- Môi trường phân lập vi khuẩn và tăng sinh: thạch BHI có bổ sung 5% máu c ừu hoặc máu bò; thạch chocolate; thạch TSA (Tryptone soya agar) có b ổ xung
2.4.3.Phương pháp kiểm tra các ñặ c tính sinh hoá và khả năng lên men ñườ ng của các chủng vi khuẩn phân lập ñược
Kiểm tra ñộc lực Xác ñịnh serotype
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 29
- Thử phản ứng Oxydase: Tiến hành trên giấy ñược thấm 1% dung dịch Tetrametyl-p-Phenylenediamine hydrochloridẹ Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên trên mặt giấy ñã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím ñen sau 30 giây là phản ứng dương tính. Nếu không thấy xuất hiện màu tím ñen hoặc không ñổi màu là phản ứng âm tính.
- Thử phản ứng Catalase: Dùng phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên trên, que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch trộn ñều với giọt H2O2 3%, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính.
- Thử phản ứng sinh Indol: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt. ðể tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 0,5 ml dung dịch Kovac’s vào, phản ứng dương tính khi quan sát thấy một vòng màu ñỏ trên mặt môi trường.
- Thử phản ứng lên men ñường: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt, nuôi ở tủấm 370C trong 24 giờ, sau ñó nhỏ 0,2 ml canh khuẩn vào dung dịch ñường ñã chuẩn bị trước. Sau 24 giờ giữở tủấm 370C, nếu quan sát thấy màu của môi trường thay ñổi thành mầu ñỏ là dương tính, nếu vi khuẩn có sinh hơi sẽ thấy hơi trong ống Durham và ñẩy mực nước trong ống Durham xuống.
* Phương pháp thực hiện các phản ứng nhận biết cấp I ñối với S. suis
- Kiểm tra khả năng dung huyết: quan sát khả năng làm tan huyết xung quanh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra sau khi ñã nuôi cấy trên ñĩa thạch máu cừu, ủở tủấm 37oC (5% CO2) qua 24 giờ.
+ Dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết không hoàn toàn)
+ Dung huyết kiểu β: bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin bị phân huỷ hoàn toàn.
+ Dung huyết kiểu γ (hay còn gọi là không dung huyết): không làm biến ñổi thạch máụ
- Phản ứng với KOH: dùng que cấy nhựa, phết khuẩn lạc của vi khuẩn S. suis
mọc trên môi trường thạch máu lên một phiến kính sạch. Sau khi nhỏ 1 giọt dung dịch KOH 3% không thấy có hiện tượng tạo thành lớp keo dính giữa khuẩn lạc và
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 30 thuốc thử trong vòng 60 giây có nghĩa là chủng vi khuẩn kiểm tra ñược ñánh giá là phản ứng âm tính. Vi khuẩn S. suis cho phản ứng với KOH 3% âm tính.
- Phản ứng Catalase: thực hiện tương tự như trong phản ứng với KOH, chỉ khác là thay thuốc thử KOH 3% bằng dung dịch H2O2 3%. Nếu không quan sát thấy hiện tượng sủi bong bóng trong vòng vài giây có nghĩa là chủng vi khuẩn kiểm tra sẽñược ñánh giá là có phản ứng Catalase âm tính. Vi khuẩn S. suis cho phản ứng Catalase âm tính.
- Kiểm tra khả năng phát triển trong môi trường NaCl 6.5%: Chủng vi khuẩn cần kiểm tra ñược cấy vào môi trường NaCl 6.5%. Sau khi ủở tủấm 37oC trong 24 giờ, nếu quan sát không thấy môi trường có hiện tượng ñục là phản ứng âm tính. Vi khuẩn S. suis không phát triển trong môi trường NaCl 6.5% (phản ứng âm tính).
* Phương pháp thực hiện hệ thống API 20 Strep ñối với S. suis
Sau khi thực hiện phản ứng nhận biết cấp I, chỉ các chủng vi khuẩn ñược kết luận là S. suis mới ñược tiến hành các phản ứng với hệ thống ñịnh danh API 20 Strep.
Việc thực hiện hệ thống API20 Strep với các chủng vi khuẩn ñã ñược xác ñịnh là S. suis nhằm các mục ñích: ñịnh danh và giám ñịnh vi khuẩn S. suis; nghiên cứu một sốñặc tính sinh vật, hoá học của chúng.
Cách tiến hành như sau: mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra ñược cấy thành một lớp dày ñặc trên mặt ñĩa thạch máu Columbia, nuôi cấy ở 370C/24 giờ (5% CO2). Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch vi khuẩn từñĩa thạch, rồi hòa tan vào 2 ml nước cất vô trùng ñể ñạt ñược ñộ ñục tương ñương với ống số 4 của dãy so ñộñục chuẩn McFarland. Trong khay nhựa ñã có chứa các loại thuốc thử, tiến hành nhỏ khoảng 100µl huyễn dịch này vào mỗi lỗ ñối với các phản ứng từ VP ñến ADH. Phần huyễn dịch còn lại ñược trộn ñều với 1 ampule môi trường API GP có sẵn trong bộ kit thử và nhỏ vào các lỗ còn lại, từ ADH ñến GLYG. Toàn bộ khay nhựa có chứa các phản ứng ñược ñặt vào một giá nhựa có chứa khoảng 5 ml nước cất bên dưới ñể làm ẩm. Ủở tủấm 370C. Sau 4 giờ, tiến hành nhỏ các thuốc thử thích hợp: VP 1 và VP 2 ñối với phản ứng VP, NIN ñối với phản ứng HIP, ZYM A và ZYM B ñối với các phản ứng PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP, rồi tiến hành ñọc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 31 kết quả sau 10 phút. ðối với một số phản ứng, nếu kết quả chưa rõ ràng có thểñọc lại sau 24 giờ.
Cách ñọc kết quả: các phản ứng ñược ñánh giá là dương tính hay âm tính dựa vào một bảng so màu sẵn ñược cung cấp bởi nhà sản xuất, ñược tính ñiểm và mã hóa bằng các chữ số. Kết quả của mỗi chủng vi khuẩn, cuối cùng sẽ ñược hiển thị bằng một dãy số gồm 7 chữ số. Tiến hành tra bảng nhận biết ñể có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm tra thuộc loại vi khuẩn nàọ