Nguyên tắc: Diacetyl và 2,3 Pentanedione được chưng cất từ bia và kế đó kết hợp với Othor-Phenylenediamine để tạo ra dẫn xuất quinoxaline và đo độ hấp thụ ở bước sóng 335 nm bằng máy quang phổ để xác định lượng hợp chất này.
Thuốc thử:
+ Dung dịch acid hydrochlorie 4 N
+ Othor-Phenylenediamine dung dịch 1% trong acid hydrochlorie 4N được chuẩn bị mới vào ngày sử dụng và giữ trong tối.
+ Diacetyl: Một dung dịch gốc được chuẩn bị bằng cách hoà tan 500 mg diacetyl trong 100 mL nước. Nó được tồn trữ trong chai màu nâu để trong tủ lạnh. Chỉ trước khi dùng, một dung dịch chuẩn chứa 25 µg diacetyl trong 100 mL được chuẩn bị bằng cách pha loãng 5 mL dung dịch gốc với nước thành 100 mL.
Phương pháp tiến hành:
+ Đối với mẫu thử: Mẫu bia phải trong, nếu chứa nhiều men ta phải ly tâm hay lọc.
Chưng cất 100 mL bia để thu được 25 mL dịch chưng cất trong ống đong. Không thể dùng tác nhân chống sủi bọt (trào bọt). Thời gian gia nhiệt ít nhất là 6 phút để cho phép chuyển các cấu tử đi trước thành diketones kế cận. Lắc đều dịch cất được, hút ra 10 mL dung dịch trên và thêm vào 0,5 mL o-phenylenediamine 1%. Để hỗn hợp trong tối (20 ÷ 30 phút), kế đó thêm 2 mL dung dịch acid HCl 4 N lắc đều. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 335 nm bằng quang phổ, thời gian tối đa là 20 phút.
+ Mẫu trắng: Dùng 10 mL nước và 0,5 mL dung dịch o-phenylenediamine 1%, ủ
trong tối 20 phút. Độ hấp thu của chuẩn được xác định bằng cách dùng 9,9 mL nước và 0,1 mL dung dịch chuẩn chứa 25 µg diacetyl và 0,5 mL o-phenylenediamine, ủ trong tối 20 phút. Sau khi ủ trong tối 20 phút, thêm vào mẫu trên 2 mL HCl 4 N trước khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 335 nm, (lưu ý thực hiện đo mẫu nào thì hút vào và mang đo ngay sau đó).
Tính kết quả: Kết quả được lấy hai số sau dấu phẩy.
Trong đó: - A335: Độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng 335 nm - Ab: Độ hấp thụ của mẫu trắng tại bước sóng 335 nm - Ast: Độ hấp thụ của mẫu chuẩn tại bước sóng 335 nm - Reference: Nước cất