4. Thời gian thực hiện
3.4. Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thành thục hóa tiền phô
và môi trường duy trì tăng sinh khối ở một số loài trong đó có Aloe barbadensis
Mill, Fritillaria meleagris L. (Marija và cs, 2011). Cảm ứng tạo tiền phôi vô tính
Anacardium occidentale trên môi trường MS bổ sung 13,3 μM benzyladenine (BA), 271,5 μM adeninesulphate và 2,7 μM NAA (Martin, 2003).
3.4. Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thành thục hóa tiền phôi phôi
ABA thường được sử dụng trong các thí nghiệm tạo phôi vô tính ở thực vật. Sự tổng hợp và tích luỹ các chất dự trữ và các protein có nhiều trong giai đoạn phôi muộn (Late embrogensis abundant – LEA) của phôi vô tính và hữu tính thường được điều hoà thông qua ABA và sự biểu hiện của các gen cảm ứng stress nước. Trong giai đoạn phát triển sớm của phôi soma cây hạt trần cần nồng độ cao của ABA bên ngoài để chuyển sang giai đoạn phát triển sau (Lelu và cs, 2008). Attree và Fowke (1993) cho việc bổ sung ABA từ 1-100 µM vào môi trường nuôi cấy tạo phôi soma là cần thiết cho việc thành thục hóa phôi trong hầu hết các loài thực vật có quả hình nón. Nhưng ngược lại, tế bào cũng phải đạt được một giai đoạn phát triển nhất định thì mới có phản ứng được với ABA và chuyển sang giai đoạn thành thục.
Trong nghiên cứu này ABA được thêm vào môi trường LVM dùng cho thành thục hoá tiền phôi, bổ sung ABA với các nồng độ khác nhau như bảng 2.4. Kết quả thu được ở các dòng khảo sát như sau
Dòng số 2
Bảng 3.16. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng của các nồng độ ABA (các chữ cái a, b, c, d là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ ABA (µM) Số phôi soma trung bình/ đĩa cấy 0 0,33 ± 0,33 a 20 0,33 ± 0,33 a 40 3,00 ± 1,00 ab 60 4,67 ± 1,20 b 80 18,33 ± 0,88 d 100 14,33 ± 0,88 c Dòng số 6
Bảng 3.17. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 6 dưới ảnh hưởng của các nồng độ ABA (các chữ cái a, b, c là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ ABA (µM) Số phôi soma trung bình/ đĩa cấy 0 0,00 ± 0,00 a 20 0,00 ± 0,00 a 40 1,33 ± 0,33 a 60 3,67 ± 0,67 b 80 7,33 ± 1,20 c 100 6,00 ± 0,58 c Dòng số 29
Bảng 3.18. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 29 dưới ảnh hưởng của các nồng độ ABA (các chữ cái a, b, c là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ ABA (µM) Số phôi soma trung bình/đĩa cấy 0 0,00 ± 0,00 a 20 0,00 ± 0,00 a 40 1,00 ± 0,58 a 60 3,33 ± 0,67 b 80 6,67 ± 0,67 c 100 6,67 ± 0,88 c
Qua kết qua thu được trong các bảng 3.16, 3.17 và 3.18 cho thấy khi nồng độ ABA trong môi trường nuôi cấy không quá 20 µM thì không có sự tạo phôi hoặc rất ít ở các dòng khảo sát. Tăng dần nồng độ ABA từ 40 – 100 µM thì số phôi tạo thành tăng theo ở mỗi dòng. Nồng độ ABA từ 80 – 100 µM cho hiệu quả tạo phôi tốt ở các dòng. Sự khác biệt trong hiệu quả tạo phôi với các nghiệm thức còn lại là có ý nghĩa vve62 mặt thống kê ( phụ lục 17, 18, 19). Trong đó, ở nồng độ 80 µM là phù hợp nhất để tạo phôi, các dòng đều có phản ứng tạo phôi tốt ở nồng độ này ( các dòng 2; 6 và 29 lần lượt là 18,33; 7,33 và 6,67 ). ABA kích thích sự phát triển bình thường của phôi soma trong điều kiện in vitrobằng kích thích lưu trữ những cơ chất cần thiết cho việc nảy mầm tiếp theo. Ngoài ra, ABA còn có vai trò trong điều chỉnh áp suất thẩm thấu của màng tế bào và thể hiện của protein dự trữ trong quá trình phát triển phôi soma.
Trong nghiên cứu trưởng thành phôi soma ở thông lai rụng lá (Larix x
leptoeuropaea), nồng độ ABA 60 µM giúp phôi phát triển bình thường (M. Gutmann và cs,1996). Còn ở cây vân sam đỏ (Picea rubens Sarg.) sử dụng môi trường cơ bản bổ sung 20 – 50 µM ABA cho hiệu quả tốt (Harry và A. Thorpe, 1991). Lelu và cs (1999) lại cho rằng phải bổ sung từ 60-120µM ABA là cần thiết cho tạo phôi thành thục trên các loài quả nón. Nhiều nghiên cứu đã cho rằng, chỉ 6 giờ sau khi bổ sung, ABA đã ghi nhận một số thay đổi trong thể hiện gene và tổng
hợp protein, đặc biệt là LEA protein (Dunstan và cs, 1998). Phản ứng tạo phôi thành thục khác nhau giữa các loài bị chi phối bởi kiểu gen.