3. đỐI TƯỢNG NỘI DUNG NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.6 Phương pháp xác ựịnh kháng sinh tồn dư trong thịt và cơ quan phủ tạng bằng phương pháp ELISA.
tạng bằng phương pháp ELISA.
- Thành phần của một bộ kắt:
+ Một plate 96 giếng có phủ kháng thể tinh sạch của cừu kháng lại kháng thể có nguồn gốc thỏ.
+ 7 lọ chứa dung dịch chuẩn (kháng nguyên KN): 1; 0,5; 0,3; 0,2; 0,1; 0,05 và 0, 01g/ml.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 40 + Dung dịch chứa KN có gắn men gây phản ứng tạo màu (peroxide conjugated norfloxacin).
+ Lọ chứa kháng thể (KT) có nguồn gốc từ thỏ ựặc hiệu với KN ựông khô + 1 lọ 18 ml Substrate/chromgen (tham gia phản ứng tạo màu perocide/TMB).
+ 50ml dung dịch ựệm pha loãng 7,4 - 10x. + Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 6N + 50ml dung dịch ựệm ựể rửa - 10x
Ảnh 3.1. Bộ kắt ELISA phản ứng tạo màu và bước dừng phản ứng màu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 41 - Chuẩn bị hoá chất:
+ PBS pH 7,4; 9g NaCl + 7,78g Na2HPO4.2H2O + 0,75g KH2PO4 trong 1 lắt nước.
+ Methanol/PBS (50/50 : V/V) + Pha loãng dung dịch ựệm 10x + Pha loãng KN gắn enzym 100x
+ Khôi phục KT ựông khô (+ 6ml dung dịch pha loãng) - Quy trình tách chiết mẫu:
+ 5g mẫu + 5ml methanol/PBS (50/50 : V/V) lắc ựảo ựều trong 30 phút + Ly tâm tốc ựộ 3000vòng/phút trong 10 phút
+ Lấy nước ở trên chắt sang ống nghiệm khác + Ly tâm tốc ựộ 4000vòng/phút trong 10 phút
+ 0,5ml + 4,5ml dung dịch ựệm pha loãng (pha loãng 10x) lắc ựảo ựều trong 30 giây
+ Lấy 50ộl/giếng. - Quy trình test
+ Bước 1: cho vào các giếng với lượng như sau: A1,2 150ộl dung dịch ựệm pha loãng
B1,2 50ộl dung dịch 0 ng/ml C1,2 50ộl dung dịch 1 ng/ml D1,2 50ộl dung dịch 0,5 ng/ml E1,2 50ộl dung dịch 0,3 ng/ml F1,2 50ộl dung dịch 0,2 ng/ml G1,2 50ộl dung dịch 0,1 ng/ml H1,2 50ộl dung dịch 0,05 ng/ml A3,4 50ộl mẫu 1 tách chiết B3,4 50ộl mẫu 2 tách chiết
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 42 C3,4 50ộl mẫu 3 tách chiết D3,4 50ộl mẫu 4 tách chiết E3,4 50ộl mẫu 5 tách chiết F3,4 50ộl mẫu 6 tách chiết G3,4 50ộl mẫu 7 tách chiết H3,4 50ộl mẫu 8 tách chiết
+ Bước 2: 100ộl dung dịch KT/giếng
+ Bước 3: lắc nhẹ 1 phút rồi ủ 1 tiếng ở 4oC + Bước 4: 100ộl dung dịch E.conjugate/giếng + Bước 5: ủ 1 tiếng ở 4oC
+ Bước 6: dốc bỏ hết, rửa 3 lần bằng dung dịch ựệm, vỗ úp hết + Bước 7: 150ộl peroxide/TMB/giếng
+ Bước 8: lắc nhẹ ủ 30 phút trong bóng tối ở nhiệt ựộ phòng + Bước 9: 50ộl dung dịch dừng phản ứng màu/giếng
+ Bước 10: lắc nhẹ, ựo ở bước sóng 450nm trong vòng 30 phút.