Tạo phôi vô tín hở chi Thông

4. Thời gian thực hiện

1.3.2. Tạo phôi vô tín hở chi Thông

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa tìm thấy nghiên cứu nào về loài thông nhựa Pinus merkusii jungh et de Vries được công bố. Tuy nhiên trong cùng chi đã có nhiều nhóm tác giả đóng góp nhiều công trình nghiên cứu về phát sinh phôi vô tính.

Nhân giống bằng phương pháp tạo phôi vô tính được báo cáo ở một số loài:

Pinus caribaea (Lainé and David, 1990), Pinus elliottii (Jain và cộng sự, 1989),

Pinus lambertiana (Gupta and Durzan, 1986), Pinus nigra (Salajova và cộng sự, 1995; Radojevic và cộng sự, 1999), Pinus palustris (Nagmani và cộng sự, 1993),

Pinus patula (Jones and van Staden 1995; Ford và cộng sự, 2000), Pinus pinaster,

Pinus radiata (Chandler andYoung, 1995), Pinus strobus L. (Finer và cộng sự, 1989), Pinus sylvestris (Keinonen-Mettälä và cộng sự, 1996), Pinus taeda (Becwar và cộng sự, 1990), Pinus koraiensis (Bozhkov và cộng sự, 1997), P. monticola

(Percy và cộng sự, 2000), P. kesiya (Malabadi và cộng sự, 2002), Pinus brutia (Yildirim và cộng sự, 2006), Pinus pinea L. (Carneros và cộng sự, 2009), Pinus caribaea(Malabadi và cộng sự, 2011).

Năm 1989, Jain và cộng sự đã hoàn thành nghiên cứu về: “Phát sinh phôi soma cây Pinus elliottii từ những phôi chưa trưởng thành được nuôi cấy in vitro”. Sự phát triển của mô phôi đã được bắt đầu bằng việc nuôi cấy phôi non của bốn kiểu gen khác nhau của cây Pinus elliottii trên một số môi trường nuôi cấy có bổ sung auxin và cytokinin. Sự cảm ứng mô sẹo bắt đầu sau 1 - 2 tuần, mà nguồn gốc từ các tế bào cuống noãn của phôi non hoặc từ lá mầm của phôi non. Khi mô sẹo bắt đầu sinh sôi, ba loại mô sẹo được phân biệt: white mucilaginous, loose globular, và light green-loose. Khi nhuộm bằng acetocarmine, những mô sẹo có màu trắng nhầy sẽ trở thành phôi. Những cấu trúc hình cầu và không chặt hay sáng xanh tiếp tục giữ lại bản chất của chúng ngay cả sau một số nuôi cấy tiếp theo. Nguồn gốc của tiền phôi vô tính cây thông Pinus elliottii là từ các tế bào đơn lẻ của mô sẹo phát sinh từ tế bào cuống noãn. Giai đoạn phát triển của phôi non hợp tử, kiểu gen và môi

trường nuôi cấy là những yếu tố quan trọng cho việc tái sinh các mô phôi. Tiền phôi vô tính đang được nuôi cấy để phát triển hơn nữa.

Năm 1993, Kaul và Hoffman nghiên cứu sự ức chế ion amoni đối với sự phát triển mô sẹo ở Pinus strobus L.. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nuôi cấy mô sẹo có nguồn gốc từ trụ dưới lá mầm Pinus strobus trong môi trường MS được bổ sung 0,2 mg/l acid α-naphtalenacetic (NAA), nguồn nitơ từ NH4Cl thì sự phát triển của mô sẹo bị ức chế, điều này do mô sẹo không có khả năng sử dụng ion +

NH như là nguồn nitơ. Kết quả cây tích lũy độc tố ion +

NH trong mô.

Năm 2003, Pullman và cộng sự hoàn thành nghiên cứu: “Phát sinh phôi soma cây thông Pinus teada L.: Những cải tiến sự trưởng thành phôi bằng cách phân tích kim loại trong phôi hợp tử và phôi soma”. Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng khi môi trường có Bo, Calci, Kali giảm và sắt tăng lên thì cải tiến đáng kể số lượng phôi mầm nhưng không thuận lợi cho giai đoạn trưởng thành và khả năng nảy mầm. Môi trường ít Calci và Bo không chỉ nhiều phôi soma tăng trưởng hơn mà còn tái sinh phôi có biểu hiện gen tương tự như phôi hợp tử.

Năm 2005, Malabadi và Staden nghiên cứu cảm ứng, duy trì và trưởng thành phôi vô tính từ chóp rễ Pinus patula 15 năm tuổi. Kết quả cho thấy, phần trăm tạo phôi cao nhất là 43% (genotype PP13): 1g sinh khối mô sẹo cho 36 phôi vô tính (trong đó 32 phôi nảy mầm, 29 phôi tạo cây con). Cùng năm, Maruyama và cộng sự, tạo phôi vô tính Pinus thunbergi từ thể giao tử của phôi hữu tính chưa trưởng thành. Mô phôi được duy trì trên môi trường chứa 2,4 – D và BA, môi trường trưởng thành chứa ABA, than hoạt tính, maltose và PEG. Sau 8 tuần, thu được khoảng 900 phôi trưởng thành, 60% nảy mầm và 85% trong đó tạo thành cây con.

Năm 2006, Yildirim và cộng sự sử dụng phôi hữu tính chưa trưởng thành ở giai đoạn tiền lá mầm đưa lên môi trường DCR chứa 13,6 µM 2,4 – D; 2,2 µM BAP để cảm ứng và duy trì mô phôi. Tỷ lệ phôi cảm ứng thành công là 11,6%. Môi trường DCR bổ sung 80 µM ABA, sucrose (3%), maltose (3% và 6%) kết hợp với 3,75% PEG, 1% gellan gum thích hợp nhất để trưởng thành phôi vô tính Pinus burita TEN.

Năm 2007, Kim và Moon tạo được sinh khối các tế bào tiền phôi từ hạt chưa trưởng thành của Pinus rigida × P. taeda. Các tế bào tiền phôi được đưa lên môi trường ½ LM chứa 100 μM ABA, 0,2 M maltose và 1.2% gellan gum đến khi phôi trưởng thành đến giai đoạn lá mầm. Sau đó, phôi được chuyển sang môi trường nảy mầm chứa 0,4% gellan gum, tỷ lệ nảy mầm khá cao (71.4 – 96.3%). Khoảng 500 cây tạo từ phôi vô tính được đưa ra trồng trong nhà lưới.

Năm 2009, Carneros và cộng sự nghiên cứu tạo phôi vô tính loài thông đá (P. pineda L.). Thể giao tử chứa phôi hữu tính của 5 dòng thông được thu hái vào thời điểm khác nhau trong suốt hai năm liền. Môi trường cảm ứng tạo mô phôi là LM bổ sung L - L- glutamine, casein hydrolysate, 9 µM 2,4 – D và 4,5 µM BAP. Để quá trình tăng sinh nhanh chóng, tác giả đưa mô phôi vào môi trường LM lỏng vào sau đó thu mô phôi trên giấy lọc. Kết quả hình thành được 42 phôi vô tính trưởng thành trong các dòng thông đem thí nghiệm, 23 trong số chúng nảy mầm và tạo được 7 cây con.

Năm 2011, Malabadi và cộng sự cảm ứng tạo phôi vô tính Pinus caribaeatừ 5 dòng phôi hữu tính trưởng thành sử dụng môi trường ½ MSG bổ sung 2 µM 24- epiBrassinolide và 0,9 µM 2,4 – D. Tuy nhiên, đáp ứng của 5 dòng P. caribea khác nhau, tỷ lệ tạo phôi vô tính cao nhất ở gia đình PC 05 là 87%, tỷ lệ thấp nhất là 70% ở gia đình PC 11. Phôi phát triển tốt sau khi đưa lên môi trường trưởng thành chứa 180 mM maltose, 120 µM ABA và 10 g/l gellan gum 12 – 14 tuần. Sau khi trưởng thành, phôi được chọn lọc cho nảy mầm sau 6 tuần và tạo cây con. Số cây con tạo thành/trọng lượng tươi tiền phôi cao nhất là 45. 24 - epiBrassinolide là một chất điều hòa sinh trưởng, hỗ trợ cho quá trình cảm ứng tạo tiền phôi ở thực vật có quả hình nón được sử dụng ở Ấn Độ.

Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Nội dung nghiên cứu

Ảnh hưởng của một số yếu tố hoá học đến: - tăng sinh khối tế bào tiền phôi.

- thành thục hóa khối tiền phôi và tạo phôi soma.

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu

- Kĩ thuật nuôi cấy in vitrođược thực hiện suốt đề tài.

- Thí nghiệm: bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 đĩa petri, mỗi đĩa 150 mg tiền phôi.

- Phương pháp thống kê: sử dụng phần mềm thống kê SPSS phiên bản 20 để xử lí số liệu thu được trong các thí nghiệm.

2.2. Vật liệu, dụng cụ và hóa chất 2.2.1 Vật liệu 2.2.1 Vật liệu

Tiền phôi của 6 gia đình thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries ) được phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ cung cấp.

2.2.2. Dụng cụ thí nghiệm - Cân phân tích

- Cân điện tử

- Máy đo pH môi trường

- Máy lọc nước Direct-Q3 Millipore - Máy khuấy từ

- Đĩa petri - Ống flacon

- Ống corning 15 ml, 50 ml

- Micropippet 20 – 200 µl, 200 – 1000 µl và đầu típ các loại - Tủ cấy class II

- Nhíp 25 cm - Phễu Buchner

- Giấy lọc Whatman No.2 để cấy mẫu, giấy bạc hấp vô trùng. - Các dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm.

2.2.3. Hóa chất

Hóa chất cơ bản cần thiết môi trường LVM (Livay và cộng sự, 1998): NH4NO3 820 mg.l-1, KNO3 950 mg.l-1, MgSO4 925 mg.l-1, KH2PO4 17 mg.l-1,

CaCl2 1,1 mg.l-1, KI 4,15 mg.l-1, H3BO3 31 mg.l-1, MnSO4 21 mg.l-1, ZnSO4 43 mg.l-1, Na2MoO4 1,25 mg.l-1, CuSO4.5H2O 0,5 mg.l-1, CoCl2 .6H2O 0,13 mg.l-1, 4 g/l Fe – EDTA, thiamine 0,1 mg.l-1, nicotine acid 0,5 mg.l-1, pyridoxyl 0,1 mg.l-1,

myo - inositol 10 mg.l-1.

Các hoá chất khác bổ sung vào môi trường cơ bản nuôi cấy và khảo sát như đường maltose, sucrose (Duchefa – Hà Lan), cas amino acid (Difco – Mỹ). PEG 8000 (Đài Loan), L- L- glutamine, than hoạt tính.

Các hormon sinh trưởng thực vật dùng trong các thí nghiệm: 2,4 –D (2,4- diclorophenoxyacetic ), BA (6- benzyl adenine), NAA (Naphthalene acid acetic), Adenine sulfate, ABA (Abscisis acid).

2.3. Phương pháp tiến hành

2.3.1. Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi 2.3.1.1 Chuẩn bị môi trường và sinh khối tiền phôi 2.3.1.1 Chuẩn bị môi trường và sinh khối tiền phôi

Môi trường duy trì dùng cho tăng sinh khối tế bào tiền phôi: - LVM gốc (đa lượng, vi lượng, vitamin)

- Myo – inosytol : 1g/l.

- 1 g/l cas amino axit (Difco – Mỹ). - 20 g/l sucrose (Duchefa – Hà Lan).

- 2,2 ml/l 2,4 - D từ dung dịch gốc (1,0 mg/ml) (Merck – Mỹ). - 2,2 ml/l BA từ dung dịch gốc (0,5 mg/ml)

Điều chỉnh pH = 5,7 bằng NaOH 1N và HCl 0,5N. Hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp vô trùng, lấy môi trường ra, khi nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 550

C, thêm 20 ml/l L- glutamine (đã được lọc vô trùng, lấy từ dung dịch gốc 25 mg/ml) (Sigma – Mỹ). Trường hợp cần môi trường bán rắn: bổ sung 4 g/l phytagel (Mỹ) rồi hấp vô trùng và sau đó cũng thêm L- glutamin như trên, rồi đổ môi trường vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri chứa khoảng 30ml môi trường.

Môi trường LVM lỏng dùng trong các thí nghiệm tăng sinh khối tế bào tiền phôi có thành phần tương tự môi trường bán rắn nhưng không cần bổ sung phytagel, L- glutamine. Sau khi điều chỉnh pH= 5,7 cũng hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội dùng dần trong các thí nghiệm.

Tế bào tiền phôi do Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam bộ cung cấp được cấy chuyền để tăng sinh khối bằng môi trường LVM duy trì. Khi được lượng sinh khối nhất định, cấy chuyền sang đĩa môi trường mới chuẩn bị cho các thí nghiệm sau. Tiền phôi dùng trong các thí nghiệm sau 7 - 10 ngày cấy chuyền.

2.3.1.2. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả L- glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi

Lấy từng cụm tiền phôi đưa vào môi trường LVM lỏng, lắc nhẹ cho các cụm tế bào tách rời nhau ra. Dùng pipet hút các tế bào tiền phôi đổ qua phễu lọc Buchner thu lại tế bào trên giấy lọc đã được hấp vô trùng. Chuyển giấy lọc sang đĩa petri chứa môi trường LVM dùng cho tăng sinh khối bổ sung L- glutamine đã được lọc vô trùng ở các nồng độ: 0; 100; 300; 500 và 700 mg/l; với các nghiệm thức tương ứng là 1,2,3,4,5.

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả L- glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi.

Nghiệm thức Nồng độ L- glutamine (mg/l) 1 0 2 100 3 300 4 500 5 700

Chỉ tiêu theo dõi: sự gia tăng khối lượng tế bào tiền phôi theo thời gian 1 tuần, 2 tuần sau khi cấy.

Cách theo dõi : sau khi cấy vào các đĩa petri đặt các đĩa vào trong phòng nuôi. Theo dõi sự tăng khối lượng tế bào bằng cách cân. Sau một tuần cân lần 1, hai tuần sau khi cấy cân lần 2. Việc cân tiến hành trong tủ cấy vô trùng bằng cân điện tử nhỏ. Ghi nhận kết quả trong mỗi lần cân : cân khối lượng đĩa có giấy lọc chứa tế bào tiền phôi bên trên và khối lượng đĩa đã lấy giấy lọc và tế bào tiền phôi ra. Hiệu số hai giá trị này dùng tính toán khối lượng tế bào tiền phôi tăng thêm.

2.3.1.3. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu hiệu quả NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi

Lấy từng cụm tiền phôi đưa vào môi trường LVM lỏng, lắc nhẹ cho các cụm tế bào bị tách rời. Dùng micropipet hút các tế bào tiền phôi đổ qua phễu lọc Buchner thu tế bào lại trên giấy lọc đã được hấp vô trùng. Chuyển giấy lọc có chứa các tế bào sang đĩa petri chứa môi trường LVM dùng cho tăng sinh có bổ sung BA và NAA ở các nồng độ trong các nghiệm thức theo bảng 2.2 dưới đây

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi.

Theo dõi sự tăng sinh khối tế bào ở mỗi đĩa sau thời gian 1tuần, 2 tuần bằng cách cân.

Cách theo dõi sự tăng khối lượng tế bào giống như ở thí nghiệm 1 ở trên.

2.3.2. Nghiên cứu thành thục hóa khối tiền phôi và tạo phôi soma

Các tế bào tiền phôi sau khi cấy trên môi trường tăng sinh để thu sinh khối được sử dụng cho các thí nghiệm thành thục hoá và tạo phôi soma. Khi tiến hành thí nghiệm, chọn các cụm tế bào tiền phôi có màu trắng, hơi trong suốt từ các cụm tế bào khô ráo, xốp để làm mẫu cấy.

Môi trường nuôi cấy dùng cho các thí nghiệm thành thục hóa tế bào tiền phôi: - LVM gốc (đa lượng, vi lượng, vitamin).

- Cas amino acid (Difco – Mỹ): 1 g/l. - Myo – inosytol: 1 g/l.

- Sucrose (Duchefa – Hà Lan) : 60 g/l. - Dung dịch Fe – EDTA: 50ml/l. - Phytagel 10 g/l.

- L- glutamine: 20ml/l.

Điều chỉnh pH = 5,7 bằng NaOH 1N và HCl 0,1N. Hấp vô trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp vô trùng, lấy môi trường ra. Khi nhiệt độ môi

Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) 1 0 0 2 1 0 3 3 1 4 5 1 5 7 1

trường hạ xuống khoảng 550C, thêm 20 ml/l L- glutamine (đã được lọc vô trùng, lấy từ dung dịch gốc 25 mg/ml) (Sigma – Mỹ). Trường hợp cần môi trường bán rắn: bổ sung 10 g/l phytagel (Mỹ) vào rồi hấp vô trùng và sau đó cũng thêm L- glutamine như trên, rồi đổ môi trường vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri chứa khoảng 30 ml môi trường.

Môi trường LVM lỏng trong mỗi thí nghiệm nghiên cứu thành thục hoá tiền phôi có thành phần tương tự như môi trường dùng cho thành thục hoá trong thí nghiệm đó, không cần cho L- glutamine và phytagel. Sau khi chuẩn pH= 5,7 cũng được hấp vô trùng, để nguội dùng trong các thí nghiệm.

2.3.2.1.Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng adenine sulfate đến thành thục hóa tiền phôi

Lấy các cụm tế bào tiền phôi ở các dòng khảo sát đem cân sau đó cho vào môi trường lỏng trong ống corning 50ml. Lắc nhẹ cho các tế bào tách rời nhau ra tạo dạng huyền phù. Sau khi lắc, để yên ống khoảng 10 phút. Dùng micropipet hút mỗi lần 5ml dung dịch trong ống trải đều lên giấy lọc đặt trên phễu Buchner để thu hồi các tế bào tiền phôi. Đặt giấy lọc có chứa các tế bào tiền phôi vào đĩa môi trường thành thục có bổ sung Adenine sulfate với nồng độ như bảng 2.3.

Bảng 2.3. Nồng độ Adenine sulfate trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng adenin sulfate đến thành thục hóa tiền phôi.

Nghiệm thức Nồng độ adenine sulfate (mg/l)

1 0 2 20 3 40 4 60 5 80 6 100

Các đĩa môi trường có chứa tế bào tiền phôi đặt trong tối ở phòng nuôi, nhiệt độ phòng nuôi giữ ở 25 ± 20 C. Theo dõi số lượng phôi soma tạo ra trong mỗi dòng ở mỗi nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy.

2.3.2.2. Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thành thục hóa tiền phôi.

Bảng 2.4. Nồng độ ABA dùng trong nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến

Tình hình nghiên cứu tạo phôi vô tính

Vật liệu, dụng cụ và hóa chất