4. Thời gian thực hiện
3.1.Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả của L glutamine đến tăng sinh khối tế
bào tiền phôi
Tiến hành khảo sát với mẫu tế bào tiền phôi của 6 dòng thông nhựa. Môi trường sử dụng trong nuôi cấy là môi trường LVM cơ bản có bổ sung các chất hữu cơ và hormon tăng trưởng thực vật. L- glutamine được thêm vào môi trường theo các nồng độ 0, 100, 300, 500 và 700 mg/l. Theo dõi tăng sinh khối tế bào sau 1 tuần, 2 tuần. Kết quả thu được ở mỗi dòng như sau:
Dòng 6
Bảng 3.1. Sinh khối tăng trung bình của dòng 6 khi khảo sát hiệu quả của L- glutamine (các chữ a, b, c là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở 95%).
Nồng độ L- glutamine (mg/l)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 1 tuần nuôi cấy (mg)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 2 tuần nuôi cấy (mg) 0 237,78 ± 6,620 a 220,00 ± 8,50 a 100 257,78 ± 7,027a 263,33 ± 7,27 b 300 262,22 ± 9,829a 266.67± 12,13 b 500 311,11± 10,599 b 324,44 ± 11.44 c 700 292,22 ± 9,969 b 304.44 ± 11,80 c Dòng 31
Bảng 3.2. Sinh khối tăng trung bình của dòng 31 khi khảo sát hiệu quả của L- glutamine (các chữ a,b,c và d là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ L- glutamine (mg/l)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 1 tuần nuôi cấy (mg)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 2 tuần nuôi cấy (mg)
100 312,22 ± 4,648b 327,78 ± 9,25 ab 300 337,78 ± 3,643 c 344,44 ± 5,03b 500 376,67 ± 4,714 d 436,67 ± 5,53 c
700 315,56 ± 7,837 b 327,78 ± 7,22 ab
Dòng 44
Bảng 3.3. Sinh khối tăng trung bình của dòng 44 khi khảo sát hiệu quả của L- glutamine (các chữ a, b, c là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ L- glutamine (mg/l)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 1 tuần nuôi cấy (mg)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 2 tuần nuôi cấy (mg) 0 153,33 ± 7,817 a 158,89 ± 8,41 b 100 161,11 ± 5,879a 141,11 ± 8,73ab 300 162,22 ± 4,006a 133,33 ± 6,46 a 500 204,44 ± 6,035b 193,33 ± 7,82 c 700 152,22 ± 4,339 a 135,56 ± 3,77 a Dòng 54
Bảng 3.4. Sinh khối tăng trung bình của dòng 54 khi khảo sát hiệu quả của L- glutamine (các chữ a, b, c và d là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ L- glutamine (mg/l)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 1 tuần nuôi cấy (mg)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 2 tuần nuôi cấy (mg) 0 284,44 ± 5.556 a 307,78 ± 7,60 a 100 366,67 ± 6,667 b 464,44 ± 8,68 b 300 456,67 ± 6,009 d 672,22 ± 10,38 c 500 454,44 ± 4,120 d 672,22 ± 7,03 c 700 358,56 ± 6,894 c 790,00 ± 9,13 d
Dòng 2
Bảng 3.5. Sinh khối tăng trung bình của dòng 2 khi khảo sát hiệu quả của L- glutamine (các chữ a, b, c là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ L- glutamine (mg/l)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 1 tuần nuôi cấy (mg)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 2 tuần nuôi cấy (mg) 0 298,89 ± 3,514 a 303,33 ±3,73 ab 100 300,00 ± 14,240 a 283,33 ± 14,63 a 300 306,67 ± 5,774 a 288,89 ± 4,84 a 500 371,11 ± 7,718 b 344,44 ± 8,52 c 700 311,11 ± 6,961 a 316,67 ± 6,24 b Dòng 29
Bảng 3.6. Sinh khối tăng trung bình của dòng 29 khi khảo sát hiệu quả của L- glutamine (các chữ a, b, c là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Nồng độ L- glutamine (mg/l)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 1 tuần nuôi cấy (mg)
Khối lượng tiền phôi tăng trung bình sau 2 tuần nuôi cấy (mg) 0 224,44 ± 6,035 a 211,11 ± 6,76 a 100 257,78 ± 3,239 b 238,89 ± 6,11 b 300 261,11 ± 10,199 bc 250,00 ± 11,55 b 500 281,11 ± 7,349 c 288,89 ± 7,35 c 700 262,22 ± 5,472 bc 243,33 ± 6,46 b
L- glutamine được sử dụng khá phổ biến làm nguồn cung cấp nitơ hữu cơ cho các thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật. Nguồn nitơ hữu cơ này ở dạng khử nên tế bào dễ sử dụng, ít tiêu hao năng lượng.
Qua số liệu trong các bảng kết quả (bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6) cho thấy khi có bổ sung vào môi trường nuôi cấy một lượng L- glutamine nhất định thì đạt hiệu quả tăng sinh khối cao hơn là không bổ sung. Nhìn chung ở các dòng thì nồng độ L- glutamine từ 300 – 700 mg/l đều giúp sinh khối tế bào tăng, nhưng ở đa số dòng hiệu quả tốt nhất là ở nồng độ 500 mg/l. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức 500 mg/l L- glutamine và các nghiệm thức khác là có ý nghĩa về mặt thống kê (Phụ lục 2, 3, 4, 5, 6 và 7) . Trong đó, ở 2 dòng 6 và 54 thì chỉ cần nổng độ L- glutamin 300 mg/l đã có đáp ứng tăng sinh khối tốt. Một tuần sau nuôi cấy sinh khối tế bào tăng mạnh, các tế bào có màu trắng bạc, khô ráo và xốp. Sang tuần thứ 2 thì ở một vài dòng còn tăng nhưng phần đông có xu hướng giảm so với tuần đầu, bắt đầu xuất hiện nhiều tế bào màu trắng đục hoặc ngả sang vàng nhạt và dính vào nhau. L- glutamine có vai trò trong tổng hợp các acid amin và những phân tử khác trong tế bào nên không cung cấp đủ L- glutamine sẽ làm cho tế bào tiền phôi giảm sức sống và không có khả năng tạo phôi.
Khi thí nghiệm với Pinus strobus, Klimaszewska et al (2000) đã ghi nhận có thể thu được 5-6 g tế bào tiền phôi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường LVM từ 300 mg vật liệu ban đầu. Các tế bào tiền phôi tăng sinh tốt trong môi trường có bổ sung L- glutamine có thể là do nguồn nitơ hữu cơ mà L- glutamine cung cấp dễ đồng hóa hơn các nguồn nitơ vô cơ khác.
Hầu hết các môi trường dùng trong nuôi cấy tạo phát sinh phôi đều có bổ sung L- glutamine hay L- glutamine kết hợp với casein hydrolysate làm nguồn cung cấp nitơ hữu cơ cho tế bào. Người ta ghi nhận rằng khi L- glutamine được bổ sung vào môi trường DCR có chứa các chất điều hòa sinh trưởng (auxin và cytokinin) thì việc tạo phát sinh phôi soma tốt hơn và nhanh hơn (Salajovi và cs, 1992); (Laine và David 1990).
Trong thí nghiệm tạo phôi vô tính ở cây Vân sam đen (Picea mariana
(Mill.), L- glutamine được sử dụng với nồng độ 2-3 g/l làm nguồn cung cấp nitơ hữu cơ duy nhất. Điều này làm tăng gấp đôi số phôi thu được so với sử dụng nguồn nitơ vô cơ (Slaheddine Khlifi, 1994). Nồng độ L- glutamine cao trong môi trường
nuôi cấy (2,4 g/l) cũng giúp duy trì khả năng sinh phôi của tế bào ở loài
Cryptomeria japonica ( A. Thorpe, 2001).
Hình 3.1. Tế bào tiền phôi 1 tuần sau cấy ( với các nồng độ L – glutamine lần lượt là 0, 10, 300, 500 và 700 mg/l) – dòng 6
(1) : 0 gl/l; (2) 100 mg/l; (3) 300 mg/l; (4) : 500 mg/l; (5) 700mg /l
1 2
3 4