc bổ sung vào nước mắm ... [109]. Quá trình thủy phân protein gắn liền sự giải phóng lipid trong dịch thủy phân nên phương pháp ly tâm thường được sử dụng để tách lipid. Phế liệu đầu từ cá ngừ đại dương ngoài protein có giá trị (axit amin thiết yếu 30-35%) còn chứa hàm lượng lipid cao với các axit béo không no thiết yếu (EPA, DHA 18-22%) [12], [138].
R1 R2 Rx
R1
H2O
Phân loại: Protease được phân làm 2 loại, endopeptidase và exopeptidase. - Exopeptidase được phân thành 2 loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptid. + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptid để giải phóng ra một axit amin, một dipeptide hoặc tripeptid.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một axit amin hoặc một dipeptide.
- Endopeptidase gồm serinproteinase và cystein protease
+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm -OH của gốc serine trong trong tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin và elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine protease: các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protein thực vật như papain, bromelain, một vài protein động vật và kí sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspatic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
+ Metalloproteinase: là nhóm proteinase tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các VSV bậc cao, thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Có thể thu nhận protease từ rất nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật hay vi sinh vật. Tuy nhiên, enzyme thực vật và enzyme từ vi sinh vật là hai nhóm enzyme được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. Một số chế phẩm enzyme công nghiệp thường được sử dụng trong chế biến các sản phẩm giàu protein [32].
- Các chế phẩm enzyme có nguồn gốc thực vật
và đều nhận được từ mủ nhựa đu đủ Carica Papaya (L) (Caricaceae). Hàm lượng chymopapain trong nhựa đu đủ lớn hơn papain. Chế phẩm papain có hoạt tính cao trong phân giải amit và ester, có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với các enzyme khác, nhiệt độ hoạt động tới hạn là 80oC. Trong khi đó, chymopapain xúc tác thủy phân các mối liên kết peptid và ester.
+ Physin: thu được từ nhựa quả sung. Trung bình quả xanh trọng lượng từ 10- 15g có thể thu được 100-200 mg physin. Physin tương đối ổn định ở pH 6-8.
+ Bromelain: Enzyme này có nhiều trong lá và vỏ dứa, cũng thủy phân casein tốt như papain, nhưng đối với hemoglobin vận tốc tăng lên 4 lần. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là peptid. Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải protein. Trọng lượng phân tử 33.200- 33.500 Da, bromelain trích ly từ thân dứa có điểm đẳng điện pI 9.55 trong khi trích từ quả lại là protein acid có điểm đẳng điện pI 4.6.
- Các chế phẩm enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật
+ Alcalase 2.4l, Neutrase 0.5l, Esperase 7.5l, Protamex, Novozyme FM2.0L: chúng là các chế phẩm enzyme chứa chủ yếu là endopeptidase thu nhận từ vi khuẩn. Các chế phẩm này được sử dụng để cải thiện các tính chất công nghệ, dinh dưỡng và hương vị của protein.
+ Flavourzym MG, Kojizyme đây là hỗn hợp của enzyme exo- và endo peptidase thu nhận từ nấm mốc. Các chế phẩm này dùng để tăng cường thủy phân protein.
Quá trình chiết xuất lipid bằng enzyme thủy phân đạt hiệu quả liên quan đến việc lựa chọn được loại enzyme protease phù hợp nhằm đảm bảo chất lượng của bột đạm thủy phân và lipid