4. Thời gian thực hiện
2.3.1.Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi
2.3.1.1 Chuẩn bị môi trường và sinh khối tiền phôi
Môi trường duy trì dùng cho tăng sinh khối tế bào tiền phôi: - LVM gốc (đa lượng, vi lượng, vitamin)
- Myo – inosytol : 1g/l.
- 1 g/l cas amino axit (Difco – Mỹ). - 20 g/l sucrose (Duchefa – Hà Lan).
- 2,2 ml/l 2,4 - D từ dung dịch gốc (1,0 mg/ml) (Merck – Mỹ). - 2,2 ml/l BA từ dung dịch gốc (0,5 mg/ml)
Điều chỉnh pH = 5,7 bằng NaOH 1N và HCl 0,5N. Hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp vô trùng, lấy môi trường ra, khi nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 550
C, thêm 20 ml/l L- glutamine (đã được lọc vô trùng, lấy từ dung dịch gốc 25 mg/ml) (Sigma – Mỹ). Trường hợp cần môi trường bán rắn: bổ sung 4 g/l phytagel (Mỹ) rồi hấp vô trùng và sau đó cũng thêm L- glutamin như trên, rồi đổ môi trường vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri chứa khoảng 30ml môi trường.
Môi trường LVM lỏng dùng trong các thí nghiệm tăng sinh khối tế bào tiền phôi có thành phần tương tự môi trường bán rắn nhưng không cần bổ sung phytagel, L- glutamine. Sau khi điều chỉnh pH= 5,7 cũng hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội dùng dần trong các thí nghiệm.
Tế bào tiền phôi do Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam bộ cung cấp được cấy chuyền để tăng sinh khối bằng môi trường LVM duy trì. Khi được lượng sinh khối nhất định, cấy chuyền sang đĩa môi trường mới chuẩn bị cho các thí nghiệm sau. Tiền phôi dùng trong các thí nghiệm sau 7 - 10 ngày cấy chuyền.
2.3.1.2. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả L- glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi
Lấy từng cụm tiền phôi đưa vào môi trường LVM lỏng, lắc nhẹ cho các cụm tế bào tách rời nhau ra. Dùng pipet hút các tế bào tiền phôi đổ qua phễu lọc Buchner thu lại tế bào trên giấy lọc đã được hấp vô trùng. Chuyển giấy lọc sang đĩa petri chứa môi trường LVM dùng cho tăng sinh khối bổ sung L- glutamine đã được lọc vô trùng ở các nồng độ: 0; 100; 300; 500 và 700 mg/l; với các nghiệm thức tương ứng là 1,2,3,4,5.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả L- glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi.
Nghiệm thức Nồng độ L- glutamine (mg/l) 1 0 2 100 3 300 4 500 5 700
Chỉ tiêu theo dõi: sự gia tăng khối lượng tế bào tiền phôi theo thời gian 1 tuần, 2 tuần sau khi cấy.
Cách theo dõi : sau khi cấy vào các đĩa petri đặt các đĩa vào trong phòng nuôi. Theo dõi sự tăng khối lượng tế bào bằng cách cân. Sau một tuần cân lần 1, hai tuần sau khi cấy cân lần 2. Việc cân tiến hành trong tủ cấy vô trùng bằng cân điện tử nhỏ. Ghi nhận kết quả trong mỗi lần cân : cân khối lượng đĩa có giấy lọc chứa tế bào tiền phôi bên trên và khối lượng đĩa đã lấy giấy lọc và tế bào tiền phôi ra. Hiệu số hai giá trị này dùng tính toán khối lượng tế bào tiền phôi tăng thêm.
2.3.1.3. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu hiệu quả NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi
Lấy từng cụm tiền phôi đưa vào môi trường LVM lỏng, lắc nhẹ cho các cụm tế bào bị tách rời. Dùng micropipet hút các tế bào tiền phôi đổ qua phễu lọc Buchner thu tế bào lại trên giấy lọc đã được hấp vô trùng. Chuyển giấy lọc có chứa các tế bào sang đĩa petri chứa môi trường LVM dùng cho tăng sinh có bổ sung BA và NAA ở các nồng độ trong các nghiệm thức theo bảng 2.2 dưới đây
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi.
Theo dõi sự tăng sinh khối tế bào ở mỗi đĩa sau thời gian 1tuần, 2 tuần bằng cách cân.
Cách theo dõi sự tăng khối lượng tế bào giống như ở thí nghiệm 1 ở trên.