4. Thời gian thực hiện
2.3.2. Nghiên cứu thành thục hóa khối tiền phôi và tạo phôi soma
Các tế bào tiền phôi sau khi cấy trên môi trường tăng sinh để thu sinh khối được sử dụng cho các thí nghiệm thành thục hoá và tạo phôi soma. Khi tiến hành thí nghiệm, chọn các cụm tế bào tiền phôi có màu trắng, hơi trong suốt từ các cụm tế bào khô ráo, xốp để làm mẫu cấy.
Môi trường nuôi cấy dùng cho các thí nghiệm thành thục hóa tế bào tiền phôi: - LVM gốc (đa lượng, vi lượng, vitamin).
- Cas amino acid (Difco – Mỹ): 1 g/l. - Myo – inosytol: 1 g/l.
- Sucrose (Duchefa – Hà Lan) : 60 g/l. - Dung dịch Fe – EDTA: 50ml/l. - Phytagel 10 g/l.
- L- glutamine: 20ml/l.
Điều chỉnh pH = 5,7 bằng NaOH 1N và HCl 0,1N. Hấp vô trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp vô trùng, lấy môi trường ra. Khi nhiệt độ môi
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) 1 0 0 2 1 0 3 3 1 4 5 1 5 7 1
trường hạ xuống khoảng 550C, thêm 20 ml/l L- glutamine (đã được lọc vô trùng, lấy từ dung dịch gốc 25 mg/ml) (Sigma – Mỹ). Trường hợp cần môi trường bán rắn: bổ sung 10 g/l phytagel (Mỹ) vào rồi hấp vô trùng và sau đó cũng thêm L- glutamine như trên, rồi đổ môi trường vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri chứa khoảng 30 ml môi trường.
Môi trường LVM lỏng trong mỗi thí nghiệm nghiên cứu thành thục hoá tiền phôi có thành phần tương tự như môi trường dùng cho thành thục hoá trong thí nghiệm đó, không cần cho L- glutamine và phytagel. Sau khi chuẩn pH= 5,7 cũng được hấp vô trùng, để nguội dùng trong các thí nghiệm.
2.3.2.1.Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng adenine sulfate đến thành thục hóa tiền phôi
Lấy các cụm tế bào tiền phôi ở các dòng khảo sát đem cân sau đó cho vào môi trường lỏng trong ống corning 50ml. Lắc nhẹ cho các tế bào tách rời nhau ra tạo dạng huyền phù. Sau khi lắc, để yên ống khoảng 10 phút. Dùng micropipet hút mỗi lần 5ml dung dịch trong ống trải đều lên giấy lọc đặt trên phễu Buchner để thu hồi các tế bào tiền phôi. Đặt giấy lọc có chứa các tế bào tiền phôi vào đĩa môi trường thành thục có bổ sung Adenine sulfate với nồng độ như bảng 2.3.
Bảng 2.3. Nồng độ Adenine sulfate trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng adenin sulfate đến thành thục hóa tiền phôi.
Nghiệm thức Nồng độ adenine sulfate (mg/l)
1 0 2 20 3 40 4 60 5 80 6 100
Các đĩa môi trường có chứa tế bào tiền phôi đặt trong tối ở phòng nuôi, nhiệt độ phòng nuôi giữ ở 25 ± 20 C. Theo dõi số lượng phôi soma tạo ra trong mỗi dòng ở mỗi nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy.
2.3.2.2. Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thành thục hóa tiền phôi.
Lấy các cụm tế bào tiền phôi ở các dòng khảo sát đem cân sau đó cho vào môi trường lỏng trong ống corning 50ml. Lắc nhẹ cho các tế bào tách rời nhau ra tạo dạng huyền phù. Sau khi lắc, để yên ống khoảng 10 phút. Dùng micropipet hút mỗi lần 5ml dung dịch trong ống trải đều lên giấy lọc đặt trên phễu Buchner để thu hồi các tế bào tiền phôi. Đặt giấy lọc có chứa các tế bào tiền phôi vào đĩa môi trường thành thục có bổ sung ABA với nồng độ như bảng 2.3.
Bảng 2.4. Nồng độ ABA dùng trong nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thành thục hóa tiền phôi.
Nghiệm thức Nồng độ ABA (µmol)
1 0 2 20 3 40 4 60 5 80 6 100
Các đĩa môi trường có chứa tế bào tiền phôi đặt trong tối ở phòng nuôi, nhiệt độ phòng nuôi giữ ở 25 ± 20 C. Theo dõi số lượng phôi soma tạo ra trong mỗi dòng ở mỗi nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy.
2.3.2.3. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của một số nồng độ và loại đường đến thành thục hóa tiền phôi
Lấy các cụm tế bào tiền phôi của các dòng khảo sát đem cân sau đó cho vào môi trường lỏng trong ống corning 50m. Lắc nhẹ cho các tế bào tách rời nhau ra tạo dạng huyền phù. Sau khi lắc, để yên ống khoảng 10 phút. Dùng micropipet hút
mỗi lần 5ml dung dịch trong ống trải đều lên giấy lọc đặt trên phễu Buchner để thu hồi các tế bào tiền phôi. Đặt giấy lọc có chứa các tế bào tiền phôi vào đĩa môi trường thành thục có bổ sung ABA với nồng độ 80 µM. Nồng độ và các loại đường sử dụng trong thí nghiệm như bảng sau
Bảng 2.5. Loại đường và nồng độ đường dùng trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số nồng độ và loại đường đến thành thục hóa tiền phôi.
Loại đường Nghiệm thức Nồng độ (g/l)
Sucrose 1 0 2 30 3 60 4 90 Maltose 1 0 2 30 3 60 4 90
Các đĩa môi trường có chứa tế bào tiền phôi đặt trong tối ở phòng nuôi, nhiệt độ phòng nuôi giữ ở 25 ± 20 C. Theo dõi số lượng phôi soma tạo ra trong mỗi dòng ở mỗi nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy.
2.3.2.4. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của phối hợp PEG với đường đến thành thục hóa tiền phôi.
Lấy các cụm tế bào tiền phôi ở các dòng khảo sát đem cân sau đó cho vào môi trường lỏng trong ống corning 50ml. Lắc nhẹ cho các tế bào tách rời nhau ra tạo dạng huyền phù. Sau khi lắc, để yên ống khoảng 10 phút. Dùng micropipet hút mỗi lần 5ml dung dịch trong ống trải đều lên giấy lọc đặt trên phễu Buchner để thu hồi các tế bào tiền phôi. Đặt giấy lọc có chứa các tế bào tiền phôi vào đĩa môi
trường thành thục hóa có bổ sung ABA với nồng độ 80 µM. Nồng độ và các loại đường sử dụng trong thí nghiệm như bảng sau
Bảng 2.6. Nồng độ đường và loại đường trong nghiên cứu ảnh hưởng của phối hợp PEG với đường đến thành thục hóa tiền phôi.
Nghiệm thức Nồng độ đường sucrose (g/l) Nồng độ đường maltose (g/l) Nồng độ PEG (g/l) Nồng độ ABA (µM) 1 30 0 80 2 30 30 80 3 60 30 80 4 90 30 80 5 30 0 80 6 30 30 80 7 60 30 80 8 90 30 80
Các đĩa môi trường đem đặt trong tối ở phòng nuôi, nhiệt độ phòng nuôi giữ ở 25 ± 20 C. Theo dõi số lượng phôi soma tạo ra ở từng dòng trong mỗi nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy.
2.3.2.5. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của một số nồng độ than hoạt tính đến thành thục hóa tiền phôi
Lấy các cụm tế bào tiền phôi ở các dòng khảo sát đem cân sau đó cho vào môi trường lỏng trong ống corning 50ml. Lắc nhẹ cho các tế bào tách rời nhau ra tạo dạng huyền phù. Sau khi lắc, để yên ống khoảng 10 phút. Dùng micropipet hút mỗi lần 5ml dung dịch trong ống trải đều lên giấy lọc đặt trên phễu Buchner để thu hồi các tế bào tiền phôi. Đặt giấy lọc có chứa các tế bào tiền phôi vào đĩa môi trường thành thục hóa có bổ sung ABA với nồng độ 80 µM. Lượng than hoạt tính sử dụng trong thí nghiệm này như bảng sau
Bảng 2.7. Lượng than hoạt tính sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số nồng độ than hoạt tính đến thành thục hóa tiền phôi.
Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l)
1 0
2 10
3 20
Các đĩa môi trường đem đặt trong tối ở phòng nuôi, nhiệt độ phòng nuôi giữ ở 25 ± 20 C. Theo dõi số lượng phôi soma tạo ra ở từng dòng trong mỗi nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN