L ỜI CẢM ƠN
3.4.1 Đánh giá chất lượng nguyên liệu, dược liệu
3.4.1.1 Xử lý mẫu cây sau khi thu hái
Nguồn gốc
Trinh nữ: được thu hái tại địa bàn huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long.
Vông nem: được thu hái tại địa bàn huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long.
Lá Sen: được thu hái tại địa bàn Quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ.
Lạc tiên:được thu hái tại địa bàn thành phố Cần Thơ, gần sân bay Trà Nóc.
Dược liệu sau khi thu hái về được Th.S. Nguyễn Thị Kim Huê, phòng thí nghiệm Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ định danh lại để biết chính xác nguồn gốc cũng như loài và họ của từng loại dược liệu.
Sau khi tham khảo sách của PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng “Các phương
pháp tách chiết hợp chất hữu cơ” như sau: dược liệu thu hái về được lựa kỹ, loại
tạp, rửa sạch với nước (giống như rửa rau), để ráo, cắt nhỏ, làm khô tự nhiên trong mát, thoáng gió sau 5 – 7 ngày đạt độ ẩm < 13%. Thái nhỏ, phân riêng từng bộ phận
riêng biệt: thân, lá, rễ[10]. Một số có thể xay nhuyễn thành bột dùng để làm cho các thí nghiệm trong bài, một số đem đi nấu để ra cao dùng cho công việc phối trộn ra
Chương 3: Thực nghiệm
Hình 3.1: Trinh nữ và lá sen sau khi thu hái, sơ chế, làm khô và xay nhuyễn
Tất cả các loại dược liệu sau khi sơ chế, làm khô đến độ ẩm cần thiết được cất
kỹ trong túi nylon dày, buộc chặt để tránh hút ẩm, một phần xay nhuyễn để tiến
hành những thí nghiệm liên quan.
3.4.1.2 Xác định độ ẩm
Nguyên tắc: Dựa vào sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi dược liệu. Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng nước, một phần hoặc toàn bộ lượng nước kết tinh và lượng chất dễ bay hơi khác trong mẫu thử[1].
Dụng cụ hóa chất: Cốc thủy tinh, tủ sấy.
Cách tiến hành [1]: Rửa sạch 4 cốc sứ có nắp 40mm, sấy khô trong tủ sấy ở
nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi rồi đem cân (a). Cân 3g mẫu cho vào cốc đặt vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105°C trong 4 giờ, lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm đến
nhiệt độ phòng rồi đem cân. Tiếp tục sấy như trên sau 2 giờ cân một lần đến khối lượng không đổi (b). Độ ẩm của mẫu được xác định theo công thức:
3 100 3 b a P
Trong đó: P: độ ẩm của mẫu thử (%). a: khối lượng cốc sứ (g).
Chương 3: Thực nghiệm
Võ Văn Quốc 32 Thực hiện thí nghiệm 1 lần trên mỗi mẫu dược liệu trong 4 cốc , lấy kết quả
trung bình.
Hình 3.2: Xác định độ ẩm dược liệu
Kết quả: Sau mỗi lần thí nghiệm ta được một độ ẩm cho một loại dược liệu, như vậy sau 4 lần thì ta đo được độ ẩm của 4 loại dược liệu. Tất cả 4 loại dược liệu đều nhỏ hơn 13%, đã đạt yêu cầu trong Dược Điển IV Việt Nam. Cụ thể như sau:
Lạc tiên 12,8%, lá Sen 12,5%, Vông nem 12,5% và Trinh nữ 12,3%.
3.4.1.3 Xác định tro toàn phần
Theo Dược Điển IV Việt Nam về xác định tro toàn phần.
Nguyên tắc: Nung mẫu trong lò nung, lọc với nước rồi nung tới khối lượng không đổi.
Dụng cụ hóa chất: Cốc sứ, lò nung.
Cách tiến hành [1]: Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 – 105°C rồi nung trong lò nung ở 600 25°C. Sau mỗi lần nung,
lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong quá
trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc
không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Hợp dịch lọc vào tro ở trong
chén. Làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi.
Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành làm mỗi loại dược liệu 1 lần
trong 4 chén sứ cùng một lúc, sau đó lấy kết quả trung bình cho chính xác. Như vậy
phải làm 4 lần thí nghiệm cho 4 loại dược liệu.
Kết quả: Mỗi loại dược liệu đều có một giá trị tro toàn phần riêng, nhưng với
kết quả đã tiến hành xác định trên thì tất cả 4 loại dược liệu đều đạt yêu cầu của Dược Điển IV Việt Nam (Vông nem 7,7% < 8%, lá Sen 4,5% < 5%, Lạc tiên 1,8%
Chương 3: Thực nghiệm
< 2%, Trinh nữ do chưa có chuyên luận nào nói về điều này nhưng với kết quả trên có thể chấp nhận được, kết quả là 6,3%).
Hình 3.3: Cốc xác định tro toàn phần
3.4.1.4 Kết quả phân tích hoạt chất trong dược liệu
Định tính alkaloid
Theo Dược Điển IV Việt Nam định tính alkaloid như sau:
Nguyên tắc: Dựa vào kết tủa với các thuốc thử định tính alkaloid
Cách tiến hành thí nghiệm: Các thuốc thử dùng để định tính alkaloid
- Thuốc thử Bouchardat: I2 (2,5g), KI (5g), nước cất (10ml). Cho kết tủa nâu với dung dịch chứa alkaloid.
- Thuốc thử Mayer: HgCl2 (6,8g), KI (2,5g), nước cất (500ml).
Cho kết tủa vàng nâu với dung dịch chứa alkaloid.
- Thuốc thử Dragendorff:
Dung dịch A: Bi(NO3)3 (0,85g), acid acetic (10ml), nước cất (40ml).
Dung dịch B: KI (5g), nước cất (40ml).
Khi sử dụng trộn đều dung dịch A và dung dịch B. Kết quả dương tính nếu xuất
hiện tủa màu vàng cam.
- Dung dịch sắt (III) clorid 5%.
Với thí nghiệm này, tiến hành cho thuốc thử vào ống nghiệm đã có sẵn mẫu cần định tính, nếu mẫu cho kết quả như trên thí kết luận có alkaloid trong dược liệu.
Tiến hành làm từng dược liệu cho mỗi thí nghiệm, kết quả trong mỗi dược liệu đều
Chương 3: Thực nghiệm
Võ Văn Quốc 34
Quy trình định tính alkaloid
Hình 3.4: Quy trình định tính alkaloid
Thuyết minh quy trình
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón cổ nhám 100ml, thấm ẩm bằng NH3
10%, rồi cho vào bình 20ml cloroform, lắc nhẹ và đun sôi trên bếp cách thủy 2 – 3 phút. Lọc vào bình gạn qua giấy lọc đã thấm bằng cloroform, lắc 3 lần, mỗi lần 5ml
dung dịch acid hydrochloric 1%. Để yên cho dung dịch tách thành 2 lớp, gạn lấy lớp
acid. Gộp dịch chiết chia thành 4 ống nghiệm dùng để thử nghiệm với các loại
thuốc thử[1].
Kết quả: Alkaloid đều hiện diện trong dược liệu sau khi tiến hành thí nghiệm.
Định tính saponin
Định tính saponin theo quyển “Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cây
trinh nữ Mimisa Pudica L” của Nguyễn Minh Thư và “Các phương pháp tách chiết
hợp chất hữu cơ” PGS.TS Nguyễn của Kim Phi Phụng. Cuối cùng là “Bài giảng Dược liệu” của Bộ y tế Việt Nam, chúng tôi đã chọn cách làm như sau.
Nguyên tắc: Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của saponin, chúng tôi căn cứ
Chương 3: Thực nghiệm
Dược điển Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: chỉ số tạo bọt là độ pha
loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao 1cm, sau khi lắc ống nghiệm tiến hành trong điều kiện quy định.
Cách tiến hành: Đun sôi 1g bột nguyên liệu trong 100ml nước cất khoảng 30
phút. Lọc, để nguội, thêm nước cất lại cho đủ 100ml.
Sử dụng 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào ống
nghiệm lần lượt 1, 2, 3,…, 10ml nước sắc. Thêm nước cất vào cho đủ 10ml. Bịt
miệng ống nghiệm, lắc theo chiều dọc của ống nghiệm trong 15 giây, mỗi giây lắc 2
lần. Để yên 15 phút, đo chiều cao các cột bọt. Nếu cột bọt trong tất cả các ống dưới
1cm, chỉ số bọt dưới 100, tức là không có saponin.
Ví dụ: Nếu ống thứ 4 có độ bọt cao 1cm thì chỉ số bọt được tính như sau:
Chỉ số bọt 10 1 100 0, 01 4
Nếu ống số 1 và số 2 có cột bọt cao 1cm thì cần pha loãng để có chỉ số bọt
chính xác. Nếu cột bọt của tất cả các ống nghiệm đều lớn hơn 1cm thì cần phải pha
loãng hơn và làm lại thí nghiệm.
Kết quả: Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành lắc 10 ống nghiệm với mẫu đã chuẩn bị như trên, để yên và sau đó dựa trên kết luận về chỉ số tạo bọt để đưa ra
kết luận như sau: Cây Trinh nữ và lá Sen là không có sự hiện diện của saponin vì chỉ số tạo bọt rất ít, trong khi đó cây Vông nem và Lạc tiên đều có saponin.
Định tính flavonoid
Sau khi tham khảo từ “Dược Điển IV Việt Nam” về cách định tính flavonoid.
Nguyên tắc: Flavonoid cho tủa vàng đậm đến vàng cam với thuốc thử H2SO4
đậm đặc, cho tủa vàng đến cam với thuốc thử 1% NaOH/Ethanol.
Cách tiến hành: Có 2 cách như sau:
- Tác dụng với H2SO4 đặc
Hòa tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đặc. Flavon và flavonol cho màu vàng
đậm đến màu cam và phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
- Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/Ethanol
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid/hòa tan trong ethanol, sẽ
Chương 3: Thực nghiệm
Võ Văn Quốc 36 chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol màu từ vàng đến cam. Auron
cho màu từ đỏ đến đỏ tím.
Nhưng trong thí nghiệm định tính flavonoid chúng tôi chỉ tiến hành một thí
nghiệm là cho H2SO4 đậm đặc, sau khi cho H2SO4 đậm đặc vào thì có chuyển màu rõ rệt từ vàng đậm đến vàng cam. Sau quá trình thí nghiệm chỉ có cây Lạc tiên là không có flavonoid, còn Vông nem, lá Sen và Trinh nữ đều có flavonoid. Chúng tôi
cũng đã tiến hành thử Lạc tiên với thuốc thử còn lại nhưng vẫn không có sự hiện
diện flavonoid.
3.4.1.5 Định lượng alkaloid trong dược liệu
Với từng loại dược liệu đều có nguyên tắc chiết và kỹ thuật chiết khác nhau, trên cơ sở chiết với cloroform sau đó cho bốc hơi rồi cân.
Mỗi một dược liệu sẽ có một cách định lượng riêng, cụ thể như sau:
Cây trinh nữ
Sau khi tham khảo sách “Bài giảng Dược liệu” và “Luận văn Thạc Sĩ của
Nguyễn Minh Thư”, cuối cùng chúng tôi đã tìm ra cách để định lượng alkaloid trong
cây trinh nữ vì cây trinh nữ chưa nằm trong Dược Điển của Việt Nam nên phương pháp định lượng của nó cũng rất khó.
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 10g bột dược liệu cho vào bình nón 250ml, thêm 100ml ethanol
90°, đun hồi lưu cách thủy trong 30 phút. Lọc qua bông. Làm lại như trên vài lần cho đến khi kiệt alkaloid[1]. Gộp toàn bộ dịch chiết, bốc hơi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn với dung dịch acid hydrochloric 1% (3 lần, mỗi lần 10ml). Lọc dịch acid
này vào bình gạn, rửa bông với một ít dung dịch acid hydrochloric 1%. Kiềm hóa
dịch acid này bằng ammoniac đặc đến pH = 10. Sau đó, chiết lại bằng cloroform 5
lần, mỗi lần 10ml. Gộp toàn bộ dịch chiết cloroform, làm khan bằng natri sulfat
khan, lọc vào chén cân khô đã cân bì trước. Bay hơi đến cắn, sấy ở 100°C đến khối lượng không đổi và đem cân.
Chương 3: Thực nghiệm
Quy trình
Hình 3.5: Sơ đồ định lượng alkaloid trong cây Trinh nữ
Kết quả: Sau khi tiến hành định lượng alkaloid trong cây Trinh nữ được 0,12% hàm lượng alkaloid toàn phần. Do cây trinh nữ chưa có tiêu chuẩn dược liệu
chung nên khó biết được hàm lượng alkaloid như thế có đạt yêu cầu không.
Vông nem (lá)
Cây vông nem đã có quy trình định lượng alkaloid trong “Dược Điển Việt
Nam” cũng như “Bài giảng dược liệu” của Phạm Thanh Kỳ nên chúng tôi đã dựa theo đó mà tiến hành định lượng alkaloid.
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 10g bột dược liệu cho vào bình nón 250ml, thêm 100ml ethanol
90°, đun hồi lưu cách thủy trong 30 phút. Lọc qua bông. Làm lại như trên vài lần cho đến khi kiệt alkaloid[1]. Gộp toàn bộ dịch chiết, bốc hơi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn với dung dịch acid sulfuric 2% (3 lần, mỗi lần 10ml). Lọc dịch acid này vào bình gạn, rửa bông với một ít dung dịch acid sulfuric 2%. Kiềm hóa dịch acid này
Chương 3: Thực nghiệm
Võ Văn Quốc 38 bằng ammoniac đặc đến pH = 10. Sau đó, chiết lại bằng cloroform 5 lần, mỗi lần
10ml. Gộp toàn bộ dịch chiết cloroform, làm khan bằng natri sulfat khan, lọc vào
chén cân khô đã cân bì trước. Bay hơi đến cắn, sấy ở 100°C đến khối lượng không đổi và đem cân.
Quy trình
Hình 3.6: Sơ đồ định lượng alkaloid trong lá Vông nem
Kết quả: Trong tài liệu tham khảo thì hàm lượng alkaloid toàn phần khoảng 0,15%, nhưng kết quả sau khi định lượng là 0,165% alkaloid toàn phần.
Chương 3: Thực nghiệm
Lá Sen
Cây sen là một trong những cây có công dụng an thần rất tốt, nên có nhiều
nghiên cứu về nó.
Thuyết minh quy trình[1], [8], [9]
Cân chính xác khoảng 2g bột dược liệu đã sấy khô, thấm ẩm bằng amoniac
đậm đặc (TT), để 1 giờ, sau đó cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet, chiết bằng ethanol 96% (TT) cho đến kiệt alkaloid. Cất thu hồi dung môi, hòa tan cắn trong dung dịch acid hydrocloric 5% (TT) 5 lần, mỗi lần 5ml. Lọc, rửa dịch lọc
acid bằng ether dầu hỏa (TT) 3 lần, mỗi lần 10ml. Kiềm hóa dịch chiết acid bằng
amoniac đậm đặc (TT) đến pH = 10, sau đó lắc với cloroform (TT) 5 lần, mỗi lần 10
ml. Gộp dịch chiết cloroform, rửa dịch cloroform bằng nước cất đến pH trung tính,
rồi bốc hơi dung môi tới khô. Hòa tan cắn với một lượng chính xác 10 ml acid
hydrocloric 0,1N (CĐ). Thêm 5ml nước cất và 2 giọt methyl đỏ (TT). Chuẩn độ
dung dịch acid hydrocloric 0,1N (CĐ) thừa bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ).
Hàm lượng alkaloid toàn phần (X) trong lá Sen tính bằng phần trăm theo công
thức: a 2,95 n) - (10 X%
n: Số ml dung dịch natri hydroxyd 0,1N (CĐ) đã dùng. a: Khối lượng bột dược liệu đem định lượng đã trừ độ ẩm.
Dược liệu phải chứa ít nhất 0,80% alkaloid toàn phần tính theo nuciferin
(C19H21O2N).
Kết quả: Đúng như kết quả trong Dược Điển IV Việt Nam, 0,810% là kết quả sau khi định lượng alkaloid toàn phần trong lá Sen.
Chương 3: Thực nghiệm
Võ Văn Quốc 40
Quy trình
Hình 3.7: Sơ đồ định lượng alkaloid trong lá Sen
Lạc tiên
Lạc tiên vẫn chưa có nghiên cứu nào về định lượng cả, sau khi tham khảo
nhiều sách, tài liệu. Cuối cùng chúng tôi tìm ra được một quy trình có thể định lượng.
Thuyết minh quy trình[1], [8], [9]
Cân chính xác 15g bột dược liệu khô kiệt, cho vào bình nón 250ml có nút mài, thẩm ẩm đều bằng amoniac đặc (5ml). Thêm vào 150ml cloroform. Lắc mạnh để
yên qua đêm. Lọc, lấy 100ml dịch lọc tương ứng với 10g bột dược liệu, chiết 4 lần,
mỗi lần 10ml H2SO4 10%. Gộp chung các dung dịch acid , kiềm hóa bằng amoniac đặc trong điều kiện lạnh đến pH = 10. Chiết alkaloid bằng cloroform 4 lần, (3 lần đầu tiên mỗi lần 15ml, lần thứ 4 bằng 10ml). Loại nước trong dung dịch cloroform
Chương 3: Thực nghiệm
bằng Na2SO4 khan. Cho dịch chiết vào một bình đã cân bì. Bốc hơi dung môi cho đến khô. Cho vào bình hút ẩm với silicagel đến khối lượng không đổi, sau đó cân.
Theo Dược điển Việt Nam IV quy định dược liệu là lá phải chứa ít nhất 0,7%
alkaloid toàn phần.
Quy trình
Hình 3.8: Sơ đồ định lượng alkaloid trong cây Lạc tiên
Kết quả: Định lượng Lạc tiên là 0,725% alkaloid toàn phần.
3.4.1.6 Kết quả phân tích hàm lượng chì trong dược liệu
Kim loại nặng trong dược liệu có rất nhiều theo chuyên luận trong Dược điển, nhưng ở đây chúng tôi chỉ có thể kiểm tra, đánh giá được hàm lượng chì trong cao
dược liệu. Xác định kim loại nặng cũng coi như là phần khó trong phần luận văn
này, sách báo nói rất nhiều nhưng phương pháp thì rất còn hạn chế để làm điều này.
Chúng tôi đã dựa theo Dược Điển Việt Nam, thuốc thử thì dùng theo Dược Điển