4. Thời gian thực hiện
3.7.Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của một số nồng độ than hoạt tính đến thành thục
thục hóa tiền phôi
Trong nuôi cấy tế bào thực vật, than hoạt tính được cho vào môi trường để ngăn chặn sự hoá nâu, đen của mẫu cấy. Tuy nhiên, than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác. Trong tạo phôi, thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy kích thích phát triển phôi ở Zea mays, Jujube và Carica payaya I(Nguyễn Quang Thạch, 2009).
Sử dụng môi trường LVM cho thành thục hóa tế bào tiền phôi, bổ sung than hoạt tính trong các nghiệm thức theo bảng 2.7. Kết quả thu được ở các dòng khảo sát như sau
Bảng 3.25. Số lượng phôi soma trung bình của các dòng 2, 6 và 29 dưới ảnh hưởng của than hoạt tính (chữ cái a là mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%).
Dòng Nghiệm thức
Than hoạt tính (g/l)
Số phôi soma trung bình/ đĩa cấy 2 1 0 12,33 ± 0,88 a 2 10 15,67 ± 0,88 a 3 20 15,00 ± 1,16 a 1 0 6,67 ± 0,33 a 6 2 10 8,00 ± 0,58 a 3 20 6,33 ± 0,88 a 1 0 5,33 ± 0,33 a 29 2 10 6,00 ± 1,16 a 3 20 6,00 ± 1,00 a
Qua số liệu thu được trong bảng 3.25 cho thấy có hay không có than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy đều tạo được phôi. Khi tăng lượng than hoạt tính lên 10, 20 g/l cũng không làm tăng số phôi thu được ở mỗi dòng một cách rõ ràng. Sự khác biệt về số phôi trung bình thu được ở các dòng giữa các nghiệm thức khi có hay không có than hoạt tính là không có ý nghĩa về mặt thống kê (phụ lục 32, 33, 34). Như vậy, có thể nói than hoạt tính không ảnh hưởng đáng kể trong quá trình thành thục và tạo phôi soma ở thông nhựa.
Ở cây vân sam Na-uy (Picea abies L., Karst.), dùng than hoạt tính 1,25 g/l kết hợp với ABA 650 mg/l cho hiệu quả thành thục phôi cao (Pullman và cs, 2005).
Hình 3.3. Thành thục tạo phôi soma trên môi trường LVM bổ sung than hoạt tính 10 g/l.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Nồng độ L- glutamine 500 mg/l bổ sung vào môi trường LVM phù hợp nhất cho các thí nghiệm nhân nhanh sinh khối tế bào tiền phôi của hầu hết các dòng.
Trong nhân nhanh sinh khối tế bào tiền phôi cũng có thể sử dụng cytokinin BA (1mg/l) và không cần sử dụng auxin NAA.
Nồng độ adenine sulfate 60 – 80 mg/l cho kết quả tạo phôi tốt nhất .
Nồng độ ABA 80 – 100 µM cho kết quả tạo phôi tốt nhất, trong đó nồng độ 80 µM cho hiệu quả tốt trên các dòng.
Đường maltose tốt hơn đường sucrose khi sử dụng trong thành thục tế bào tiền phôi và tạo phôi soma, nồng độ tối ưu từ 60 - 90 g/l.
Khi có sự phối hợp giữa PEG với đường để thành thục tế bào tiền phôi thì nồng độ PEG 30 g/l kết hợp với đường maltose 90 g/l cho hiệu quả tạo phôi tốt.
Than hoạt tính chưa có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả tạo phôi soma của các dòng khảo sát.
4.2. Một số kiến nghị
Để tăng hiệu quả nghiên cứu quá trình phát sinh phôi soma, cần tiến hành khảo sát thêm một số yếu tố như ảnh hưởng của TDZ, một số nồng độ PEG khác, các điều kiện ánh sáng, nhiệt độ,...
Thực hiện các nghiên cứu tiếp theo khi thu được cây non để đánh giá, hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính tạo cây hoàn chỉnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Lê Xuân Ái, Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), “Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật bảo tồn nguồn gen lát hoa Côn Đảo (Chukrasia tabularis A. Juss)”, kỷ yếu Hội nghị Khoa học và Công nghệ 200, trang 463 - 466.
2. Lê Văn Hòa, Nguyễn Văn Ây và Phan Thị Ánh Nguyệt (2012), “Sự tạo phôi soma và tái sinh chồi tre Rồng (Dendrocalamus giganteus Wall. Ex munro) từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào”,Tạp chí Khoa học 2012 (21b), 68-77.
3. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật , Nxb Nông nghiệp,Hà Nội.
4. Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật: nghiên cứu cơ bản và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp,Hà Nội.
5. Huỳnh Thị Đan San, Võ Thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo là cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb. In vitro”,
tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, tập 12 (17), trang 81- 84.
6. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
7. Phạm Thị Bích Thủy, Nguyễn Bảo Toàn (2008) , “Sự tạo phôi soma quýt đường (Citrus reticulata Blanco) từ nuôi cấy phôi tâm”, tạp chí công nghệ sinh học 6 (2), trang 241 – 248.
8. Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, Viện tư vấn phát triển kinh tế - xã hội nông thôn và miền núi, (2002), Kĩ thuật trồng cây làm nguyên liệu giấy, Nxb Lao động – xã hội, Hà Nội.
9. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lí thực vật đại cương phần II: phát triển, Nxb Đại học Quốc gia Tp. HCM, Tp. HCM.
10. Bùi Văn Thế Vinh, Chu Thị Bích Phượng, Thái Xuân Du, Đỗ Đăng Giáp, Dương Tấn Nhựt (2011), “Sự phát sinh phôi vô tính từ mẫu cấy lá cây dầu
mè (Jatropha curcas L.)”, Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học, 287 – 299.
11. Becwar M. R., Nagmani R., Wann S. R. (1990), “Initiation of embryogeniccultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda)”, Can J For Res 20, 810 – 817.
12. Bozhkov P. V., Ahn I. S., Park Y. G.(1997), “Two alternative pathways of somatic embryo origin from polyembryonic mature store seeds of Pinus koraiensis Sieb. et Zucc”, Can J Bot 75, 509 – 512.
13. Carneros E., Celestino C., Klimaszewska K., Park Y.,Toribio M., Bonga J. M.(2009), “Plant regeneration in Stone pine (Pinus pinea L.) by somatic embryogenesis”, Plant Cell Tiss Organ Cult 98, 165 – 178.
14. Castillon J. and Kano K. (2002), “Mature and conversion of somatic embryos of three geneticaly diverse rose cultivars”, Hortscience 37(6), 973 – 977.
15. Chalupa V, (1985), “Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured immature and mature embryos of Picea abies (L.) Karst. Comm. Inst”, Forest Chech 14, 57- 63.
16. Coste A., Obtean B., Halmagyi A., Deliu C. (2011). “Direct somatic embryogenesis and plant regeneration in Peucedanum oreoselinum (L.) Moench”, Romanian Biotechnological Letters vol 16 (4), 6450 – 6459.
17. Das P., Ruot G.H and Das A. B. (1993), “Somatic embryogenesis in callus culture Mussaenda erythrophylla L. cs. Queen Sirikit and Rosea”, Plant cell tissue and organ culture 35, 199 – 201.
18. Dunstan D. I., Bethune T. D. and Abrams S. R. (1991) “Racemic abscisic acid and abscisyl alcohol promote maturation of white spruce (Picea glauca) somatic embryos”, Plant Science 76, 219 – 228.
19. Finer J. J., Kriebel H. B., Becwar M. R. (1989), “Initiation of embryogenic callus and suspension cultures of easter white pine (Pinus strobus L.)”, Plant Cell Rep 8, 203 – 206.
20. Ford C.S., Jones N.B. and van Staden J. (2000), “Cryopreservation andplant regeneration from somatic embryos of Pinus patula”,Plant Cell Rep 19, 610 – 615.
21. Gupta P.K. and Durzan D. J. (1986), “Somatic polyembryogenesis from callus of mature sugar pine embryos”, Bio/Technol 4, 643 – 645.
22. Hakman I, Fowke LC, Von Arnold S, Eriksson T (1985), “The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce)”, Plant Science
38, 53-59.
23. Indra S. Harry and Trevor A. Thorpe (1991), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from mature zygotic embryos of red spruce”, Bot. Gaz. 152 (4), 446 – 452.
24. Jain S. M., Dong N. and Newton R. J. (1989), “Somatic embryogenesis in slash pine (Pinus elliottii) from immature embryos cultures in vitro”, Plant Science
65, 233 – 241.
25. Jeung-Keun Suh, Wan-Hee Lee and Ae-Kyung Lee (2005), “New Plantlet Proliferation and Bulbing Promotion in In vitro Culture of Ornithogalum
Hybrid”, Acta Hort. 683 ISHS, 155 – 163.
26. Jones N.B., van Staden J. (1995), “Plantlet production from somatic embryos of
Pinus patula”,J Plant Physiol 145, 519 – 525.
27. K. Kaul, S. A. Hoffman (1993), “Ammonium ion inhibition of Pinus strobus L. callus growth”, Vol 88, 169 - 173.
28. Kim Y. W. and Moon H. K. (2007), “Regeneration of plant by somatic embryogenesisin Pinus rigida×P. taeda”, In Vitro Cell.Dev.Biol 43, 335 – 342.
29. Keinonen - Mettälä K., Jalonen P., Eurola P., von Arnold S., von Weissenberg K. (1996), “Somatic embryogenesis of Pinus sylvestris”, Scand J For Res
30. Klimazewska.K, Cardou MB; Cyr DR and Sutton BCS (2000), “Influence of gelling agents on culture medium gel strength, water availability, tissue water potential, and maturation response in embryogenic cultures of Pinus strobes”, In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant 36, 279-286.
31. Krystyna Szczygiel, Teresa Hazubska – Przybyl, Krystyna Bojarczuk (2006), “Somatic embryogenesis of selected coniferous three species of the genera Picea, Abies and Larix”, Acta societatis Botanicorum poloniae, 77 (1), 7-15.
32. Kormut'ák A. and Vooková B. (2009), “Effect of sucrose concentration, polyethylene glycol and activated charcoal on maturation and regeneration of Abies cephalonica somatic embryos”, Plant Cell Monographs vol 96, 251 – 262.
33. Lecouteux C. G., Lai F., McKersie B. D. (1993), “Maturation of alfalfa (Medicago sativa L.) somatic embryos by abscisic acid, sucrose and chilling stress”, Plant Science 94, 207 – 213.
34. Li, X. Y., Huang, F. H. and Gbur, E. E. (1998), “Effect of basal medium, gorwth regulators and phytagel concentration on initiation of embryogenic cultures from immature zygotic embryos of loblolly pine (Pinus taeda L.)”,
Plant Cell Reports. 17, 298 – 301.
35. Malabadi R.B., Choudhury H. and Tandon P. (2002), “Plant regenera-tion via somatic embryogenesis in Pinus kesiya (Royle ex. Gord)”, Appl. Biol. Res 4, 1 – 10.
36. Malabadi R. B. and Staden J. V. (2005), “Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula”, Tree Physiology 25, 11 – 16.
37. Malabadi R. B., da Silva J. A. T. and Mulgund G. S. (2011), “Induction of somatic embryogenesis in Pinus caribaea”, Tree and Forestry Science and Biotechnology 5, 27 – 32.
38. Marija P., Angelina S., Slañana J. and Milana T (2011), “Somatic embryogenesis and bulblet regeneration in snakehead fritillary (Fritillaria meleagris L.)”, African Journal of Biotechnology 10 (72): 16181 – 16188. 39. Markus Gutmann, Patrick von Aderkas, Philippe Label and Marie-Anne Lelu
(1996), “Effects of abscisic acid on somatic embryo maturation of hybrid larch”, Journal of Experimental Botany Vol. 47 No. 305, pp. 1905-1917. 40. Martin P., (2003), “Plant regeneration through direct somaticembryogenesis on
seed coat explants of cashew (Anacardium occidentale L.)”, Scientia Horticulturae 98 (3), 299 – 301.
41. Maruyama E., Hosoi Y. and Ishii K. (2005), “Somatic embryo production and plant regeneration of Japanese black pine (Pinus thunbergi)”, J For Res 10, 403 – 407.
42. Nagmani R., Diner A. M., Sharma G. C. (1993), “Somatic embryogenesis in longleaf pine (Pinus palustris)”, Can J For Res 23, 873 – 876.
43. Percy R.E., Klimaszewska K., Cyr D.R. (2000), “Evaluation of somaticembryogenesis for clonal propagation of western white pine”, Can. J. For. Res 30, 1867 – 1876.
44. Pullman G. S., Paul Montello, John Cairney, Nanfei Xu, Xiaorong Feng (2003), “Loblolly pine (Pinus teada L.) somatic embryogenesis: maturation improvements by metal analyses of zygotic and somatic embryos”, Vol 64, 955 - 969.
45. Pullman G. S., Gupta P. K., Timmis R., C. Carpenter M. Kreitinger E. Welt (2005), “Improved Norway spruce somatic embryo development through the use of abscisic acid combined with activated carbon”, Plant Cell Rep 24, 271–279.
46. Radojevic L., Alvaer C., Fraga F. and Rodriguez R. (1999), “Somatic embryogenesis tissue establishment from mature Pinus nigra ARN. SSP Salzmanii embryos”, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35, 206 – 209.
47. Salajova, T., Salaj, J., and Kormutak, A. (1999), “Initiation of embryogenic tissues and plant regeneration from somatic embryos of Pinus nigra Arn”,
Plant Science 145, 33-40.
48. Salma, M.S.M. Rahman, S. Islam, N. Haque, T.A. Jubair, A.K.M.F. Haque and I.J. Mukti (2008), “The Influence of Different Hormone Concentration and Combination on Callus Induction and Regeneration of Rauwolfia serpentina L. Benth”, Pakistan Journal of Biological Sciences
11, 1638-1641.
49. Shinjiro Ogita, Hamako Sasamoto, Edward C. Yeung and Trevor A. Thorpe (2001), “The effects of glutamine of the maintenance of embryogenic cultures of Cryptomeria japonica”, in vitro cellular & developmental biology – plant, 268-273.
50. Slaheddine Khlifi & Francine M. Tremblay (1995), “Maturation of black spruce somatic embryos. Part I. Effect of L –glutamine on the number and germinability of somatic embryos”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 41, 23-32.
51. Stasolla C., Kong L., Yeung E. C., Thorpe T. A. (2002), “Mature of somatic embryos in conifers: Morphogenesis, physiology, biochemistry and moclecular biology”, In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 38, 93 – 105.
52. Steiner N., Vieira F. N., Maldonado S. and Guerra M. P. (2005), “Effect of Carbon Source on Morphology and Histodifferentiation of Araucaria angustifolia Embryogenic Cultures”, Brazillan archives of biology and technology 48 (6), 895 – 903.
53. Terezia Salajova , Jan Salaj, Andrej Kormutak (1999), “Initiation of embryogenic tissues and plantlet regeneration from somatic embryos of
Pinus nigra Arn.”, Plant Science 145, 33–40.
54. Terézia Salaj, Radoslava Matúšová and Jan Salaj (2004), “The effect of carbohydrates and polyethylene glycol on somatic embryo maturation in
hybrid fir Abies alba x Abies numidica”, Acta biologyca cracoviensia Series Botanica 46, 159–167.
55. Traore A. and Guitinan M. J. (2006), “Effects of carbon source and explants types on somatic embryogenesis of four cacao genotypes”, Hortscience 41 (3), 753 – 758.
56. Tremblay L. and Tremblay F. M. (1991), “Effects of gelling agents, ammonium nitrate, and light on the development of Picea mariana (Mill) B.S.P. (black spruce) and Picea rubens Sarg. (red spruce) somatic embryos”, Plant Science 77, 233 – 242.
57. Xin Y. Li, Feng H. Huang, J. Brad Murphy, Edward E. Gbur (1998), “Polyethylene glycol and maltose enhance somatic embryo maturation in loblolly pine (Pinus taeda L.)”, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 34, 22 -26.
58. Yildirim T., Kaya Z. and Isik K. (2006), “Induction of embryogenic tissue and maturation of somatic embryos in Pinus brutia TEN”, Plant Cell Tiss Organ Cult 87, 67 – 76.
TÀI LIỆU INTERNET
59. http://haniifiyyah.blogspot.com/2012/05/deskripsi-pinus-merkusii-pinus.html 60. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Pinus_merkusii_Toba.jpg. 61. http://www.dalat.gov.vn/web/tabid/169/Add/yes/ItemID/55/categories/5/Defaul t.aspx 62. http://www.ipst.gatech.edu/research/projects/faculty_bios/bio_pullman_gerald.h tml
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin của môi trường LVM
Thành phần môi trường (đa lượng)
Nồng độ (mg/l) Thành phần môi trường (vi lượng)
Nồng độ (mg/l) Thành phần môi trường (vitamin)
Nồng độ (mg/l)
NH4NO3 821 KI 4,15 Nycotin 0,5
KNO3 950 K3BO3 3,1 Pyridoxin 0,1
MgSO4 925 MnSO4.H2O 21 Thyamin 0,1
CaCl2 khan 8,3 ZnSO4.7H2O 4,3
KH2PO4 170 CuSO4.5H2O 0,5
CoCl2.6H2O 0,13 Na2MoO4.2H2O 1,25
Phụ lục 2. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 6 Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum Maximum Between- Component
Variance Lower Bound Upper Bound
Khối lượng tăng sau 1 tuần 0 9 237.78 19.861 6.620 222.51 253.04 210 270 100 9 257.78 21.082 7.027 241.57 273.98 230 300 300 9 262.22 29.486 9.829 239.56 284.89 220 300 500 9 311.11 31.798 10.599 286.67 335.55 270 360 700 9 292.22 29.907 9.969 269.23 315.21 250 350 Total 45 272.22 36.797 5.485 261.17 283.28 210 360
Model Fixed Effects 26.885 4.008 264.12 280.32
Random Effects 13.053 235.98 308.46 771.543 Khối lượng tăng sau 2 tuần 0 9 220.00 25.495 8.498 200.40 239.60 170 250 100 9 263.33 21.794 7.265 246.58 280.09 230 300 300 9 266.67 36.401 12.134 238.69 294.65 210 320 500 9 324.44 34.319 11.440 298.06 350.82 270 390 700 9 304.44 35.395 11.798 277.24 331.65 260 370 Total 45 275.78 47.169 7.032 261.61 289.95 170 390
Model Fixed Effects 31.243 4.657 266.36 285.19
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable (I) Nồng độ L- glutamine (mg/l) (J) Nồng độ L- glutamine (mg/l) Mean Difference (I-J) Std. Error
Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound
Khối lượng tăng sau 1 tuần LSD 0 100 -20.000 12.673 .122 -45.61 5.61 300 -24.444 12.673 .061 -50.06 1.17 500 -73.333* 12.673 .000 -98.95 -47.72 700 -54.444* 12.673 .000 -80.06 -28.83 100 0 20.000 12.673 .122 -5.61 45.61 300 -4.444 12.673 .728 -30.06 21.17 500 -53.333* 12.673 .000 -78.95 -27.72 700 -34.444* 12.673 .010 -60.06 -8.83 300 0 24.444 12.673 .061 -1.17 50.06 100 4.444 12.673 .728 -21.17 30.06 500 -48.889* 12.673 .000 -74.50 -23.27 700 -30.000* 12.673 .023 -55.61 -4.39 500 0 73.333* 12.673 .000 47.72 98.95 100 53.333* 12.673 .000 27.72 78.95 300 48.889* 12.673 .000 23.27 74.50 700 18.889 12.673 .144 -6.73 44.50 700 0 54.444* 12.673 .000 28.83 80.06 100 34.444* 12.673 .010 8.83 60.06 300 30.000* 12.673 .023 4.39 55.61 500 -18.889 12.673 .144 -44.50 6.73
Khối lượng tăng sau 2 tuần LSD 0 100 -43.333* 14.728 .005 -73.10 -13.57 300 -46.667* 14.728 .003 -76.43 -16.90 500 -104.444* 14.728 .000 -134.21 -74.68 700 -84.444* 14.728 .000 -114.21 -54.68 100 0 43.333* 14.728 .005 13.57 73.10