Phƣơng pháp phân lập và định lƣợng vi khuẩn có trong phế phẩm.
Cách thực hiện
Lấy 1 gói (viên) pha trong 10 ml nƣớc muối sinh lý 0.9%. Ta đƣợc huyền dịch 10o.
Tiến hành pha loãng theo tỉ lệ 1/10 ta đƣợc các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
Ở mỗi nồng độ, hút 100 µl cấy trải lên môi trƣờng MRS ủ 37oC/48h.
Đọc kết quả: Đếm tất cả các khuẩn lạc trong môi trƣờng, hộp đƣợc chọn có số khuẩn lạc từ 15-200 khúm/đĩa, áp dụng công thức sau để tính tổng số tế bào/ml dịch cấy.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 63 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Công thức tính: Tổng số vi khuẩn = (CFU/g; CFU/ml)
Sơ đồ: Quy trình nuôi cấy
100 µl 1 gói (g) mẫu + 10ml NaCl 0.9%
100
100 µl 100 µl 100 µl
900 µl NaCl 0,9% 10-1 10-2 10-3 10-4 Hút mỗi nồng nộ 100 µl huyền dịch cấy trải lên môi trƣờng MRS
10-1 10-2 10-3 10-4 Ủ trong tủ ấm 37oC/48h
Đếm khuẩn lạc
Nhuộm Gram xác định hình thái tế bào Cấy phân lập lại để giải trình tự
số khuẩn lạc trên đĩa thạch hệ số pha loãng x lƣợng mẫu cấy
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 64 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Chọn khuẩn lạc cấy zic-zắc trên MT MRS/37oC/48h. Bắt khuẩn lạc ly trích để giải trình tự.
Thực hiện phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn 550 bp của 16S. Ly trích phân tử DNA từ vi khuẩn nuôi cấy.
+ Nguyên tắc:
DNA của vi khuẩn đƣợc ly trích bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Dƣới tác dụng của tác nhân vật lý và nhiệt độ cao cùng với sự hỗ trợ của TE 1X, phân tử DNA đƣợc trích biệt ra khỏi tế bào. Sau khi ly tâm, thu hồi phần dịch nổi phía trên chứa DNA, còn Protein bám vào các hạt chelex lắng phía dƣới đáy nƣớc.
+ Cách tiến hành:
Cho vào tube 500 µl TE 1X, bắt khúm khuẩn lạc cho vào tube Eppendort trộn đều (độ đục 0.5-1 McF).
Vortex 10 giây, đun sôi 100oC trong 20 phút.
Vortex 10 giây, ly tâm 14800 RPM trong 15 phút
Hút dịch nổi sang tube mới.
Vortex cho đều, dùng 5 µl dịch nổi này cho một tube thử nghiệm PCR.