+ Nguyên tắc:
PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt.
Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: đầu tiên nhiệt độ sẽ đƣợc đƣa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mờ đi, DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn.
Giai đoạn bắt cặp: sau đó nhiệt độ đƣợc hạ xuống 55o
- 65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 65 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Giai đoạn tổng hợp (giai đoạn kéo dài): Nhiệt độ đƣợc đƣa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo dài các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Bảng 3.2: Cách pha PCR mix
STT Tên hóa chất Nồng độ / 1 mix Thể tích hút / 1 mix
1 PCR buffer 1X 5 µl
2 MgCl2 1,5mM 1.5 µl
3 Taq polymerase 1,25U 0.25 µl
4 dNTP 200 µM/each 0.4 µl 5 Primer F 20 pm 0.2 µl 6 Primer R 20 pm 0.2 µl 7 dUTP 200 µM 0.1 µl 8 UNG 1 U 1.0 µl 9 H2O Thêm đủ 45 µl 36.35 µl 10 Mẫu 5 µl 5 µl
Lƣu ý: Khi pha mix tính toán sao cho thể tích hút nhỏ nhất là 1 µl để tránh sai số do thể tích quá nhỏ hút không chính xác. Do đó khi pha mix nên pha từ 10 mix trở lên. [1]
+ Cách tiến hành:
o Cho 5 µl mẫu trích biệt DNA vào tube PCR mix chứa sẵn 45 µl thuốc thử PCR mix. o Chạy chƣơng trình luân nhiệt sau:
o Chu kỳ 01 (1 chu kỳ): 95oC trong 10 phút o Chu kỳ 02 (40 chu kỳ):
94oC trong 30 giây 60oC trong 30 giây 72oC trong 01 phút
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 66 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
o Chu kỳ 03 (1 chu kỳ): 72oC trong 10 phút.
Kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng phƣơng pháp điện di + Nguyên tắc:
Phƣơng pháp dựa vào đặc tính cấu trúc của các Acid nucleotide. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt, nên khi chịu tác động của điện từ trƣờng, chúng sẽ di chuyển về hƣớng cực dƣơng. Sự di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng và tỷ số điện tích khối lƣợng, nhờ đó các chất khác nhau sẽ đƣợc tách ra thành từng vết riêng và đƣợc phát hiện bằng cách điện di trên gel.
+ Cách tiến hành:
o Chuẩn bị dung dịch TBE 0,5X: Trong một bình thủy tinh 1 lít, thêm 50ml TBE 10X vào 950ml nƣớc cất.
o Chuẩn bị gel agarose nồng độ 2%:
Trong một bình thủy tinh 500ml, thêm 4g agarose vào 200ml TBE 0,5X.
Đun trong lò viba (quan sát sự hòa tan agarose trong một phút cho đến khi tan chảy hoàn toàn)
o Tiếp theo, hút than hoạt tính pha hóa chất:
Chuyển agarose tan chảy vào bình thủy tinh khác, chờ đến khi nhiệt độ hạ xuống 55oC– 65oC.
Khi đó thêm 8 µl ethidium bromide 10mg/l, trộn đều, tránh tạo bọt khí. Đổ dung dịch vào khuôn gel có gắn lƣợc để tạo thành những miếng nhỏ.
Để gel đông và ổn định trong 30 – 40 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau đó rút lƣợc ra khỏi khuôn.
o Chạy gel điện di:
o Chuẩn bị mẫu: trên màng nhựa mỏng hoặc trên nắp đĩa nhỏ, thêm 2 µl dung dịch loading 5X (bromphenol blue/TE/50% glycerol) khi đó thêm 5 µl mẫu, trộn đều.
o Chạy gel agarose điện di:
Đặt khay gel vào bồn điện di (đầu có răng lƣợc để gần cự cathode – cực âm). Đổ TBE 0.5X vào bồn điện di đến khi mức nƣớc cao hơn mặt gel khoảng 2mm. Dùng
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 67 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
pipette hút hỗn hợp mẫu và thuốc thử cho vào mỗi miếng lƣợc của gel. Phải chừa một vị trí cho mẫu DNA.
Kết nối bồn điện di với nguồn điện. Chạy điện di với hiệu điện thế 135V trong 20 – 30 phút cho đến khi bromphenol blue di chuyển xa 3 cm, tắt nguồn điện, đọc kết quả dƣới hộp đèn UV, bƣớc sóng 312 nm.