Phƣơng pháp chính xác và đƣa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phƣơng pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tƣơng đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phƣơng pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tƣợng nghiên cứu. Các gene bảo thủ đƣợc giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tƣơng đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng nhƣ xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau.
+ Nguyên tắc:
Phƣơng pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN đƣợc đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu đƣợc tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh đƣợc phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phƣơng pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid đƣợc trình bày theo 2 phƣơng pháp: phƣơng pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phƣơng pháp enzyme kết thúc
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 37 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phƣơng pháp enzyme đƣợc dùng phổ biến hơn cả.
+ Phƣơng pháp enzyme kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger:
Phƣơng pháp kết thúc phản ứng chuỗi đƣợc thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Nhƣ vậy, có 4 phản ứng đƣợc tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự ADN đƣợc xác định trên gel.
+ Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger:
Có hai phƣơng pháp: Phƣơng pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phƣơng pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang).
- Phƣơng pháp truyền thống:
Các bƣớc chính cho giải trình tự ADN nhƣ sau: Chuẩn bị ADN khuôn
Bắt cặp ADN khuôn và mồi
Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN
Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả.
Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn.
2. Điều kiện bắt cặp mồi.
3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 38 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
5. Đọc kết quả.
* Một số phƣơng pháp cụ thể thƣờng đƣợc dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN. Phƣơng pháp 1: Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phƣơng pháp đƣợc trình bày dƣới đây là phƣơng pháp thu đƣợc plasmid có độ tinh sạch cao, có thể dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến phƣơng pháp sử dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử dụng sắc ký qua cột trao đổi ion. Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phƣơng pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động. Tuy vậy, nhiều ngƣời vẫn thích sử dụng cột trao đổi ion, kết quả có thể đọc đƣợc tới 600 bps hoặc nhiều hơn nữa.
Quá trình tinh sạch nhƣ sau:
+ Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trƣờng chọn lọc với kháng sinh tƣơng ứng (khoảng 3 ml).
1, Phân 3 ml môi trƣờng LB chứa 100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm vô trùng (12X100 nm có nút).
2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa và làm nguội trên mặt đĩa thạch.
3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc và đƣa vào ống nghiệm chứa môi trƣờng nuôi cấy trên.
4, Nuôi cấy vi khuẩn 37oC qua đêm có lắc vừa phải. + Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene:
Các cột Qiagene đƣợc chuẩn bị dễ dàng và nhanh để tinh sạch ADN không cần dùng gradient CsCl. ADN đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp này đạt kết quả rất tốt cho việc biến nạp và giải trình tự gene.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 39 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
(1) Không sử dụng quá nhiều mẫu lên cột, điều này rất quan trọng vì nếu dùng thể tích quá nhiều kết quả là sẽ có nhiều protein ảnh hƣởng đến khả năng bám cột của ADN. Với cách này có thể nhận đƣợc lƣợng ADN có chất lƣợng cao hơn từ thể tích ít hơn. Nếu nhƣ lƣợng ADN thu đƣợc ít từ lần thử đầu tiên thì cần thực hiện đúng theo chỉ dẫn để lần thử thứ 2 với thể tích lớn hơn. Khi có một loạt thể tích mẫu đƣợc Quiagene khuyến cáo lên cột để đạt đƣợc hiệu suất tinh sạch cao nhất thì nên dùng lƣợng dịch lên cột có thể tích nhỏ nhất.
(2) Đảm bảo cột phải đƣợc rửa hai lần trƣớc khi giải phóng ADN ra khỏi cột, điều này cũng rất có ý nghĩa vì việc rửa nhƣ vậy sẽ loại trừ đƣợc protein và các thành phần tạp nhiễm khác. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Các bƣớc dùng cột trao đổi Qiagene (tài liệu hƣớng dẫn sử dụng Quiagene): 1. Ly tâm khoảng 1,3 ml dịch vi khuẩn mang plasmid. Làm tan với 0.3 ml đệm P1 có RNase, chuyển sang tube mới.
2. Thêm vào 0.3 ml đệm P2 và trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút (không nên để lâu hơn).
3. Thêm vào 0.3 ml đệm P3 trộn đều ngay nhƣng phải nhẹ nhàng, ly tâm ở 4oC trong 30 phút với tốc độ 15000 v/phút. Thu lấy phần trên tủa.
4. Ly tâm lại nhƣ bƣớc 3 một lần nữa để loại các phần cặn nếu có.
5. Cân bằng đệm cho cột Qiagene-tip 20 với 1ml QBT và để cho đệm chảy hết tự do.
6. Đƣa phần dịch thu đƣợc ở bƣớc 4 lên cột và để tự chảy qua cột. 7. Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC.
8. Thu ADN với 0.8 ml đệm QF
9. Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol (trƣớc đó đƣa về nhiệt độ phòng), ly tâm 15000 v/phút tại 4oC
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 40 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
10. Rửa ADN thu đƣợc với ethanol 70%, để khô 5 phút và hoà tan lại trong thể tích đệm thích hợp (25ml). Chú ý trong trƣờng hợp mẫu dùng cho giải trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu trong nƣớc.
Nói chung sử dụng cột Qiagene thu đƣợc trên 90% ADN và thƣờng đƣợc dùng cho tinh sạch Plasmid và cosmit (kích thƣớc dƣới 2 Kbs đến lớn hơn 50 Kbs). Số lƣợng plasmid thu nhận đƣợc từ tế bào E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào chủ, loại plasmid từ thấp trung bình đến số lƣợng plamid cao và điều kiện nuôi cấy (có thể tham khảo tài liệu liên quan từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số lƣợng tế bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thƣớc cột).
Chú ý cách làm sạch và tái sử dụng cột: 1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm. 2, Bỏ ethanol và ly tâm lại một lần nữa. 3, Lặp lại bƣớc 1 và 2 với nƣớc cất.
4, Giữ cột ở trạng thái khô cho đến lần sử dụng về sau.
(Cột có thể đƣợc dùng cho nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN dùng cho tách dòng thì nên dùng cột mới).
Phƣơng pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN Giới thiệu chung:
Phƣơng pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất.
Điều quan trọng nhất là các bản kính phải đƣợc rửa sạch tuyệt đối.
1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nƣớc nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tƣơng đƣơng. Sau đó rửa sạch lại bằng nƣớc.
2, Rửa các bản kính với nƣớc trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 41 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó kính đƣợc lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính.
3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nƣớc đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng của bản kính.
4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí.
5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig). Trộn đều hỗn dịch:
16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%. 5 ml 10X TBE
70 ml 10M Urea (46 gam)
Đƣa đến thể tích 100 ml với nƣớc
Cho vào 800 μl 10% Ammonium persulphat. 50 μl TEMED.
Quá trình polyme hóa đƣợc thực hiện trong 15 -20 phút.
Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55oC, nhiệt độ cao hơn 55oC sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ƣu điểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhƣng việc chạy gel thì cũng nhƣ gel có nồng độ thấp thông thƣờng, ví dụ LR gel 5% tƣơng đƣơng 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thƣờng, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một số chú ý khi thao tác:
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 42 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
b. Hút dịch acrylamid bằng pitpet hay có thể dùng cốc đong.
c. Đặt bản kính nghiêng 15o và đổ gel bằng cốc đong hay pipet. Kiểm soát tốc độ đổ gel bằng góc nghiêng. Tránh để dòng gel khi đổ ngắt quãng vì điều này sẽ dẫn đến tạo bọt. Nếu phải dừng lại để hút dịch mới vào syringer thì lúc đó phải hạ dần bản kính xuống vị trí nằm ngang trƣớc khi dừng đổ gel. Sau đó lấy dịch gel mới vào syringer và tiếp tục đổ gel trƣớc khi gel lên khỏi vị trí nằm ngang. Cứ thao tác nhƣ vậy đến khi đổ đầy bản gel.
6, Đặt gel nằm ngang và đƣa cạnh bằng của lƣợc răng cá mập vào gel, tạo một góc hơi nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã đặt cạnh bằng của lƣợc vào phía trên của gel và phần răng cá mập sẽ nằm dọc theo đỉnh của bản kính dài (lƣợc sẽ nằm ngƣợc với vị trí trong hình 1.10). Bổ sung thêm gel và đẩy thêm lƣợc vào đúng vị trí và cố định lƣợc lại bằng kẹp để tránh xê dịch.
7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không khí. Ngoài ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều này giữ cho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở quá trình polyme hóa).
8, Quá trình polyme xảy ra từ 30 phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóa có thể hút một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá trình polyme hóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào ống falcon và đậy chặt nắp lại, trong nhiều trƣờng hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặc nhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì lại phải tiến hành rửa kính và đổ lại gel.
9, Chuẩn bị gel trƣớc khi chạy: a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel.
b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn là đã cắt bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra.
c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dƣới của thiết bị, lƣợng đệm cần phải đủ để cho bản gel nằm trong đệm.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 43 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
d. Đổ đệm vào bể trên của thiết bị, đảm bảo gel nằm dƣới lớp đệm. Kiểm tra xem đệm có bị chảy ra hay không.
e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu điện thế 2000V (phải cẩn thận vì rất nguy hiểm), sau đó nhiệt độ của bản gel nên đạt tới 50oC.
10, Xử lý nhiệt với các mẫu ADN điện di tại 85oC trong 5 hút và trộn đều, để trên đá cho đến khi lên mẫu.
11, Tắt nguồn điện vào thiết bị điện di (nhớ ngắt nguồn điện vào thiết bị trong bất kỳ trƣờng hợp nào khi thao tác với thiết bị).
12, Trong khi xử lý nhiệt với các mẫu thì rửa bề mặt với đệm trong bể điện di, dùng pipet hay syringer 60 ml. Mục đích của thao tác này là loại lớp urea trên bề mặt gel.
13, Đánh dấu vị trí đỉnh của mặt gel trên bản kính trƣớc của gel.
14, Đặt lƣợc răng cá mập lên mặt gel, các răng đƣợc đặt trên mặt gel và ngập sâu vào mặt gel khoảng 1 mm. Chắc chắn là vùng không gian giữa các răng đƣợc giới hạn giữa các răng và gel. Nhƣ vậy phần lƣợc răng cá mập trở thành các cạnh bên của giếng, bề mặt gel là đáy của giếng tra mẫu (hình 2.9).
Hình 2.9: Vị trí đặt lƣợc sau khi đổ gel
Phải đảm bảo chắc chắn đã làm sạch bề mặt gel trƣớc khi đặt lƣợc răng cá mập lên trên gel. Nếu không thực hiện việc này sẽ không đọc đƣợc phần kết quả phía trên của gel. Nếu quyên thực hiện bƣớc này có thể rửa sạch từng giếng tra mẫu nhƣng việc này sẽ khó khăn hơn. Nếu lên nhiều mẫu thì trƣớc đó cần phải phải làm sạch giếng vì urea sẽ khuếch tán và tích tụ tại bề mặt gel tại thời điểm lên mẫu.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 44 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
15, Việc xử lý nhiệt ở 85oC đối với các mẫu điện di nhằm làm biến tính ADN, chỉ lên khoảng 2-4 ml mẫu cho mỗi giếng (lên mẫu theo thứ tự ACGT), có thể dùng bút để viết lên kính nhằm tránh nhầm lẫn.
16, Quá trình điện di với hiệu điện thế 2000V cho đến khi màu BPB (Bromophenolblue) di chuyển đến tận cùng bảng gel (1-2 giờ). Nếu chạy gel có gradient muối sẽ cho phép đọc đƣợc nhiều base hơn trên một gel do việc làm ngắn lại khoảng cách giữa các băng ADN ở phần cuối bản gel. Nên dừng điện di từ 45 phút – 1 giờ. Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2 thể tích 3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn đều. Lại tiếp tục công việc chạy gel cho đến khi BPB di chuyển đến cuối bản gel. Chú ý sự có mặt của muối nồng độ cao sẽ dẫn đến nhiệt độ tăng, do đó cần phải kiểm soát nhiệt độ của quá trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính và hỏng gel.
Chuẩn bị gel cho phát hiện bằng ảnh phóng xạ.
17, Lấy bản gel ra khỏi thiết bị, chú ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, các nucleotid dƣ sẽ đi ra khỏi bản gel.
18, Đổ bỏ bể đệm trên.
19, Đặt bản gel trên bàn thí nghiệm sao cho tấm kính ngắn lên trên. Phủ lên một lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên trên khoảng 2 phút để cho gel co lại, dùng thanh nhựa tách các lớp kính ra, giữ nguyên không cho tấm kính trên tiếp xúc lại với gel vì nhƣ vậy gel sẽ dính và bị vỡ. Lúc này gel sẽ chỉ dính vào tấm kính dƣới không có silicon đƣợc phủ khi đổ gel.
20, Đặt tấm giấy Whatman lên trên gel và vuốt đều nhẹ nhàng, lúc đó gel sẽ dính vào giấy và có thể lấy ra dễ dàng (Chú ý trong trƣờng hợp sử dụng chất phóng xạ là S35 thì nên cố định mẫu theo cách dƣới đây).
21, Sau khi lấy gel ra hỏi tấm kính đáy thì bọc gel với SaranWrap, chú ý tránh
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});