Giới thiệu về Probiotic :
Probiotic là một hay hỗn hợp sinh vật sống đƣợc dùng cho con ngƣời hay động vật dƣới dạng sản phẩm lên men hay tế bào khô, có ảnh hƣởng tích cực đến ngƣời hay động vật dùng, bằng cách cải thiện tính chất hệ vi sinh vật tại ống dạ dày, ruột (đƣờng uống), ống niệu sinh dục (đặt vào), ống hô hấp trên (dạng aerosol) và chống lại các tác nhân gây bệnh.
Probiotic là chất chứa các giống Lactobacillus, Bifidobacterium. Để trở thành Probiotic, vi sinh vật cần đạt đƣợc những tiêu chí nhƣ: tồn tại đƣợc trong môi trƣờng acid, sinh sản và định cƣ tốt trong ruột, vi sinh vật và các chất chuyển hóa hay sản phẩm của chúng không có khả năng gây bệnh, đột biến, gây độc hay ung thƣ với chủ thể. Chủng làm Probiotic cần có khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh hay ung thƣ, có đặc tính di truyền ổn định và không mang các yếu tố có thể truyền qua plasmid.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 55 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Probiotic đóng vai trò quan trọng đối với hệ miễn dịch của trẻ nhỏ. Khi tách ra khỏi cơ thể mẹ, trẻ phải dần tự thích nghi với môi trƣờng sống bên ngoài. Hệ miễn dịch của trẻ trong những năm tháng đầu đời là một hàng rào phòng ngự mong manh nên dễ bị vi khuẩn tấn công và xâm nhập. Ngƣợc lại, đƣờng ruột có nhiều Probiotic giúp kiềm chế các vi khuẩn có hại, bảo vệ bé khỏi các bệnh nguy hiểm, nhiễm khuẩn, dị ứng, chống táo bón… hoặc khỏi ốm nhanh hơn.
Có rất nhiều chủng Probiotic khác nhau, mỗi chủng có một công dụng riêng, phổ biến nhất là chủng A, B và C. Ngƣời ta thƣờng bổ sung các chủng này cho trẻ để nâng cao hệ miễn dịch đƣờng ruột của chúng.
Trên thực tế việc quản lý an toàn, vệ sinh, chất lƣợng trong sản xuất thuốc của ngành y tế nƣớc ta hiện nay còn là vấn đề khó khăn. Điều kiện sản xuất và kiểm tra chất lƣợng chƣa đƣợc quan tâm đúng mức. Do đó việc sử dụng các sản phẩm này không đạt đƣợc mục tiêu đề ra cũng ít nhiều ảnh hƣởng đến ngƣời tiêu dùng.
Chức năng của Lactobacillus acidophilus trong Probiotic:
Lactobacillus acidophilus có tác dụng tốt trong việc phòng và điều trị bệnh đƣờng ruột. Một hệ miễn dịch bị suy yếu sẽ làm giảm khả năng chống nhiễm khuẩn. Trong đƣờng ruột luôn có nhiều loại vi khuẩn ký sinh, tất cả sự tồn tại của những loài vi sinh vật này tạo nên thế cân bằng cho hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng làm giảm hội chứng nhạy cảm đƣờng ruột. Chúng có nhiệm vụ biến đổi thức ăn thành những chất dinh dƣỡng cung cấp cho cơ thể nhờ quá trình lên men. Nếu hệ vi sinh vật trong đƣờng ruột mất thế cân bằng, sẽ dẫn đến suy giảm chức năng tiêu hóa, thức ăn không đƣợc tiêu hóa hoàn toàn (phân sống, rối loạn hấp thu dinh dƣỡng), loạn khuẩn (tiêu chảy, táo bón). Nếu không kịp thời khắc phục sẽ để lại những tai biến về sau gây bệnh mãn tính dẫn đến suy dinh dƣỡng và giảm miễn dịch ở trẻ em.
Lactobacillus acidophilus sản xuất Acid lactic và Lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đƣờng ruột.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 56 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Lactobacillus acidophilus sản xuất ra men lactase, loại enzyme có khả năng phân hủy đƣờng sữa thành các loại đƣờng đơn giản. Những ngƣời có cơ địa không dung nạp lactose thì không sản xuất ra đƣợc enzyme này. Khi đó bổ sung Lactobacillus acidophilus
trở nên rất có ích. 3.2 Chọn sản phẩm Sản phẩm 1: Antibio 1g - Thành phần: Lactobacillus acidophilus - Hàm lƣợng vi khuẩn : 108 CFU/g - Lot : H006 - Date : NSX : 05/01/2010, HSD 07/01/2013
- Nhà sản xuất: công ty Co.Ltd, ĐC: 256 Gajeong Ri, Na-Yyem, Chungcheon-Si. Sản phẩm 2: Probio 1g
- Thành phần: Lactobacillus acidophilus - Hàm lƣợng vi khuẩn : 109 CFU/g - Lot : 951200
- Date : NSX : 14/01/2010, HSD 14/01/2012
- Nhà sản xuất: CTCP Dƣợc Phẩm IMEXPHARM, ĐC: số 4, đƣờng 30-94, TP Cao Lãnh, Đồng Tháp. Sản phẩm 3: L- Bio 1g - Thành phần: Lactobacillus acidophilus - Hàm lƣợng vi khuẩn : 108 CFU/g - Lot : 0010110 - Date : NSX : 05/01/2010, HSD 05/01/2012
- Nhà sản xuất: Công Ty Liên Doanh dƣợc Phẩm Mebiphar – Austraphar, ĐC: lô 111-18, đƣờng số 13, KCN Tân Bình
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 57 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC Sản phẩm 4: Biolac 500 mg - Thành phần: o Lactobacillus acidophilus o Lactobacillus sporogenes o Lactobacillus kefir
- Hàm lƣợng vi khuẩn mỗi loại: 2 x (106
– 107)/g - Lot : 261209
- Date : NSX : 12/2009, HSD 12/2012Nhà sản xuất: CT Vaccin và Sinh Phẩm Số 2, ĐC: 26 Hàn Thuyên, TP Nha Trang
3.3 Hóa chất
Hóa chất và môi trƣờng dùng phân lập vi khuẩn:
- Cồn 960
- Thuốc nhuộm Gram: Crystal violet, Lugol, Safranine - Nƣớc muối NaCl 0.9%
- Môi trƣờng nuôi cấy MRS
Hóa chất dùng khuếch đại gen 16S rDNA :
Hóa chất dùng để ly trích DNA
- Dung dịch TE 1X - Nƣớc cất vô trùng
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại gen 16S
- Master mix pha sẵn bao gồm: dNTP, Taq polymerase, PCR buffer. - MgCl2
- Mồi xuôi NTK -1(F 20 pm): TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA - Mồi ngƣợc NTK -2(F 20 pm): TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG - dUTP
- dd UNG
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 58 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hóa chất dùng cho phản ứng giải trình tự 16S rDNA:
Hóa chất dùng tinh sạch sản phẩm PCR
- Membrane Binding Solution: dung dịch gắn DNA vào màng. - Membrane Wash Solution: Dung dịch rửa màng.
- Nuclease-free Water: Nƣớc tinh sạch dùng để thoi DNA ra khỏi màng.
Hóa chất dùng điện di DNA trên gel agarose
- Agarose tinh khiết.
- Ethidium Bromide 10mg/ml. - Dung dịch điện di TBE 0.5X
- Dung dịch nạp mẫu chứa Glecerol và Bromophenol Blue.
- Thang chuẩn DNA marker 100 – 1000 bp có khoảng cách 100 bp.
Hóa chất dùng cho chu trình nhiệt giải trình tự
- Bigdye Terminator V.1.3 Cycle Sequencing Kit do hãng “Applied Biosystems” cung cấp bao gồm các thành phần sau:
*Bigdye: ddNTP: ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP. *bigdye buffer (MgCl2)
- Cuclease free water
- Mồi xuôi TVL – F (5 pm).
o Cấu trúc mồi xuôi: TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA - Mồi ngƣợc TVL – R (5 pm)
o Cấu trúc mồi ngƣợc: TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG (cấu trúc mồi do hãng Oligo cung cấp)
- DNA (mẫu)
Hóa chất dùng tủa sản phẩm giải trình tự
- Ethanol 100% - Ethanol 70%
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 59 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
- Bigdye Terminator V.1.3 Cycle Sequencing Kit do hãng “Applied Biosystems” cung cấp bao gồm các thành phần sau:
- Sodium acetate - Hi-di.
3.4 Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ và thiết bị nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
- Tăm bông vô trùng
- Que cấy vòng nhựa vô trùng
- Micropipette (10 - 200µl, 100 -1000 µl) tube nhựa vô trùng (1.5 ml, 15ml), đầu col vô trùng, hộp petri, lam, dầu soi kính.
- Khẩu trang, găng tay - Tủ cấy vô trùng - Tủ ấm
- Kính hiển vi
- Tube Eppendorf nắp khóa 1.5 ml, loại vô trùng - Tủ đông -200C, -700C, -40C, tủ lạnh 4-80C - Máy vortex
Hình 3.3: Tủ cấy, dụng cụ nuôi cấy và kính hiển vi
Dụng cụ và thiết bị ly trích DNA
- Tube Eppendorf nắp khóa 1,5ml, loại vô trùng. - Máy ly tâm nhẹ MiniSpin-Eppendorf
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 60 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
- Bếp điện
- Cốc thủy tinh 1000 ml
- Micropipette ( 1-10µl, 100 -1000 µl), đầu col vô trùng
Hình 3.4: Máy ly tâm và bếp điện từ
Dụng cụ và thiết bị cho phản ứng khuếch đại gen 16S
- Máy vortex
- Máy luân nhiệt iCycler-Biorad (PCR)
Hình 3.5: Máy chạy PCR
Dụng cụ và thiết bị dùng tinh sạch sản phẩm PCR
- Tube Eppendorf nắp khóa 1,5 ml, loại vô trùng. - Máy ly tâm nhẹ MiniSpin-Eppendorf
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 61 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Dụng cụ và thiết bị điện di DNA trên gel agarose
- Bộ điện di ngang I-Mupidj
- Máy chụp hình gel/CHEMI Doc-Biorad
Hình 3.6: Bộ điện di Agarose
Hình 3.7: Máy chụp hình gel CHEMI Doc-Biorad
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 62 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
- Máy luân nhiệt iCycler-Biorad (PCR).
- Micropipette (1-10µl, 100 -1000 µl), đầu col vô trùng
Dụng cụ và thiết bị dùng tủa sản phẩm giải trình tự
- Máy hút chân không. - Máy ủ nhiệt
- Micropipette (1-10µl, 100 – 1000 µl), đầu col vô trùng.
Dụng cụ và thiết bị giải trình tự gen.
- Máy ABI 3130 XL của Applied Biosystem
Hình 3.8: Máy ABI 3130 XL của Applied Biosystem
3.5 Phƣơng pháp tiến hành
Phƣơng pháp phân lập và định lƣợng vi khuẩn có trong phế phẩm.
Cách thực hiện
Lấy 1 gói (viên) pha trong 10 ml nƣớc muối sinh lý 0.9%. Ta đƣợc huyền dịch 10o.
Tiến hành pha loãng theo tỉ lệ 1/10 ta đƣợc các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
Ở mỗi nồng độ, hút 100 µl cấy trải lên môi trƣờng MRS ủ 37oC/48h.
Đọc kết quả: Đếm tất cả các khuẩn lạc trong môi trƣờng, hộp đƣợc chọn có số khuẩn lạc từ 15-200 khúm/đĩa, áp dụng công thức sau để tính tổng số tế bào/ml dịch cấy.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 63 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Công thức tính: Tổng số vi khuẩn = (CFU/g; CFU/ml)
Sơ đồ: Quy trình nuôi cấy
100 µl 1 gói (g) mẫu + 10ml NaCl 0.9%
100
100 µl 100 µl 100 µl
900 µl NaCl 0,9% 10-1 10-2 10-3 10-4 Hút mỗi nồng nộ 100 µl huyền dịch cấy trải lên môi trƣờng MRS
10-1 10-2 10-3 10-4 Ủ trong tủ ấm 37oC/48h
Đếm khuẩn lạc
Nhuộm Gram xác định hình thái tế bào Cấy phân lập lại để giải trình tự
số khuẩn lạc trên đĩa thạch hệ số pha loãng x lƣợng mẫu cấy
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 64 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Chọn khuẩn lạc cấy zic-zắc trên MT MRS/37oC/48h. Bắt khuẩn lạc ly trích để giải trình tự.
Thực hiện phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn 550 bp của 16S. Ly trích phân tử DNA từ vi khuẩn nuôi cấy.
+ Nguyên tắc:
DNA của vi khuẩn đƣợc ly trích bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Dƣới tác dụng của tác nhân vật lý và nhiệt độ cao cùng với sự hỗ trợ của TE 1X, phân tử DNA đƣợc trích biệt ra khỏi tế bào. Sau khi ly tâm, thu hồi phần dịch nổi phía trên chứa DNA, còn Protein bám vào các hạt chelex lắng phía dƣới đáy nƣớc.
+ Cách tiến hành:
Cho vào tube 500 µl TE 1X, bắt khúm khuẩn lạc cho vào tube Eppendort trộn đều (độ đục 0.5-1 McF).
Vortex 10 giây, đun sôi 100oC trong 20 phút.
Vortex 10 giây, ly tâm 14800 RPM trong 15 phút
Hút dịch nổi sang tube mới.
Vortex cho đều, dùng 5 µl dịch nổi này cho một tube thử nghiệm PCR.
3.5.1 Phƣơng pháp chạy PCR
+ Nguyên tắc:
PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt.
Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: đầu tiên nhiệt độ sẽ đƣợc đƣa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mờ đi, DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn.
Giai đoạn bắt cặp: sau đó nhiệt độ đƣợc hạ xuống 55o
- 65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 65 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Giai đoạn tổng hợp (giai đoạn kéo dài): Nhiệt độ đƣợc đƣa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo dài các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Bảng 3.2: Cách pha PCR mix
STT Tên hóa chất Nồng độ / 1 mix Thể tích hút / 1 mix
1 PCR buffer 1X 5 µl
2 MgCl2 1,5mM 1.5 µl
3 Taq polymerase 1,25U 0.25 µl
4 dNTP 200 µM/each 0.4 µl 5 Primer F 20 pm 0.2 µl 6 Primer R 20 pm 0.2 µl 7 dUTP 200 µM 0.1 µl 8 UNG 1 U 1.0 µl 9 H2O Thêm đủ 45 µl 36.35 µl 10 Mẫu 5 µl 5 µl
Lƣu ý: Khi pha mix tính toán sao cho thể tích hút nhỏ nhất là 1 µl để tránh sai số do thể tích quá nhỏ hút không chính xác. Do đó khi pha mix nên pha từ 10 mix trở lên. [1]
+ Cách tiến hành:
o Cho 5 µl mẫu trích biệt DNA vào tube PCR mix chứa sẵn 45 µl thuốc thử PCR mix. o Chạy chƣơng trình luân nhiệt sau:
o Chu kỳ 01 (1 chu kỳ): 95oC trong 10 phút o Chu kỳ 02 (40 chu kỳ):
94oC trong 30 giây 60oC trong 30 giây 72oC trong 01 phút
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 66 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
o Chu kỳ 03 (1 chu kỳ): 72oC trong 10 phút.
Kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng phƣơng pháp điện di + Nguyên tắc:
Phƣơng pháp dựa vào đặc tính cấu trúc của các Acid nucleotide. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt, nên khi chịu tác động của điện từ trƣờng, chúng sẽ di chuyển về hƣớng cực dƣơng. Sự di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng và tỷ số điện tích khối lƣợng, nhờ đó các chất khác nhau sẽ đƣợc tách ra thành từng vết riêng và đƣợc phát hiện bằng cách điện di trên gel.
+ Cách tiến hành:
o Chuẩn bị dung dịch TBE 0,5X: Trong một bình thủy tinh 1 lít, thêm 50ml TBE 10X vào 950ml nƣớc cất.
o Chuẩn bị gel agarose nồng độ 2%:
Trong một bình thủy tinh 500ml, thêm 4g agarose vào 200ml TBE 0,5X.
Đun trong lò viba (quan sát sự hòa tan agarose trong một phút cho đến khi tan chảy hoàn toàn)
o Tiếp theo, hút than hoạt tính pha hóa chất:
Chuyển agarose tan chảy vào bình thủy tinh khác, chờ đến khi nhiệt độ hạ xuống 55oC– 65oC.
Khi đó thêm 8 µl ethidium bromide 10mg/l, trộn đều, tránh tạo bọt khí. Đổ dung dịch vào khuôn gel có gắn lƣợc để tạo thành những miếng nhỏ.
Để gel đông và ổn định trong 30 – 40 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau đó rút lƣợc ra khỏi khuôn.
o Chạy gel điện di:
o Chuẩn bị mẫu: trên màng nhựa mỏng hoặc trên nắp đĩa nhỏ, thêm 2 µl dung dịch loading 5X (bromphenol blue/TE/50% glycerol) khi đó thêm 5 µl mẫu, trộn đều.
o Chạy gel agarose điện di:
Đặt khay gel vào bồn điện di (đầu có răng lƣợc để gần cự cathode – cực âm). Đổ TBE 0.5X vào bồn điện di đến khi mức nƣớc cao hơn mặt gel khoảng 2mm. Dùng
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 67 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
pipette hút hỗn hợp mẫu và thuốc thử cho vào mỗi miếng lƣợc của gel. Phải chừa một vị trí cho mẫu DNA.
Kết nối bồn điện di với nguồn điện. Chạy điện di với hiệu điện thế 135V trong 20 – 30 phút cho đến khi bromphenol blue di chuyển xa 3 cm, tắt nguồn điện, đọc kết quả dƣới hộp đèn UV, bƣớc sóng 312 nm.
3.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rDNA
Tinh sạch sản phẩm PCR + Nguyên tắc:
Sản phẩm PCR trƣớc khi thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình tự thì phải đƣợc làm tinh sạch để loại bỏ các primer thừa và các hóa chất của PCR mix còn dƣ không sử dụng hết.
Có nhiều phƣơng pháp làm tinh sạch sản phẩm PCR. Ở đây dùng bộ kit Wizaard SV Gel và PCR Clean up System của Promega. Kit này hoạt động trên nguyên tắc sử dụng màng lọc silica để tóm bắt DNA trong dung dịch.