Tinh sạch sản phẩm PCR + Nguyên tắc:
Sản phẩm PCR trƣớc khi thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình tự thì phải đƣợc làm tinh sạch để loại bỏ các primer thừa và các hóa chất của PCR mix còn dƣ không sử dụng hết.
Có nhiều phƣơng pháp làm tinh sạch sản phẩm PCR. Ở đây dùng bộ kit Wizaard SV Gel và PCR Clean up System của Promega. Kit này hoạt động trên nguyên tắc sử dụng màng lọc silica để tóm bắt DNA trong dung dịch.
+ Phƣơng pháp:
o Ứng với mỗi thể tích sản phẩm PCR, cho dung dịch MBS vào tube mẫu (theo tỷ lệ 1:1), trộn đều.
o Lấy 1 cột SV (SV minicolumn) đặt vào một tube thu nhận (collection tube).
o Cho hỗn hợp mẫu cần phải tinh sạch vào cột SV, ủ ở phòng thí nghiệm trong 1 phút để DNA bám vào màng.
o Đặt tube thu nhận chứa cột SV vào máy ly tâm và ly tâm 13000 RPM trong 1 phút. o Lấy cột SV khỏi tube thu nhận và đổ bỏ dung dịch thu đƣợc trong tube thu nhận, cho cột SV vào lại tube thu nhận.
o Cho 700 µl dung dịch rửa màng MWS vào cột SV, ly tâm 13000 RPM trong 1 phút để rửa cột.
o Lấy cột SV khỏi tube thu nhận và đổ bỏ dung dịch thu đƣợc trong tube thu nhận, đồng thời lấy giấy thấm thấm khô đầu tube thu nhận, cho cột SV vào lại tube thu nhận.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 68 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
o Rửa lại cột một lần nữa với 500 µl dung dịch rửa màng MWS bằng ly tâm 13000 RPM trong 5 phút.
o Lấy cột SV ra khỏi tube thu nhận, cẩn thận tránh cột SV bị ƣớt với dung dịch rửa màng thu đƣợc trong tube thu nhận.
o Đổ bỏ dịch rửa màng trong tube thu nhận, chấm giấy cho khô đầu tube.
o Đặt cột SV vào lại tube thu nhận rồi ly tâm 13000 RPM trong 01 phút nữa để làm khô ethanol thừa khỏi cột.
o Cẩn thận lấy cột SV khỏi tube thu nhận và đặt cột vào tube Eppendorf 1,5ml hay 2ml tinh sạch.
o Bỏ tube thu nhận, cho vào cột 20 µl nƣớc tinh sạch (nuclease- free water).
o Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm từ 1 đến 5 phút, ly tâm 13000 RPM trong 1 phút để thu dịch thoi DNA khỏi cột vào tube Eppendorf.
o Bỏ cột SV, đậy chặt tube chứa dung dịch DNA và giữ tube ở 2o – 8o C hay -20oC cho đến khi sử dụng.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 69 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.9: Các bƣớc tinh sạch DNA
Đo độ tinh sạch và nồng độ DNA cho phản ứng PCR mix giải trình tự
+ Nguyên tắc:
Phƣơng pháp dựa trên nguyên tắc: DNA hấp thụ ánh sang tối đa ở các bƣớc sóng 260 nm của mẫu, độ hấp thu càng lớn, nồng độ DNA trong mẫu càng cao. Eppendorf là một máy đo hấp thụ ánh sang của dung dịch acid nucleotide ở 4 bƣớc sóng (230 nm, 260 nm, 280 nm, 320 nm) từ đó suy ra nồng độ acid nucleotide (ng/µl) có trong dung dịch và độ tinh sạch của acid nucleotide đó (khi đo tỉ lệ OD 260/OD 280 nằm từ 1,8 – 2,0).
Chuẩn bị sản phẩm PCR
Chuẩn bị sản phẩm PCR
Rửa và bỏ dịch sau ly tâm
Tách rửa DNA Ly tâm 13000 RPM
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 70 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
+ Cách tiến hành:
o Sau khi thực hiện khởi động máy Eppendorf. o Chọn chƣơng trình đo DNA
o Cho nƣớc cất vào vị trí đo mẫu, nhấn nút đọc blank.
o Mẫu blank máy đọc đạt, lấy giấy lau khô chỗ đọc mẫu, tiếp tục cho mẫu vào nhấn sample đợi máy đọc và ghi kết quả.
Phản ứng chu kỳ giải trình tự sản phẩm
+ Nguyên tắc:
o Trực tiếp dùng mồi giải trình tự đặc hiệu với đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lƣợng rất giới hạn các nucleotide tận đƣợc đánh dấu bằng bốn màu huỳnh quang khác nhau cho bốn loại nucleotide tận (ddNTP: có 4 loại ddNTP tƣơng ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng chỉ thực hiện trong một ống. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA cần giải trình tự và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đƣờng deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp gắn vào.
o Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tƣơng ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc. Các mạch đơn này đƣợc đánh dấu với bôn màu huỳnh quang khác nhau tùy thuộc vào nucleotide tận cùng ở đầu 3’ là đoạn nào. Chính nhờ đƣợc đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau mà khi điện di mao quản, mỗi mạch đơn đi qua con mắt cảm quan sẽ đƣợc mắt cảm quan ghi nhận đƣợc nucleotide tận của mạch đơn đó là loại nào và từ đó phân tích đƣợc trình tự nucleotide của đoạn DNA đƣợc giải trình tự.
Pha mix PCR chảy phản ứng chu kỳ giải trình tự:
o BigDye Terminator : 1 µl
o Mồi giải trình tự (5pmol/µl) : 0.7 µl o BigDye Buffer : 3.5 µl o DNA cần giải trình tự đã tinh sạch : 1 µl
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 71 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
o Nƣớc cất cho đủ : 20 µl
o Sau khi cho đủ các thành phần vào tube, ly tâm cho nƣớc xuống đáy hết trong vài giây.
Chạy chƣơng trình chu kỳ nhiệt giải trình tự trong máy luân nhiệt:
o Chu kỳ 1 : 96oC trong 20 giây o Chu kỳ 2 : 50oC trong 20 giây o Chu kỳ 3 : 60oC trong 04 phút
o Lặp lại 3 chu kỳ trong 30 lần, sau đó giữ ở 4oC
o Đây là chƣơng trình luân nhiệt đƣợc nhà sản xuất nghiên cứu tối ƣu, do vậy chúng ta không nên thay đổi mà phải thiết kế mồi giải trình tự để nhiệt độ bắt cặp khoảng 50oC.
Tủa sản phẩm của phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự:
o Hút 2 µl EDTA 0,125 M; 2 µl Sodium Acetate 3M; 60 µl Ethanol 100% và 20 µl sản phẩm sau khi chạy PCR sequencing, tổng 1 phản ứng là 84 µl.
o Để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng. o Đem ly tâm 1700 RPM/20 phút.
o Sau đó úp ngƣợc giếng để bỏ dịch nổi, ly tâm 300 RPM/12 phút. o Thêm 85 µl Ethanol 70% và ly tâm 1700 RPM/15 phút.
o Úp ngƣợc giếng thêm một lần nữa để bỏ dịch nổi, ly tâm 300 RPM/1 phút. o Đổ bỏ ethanol dƣ rồi sấy khô bằng máy hút chân không khoảng 10 phút.
o Cho 20 µl Hi-di, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào máy giải trình tự.
Chạy điện di giải trình tự:
o Giải trình tự trên máy ABI 3130XL của Applied Biosystem.
o Nguyên tắc: dựa vào phƣơng pháp điện di mao quản, do phân tử DNA tích điện âm nên di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng, và các mạch đơn đƣợc đánh dấu bằng bốn màu huỳnh quang khác nhau đặc trƣng cho 4 loại nucleotide ở các nucleotide tận cùng ở đầu 3’. Khi phân tử DNA di chuyển qua bộ phận cảm quan đƣợc máy tính ghi nhận lại và mã hóa thành trình tự của các Nucleotide, tín hiệu đƣợc lƣu giữ ở dạng file fasta và đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit từ đó suy ra đƣợc trình tự các nucleotide trên phân tử DNA.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 72 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Phƣơng pháp định danh vi khuẩn dựa vào chuỗi trình tự 16S trên gene bank:
Trình tự DNA của các vi khuẩn giải đƣợc, đƣợc dò trên gen bank trên trang web NCBI Blast search để xác định độ tƣơng đồng với các trình tự trên gen bank nhằm xác định có phải sản phẩm PCR khuếch đại từ DNA là vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
hay không.