- Môi trường phân lập vi khuẩn và tăng sinh: thạch BHI có bổ sung 5% máu c ừu hoặc máu bò; thạch chocolate; thạch TSA (Tryptone soya agar) có b ổ xung
2.4.4.Phương pháp xác ñị nh serotype của các chủng vi khuẩn phân lập ñượ c
2.4.4.1. Phương pháp xác ñịnh serotype của vi khuẩn Ạ pleuropneumoniae bằng phương pháp ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn
- Chuẩn bị kháng huyết thanh: Kháng huyết thanh chuẩn Ạ pleuropneumoniae
ñược pha loãng theo cơ số 2 thành: 1/2, 1/4, 1/8. Sau ñó ủ với protein A chiết xuất từẠ pleuropneumoniae theo tỷ lệ 1:5 trong thời gian 2 giờở 370C.
- Chuẩn bị kháng nguyên: Cấy vi khuẩn trên môi trường TSA trong thời gian 18 giờ, sau ñó thu hoạch với nước sinh lý.
- Tiến hành: Lấy 10 µl kháng huyết thanh chuẩn hòa lẫn với 10 µl kháng nguyên, trộn ñều trong vòng khoảng 5 giâỵ
- Kết quả: xuất hiện phản ứng ngưng kết lên bông: phản ứng dương tính, không xuất hiện ngưng kết: phản ứng âm tính.
2.4.4.2. Phương pháp xác ñịnh serotype của vi khuẩn S. suis
Các serotyp 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis thường gặp gây bệnh nhiều nhất ở lợn ñược xác ñịnh bằng phản ứng Multiplex PCR. Các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh các serotype 1, 2, 7 và 9 của S. suis ñược lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R ñể xác ñịnh serotyp 1, cps 2J-F và cps 2J-R ñể xác ñịnh serotyp 2, cps 7H-F và cps 7H-R ñể xác ñịnh serotyp 7, cps 9H-F và cps 9H-R ñể xác ñịnh serotyp 9. Trình tự các cặp mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng ñược trình bày ở bảng 2.2.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 32
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis
Serotype Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) 1 cps1J-F cps1J-R 5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3'
5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3' 637 2 cps2J-F
cps2J-R
5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3'
5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3' 498 7 cps7H-F
cps7H-R
5'-AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG-3'
5'-TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA-3' 379 9 cps9H-F
cps9H-R
5'-GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT-3'
5'-CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA-3' 303 Thành phần của phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh serotype của vi khuẩn S. suis ñược thực hiện với tổng thể tích là 25µl như ñược trình bày chi tiết trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần các chất trong phản ứng MP - PCR dùng ñể xác ñịnh một số gen mã hoá các yếu tố ñộc lực
Thành phần Thể tích (µl) Nồng ñộ
Mồi xuôi 1+1+1+1 3,2 µM/ µl
Mồi ngược 1+1+1+1 3,2 µM/ µl
Dung dich ñệm AMP x 5 gồm:
+ 750 mM Tris - HCl (pH=8) + 200mM (NH4)2SO4 + 0,1% (v/v) Tween 20 + dNTPs + 2mM MgCl2 5 - Taq – polymerase 0.05 500 UI Nước khử ion 12 - Tổng cộng 25 -
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 33 Chu kỳ nhiệt của phản ứng gồm:
Bảng 2.4. Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh một số gen mã hoá các yếu tố ñộc lực
Các giai ñoạn của phản ứng Nhiệt ñộ (oC) Thời gian (phút)
Số chu kỳ nhiệt Giai ñoạn tiền biến tính 94 5 1 Giai ñoạn biến tính Giai ñoạn bắt cặp Giai ñoạn tổng hợp 94 53 72 1 1 1,5 35 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giai ñoạn kéo dài 72 7 1