Giới thiệu phƣơng pháp:
Sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu đƣợc trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số lƣợng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thƣớc của chúng hay các băng thu đƣợc không lặp lại các kết quả nghiên cứu.
Mặc dù vậy, theo phƣơng pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với enzyme cắt hạn chế sẽ đƣợc làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza hay nylon. Màng sẽ đƣợc lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và không quá phức tạp do nó chỉ
Catot Giấy lọc thấm dd đệm
Màng ngăn
Giấy lọc thấm dd đệm
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 25 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò. Với một số lƣợng không lớn các mảnh hiển thị thu đƣợc sau phép lai sẽ cho phép xác định đƣợc chính xác hơn về kích thƣớc. Điều này làm cơ sở cho so sánh giữa các gel với nhau cũng nhƣ kết quả thu đƣợc từ các phòng thí nghiệm khác nhau.
Khi sử dụng phƣơng pháp này cần chú ý một số mẫu dò sau:
1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó. Enzyme cắt hạn chế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau.
2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định (Tompkins et al., 1986).
3, Một cách khác nữa cũng đƣợc dùng là sử dụng mẫu dò là một đoạn ADN tách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá cho độc tố ngoại bào (exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonas aeruginosa (Ogle et al., 1987). Việc sử dụng bất kỳ loại mẫu dò nào cũng tạo ra phổ đặc trƣng của phép lai có ý nghĩa cho so sánh giữa các chủng với nhau.
- Kỹ thuật ribotyping:
Mọi mẫu dò đều cho các kết quả có sức thuyết phục. Tuy nhiên, kỹ thuật dùng mẫu dò là đoạn RNA của ribosom đã đƣa ra một cách tiếp cận mới trong nghiên cứu dịch tễ phân tử với các vi khuẩn có sự khác biệt lớn. Trong khi đó các mẫu dò khác chỉ giới hạn với một loài, hay chỉ có ý nghĩa cho các chủng trong cùng một loài. Kỹ thuật này lần đầu tiên đƣợc Grimont mô tả năm 1986 và nhanh chóng trở thành phƣơng pháp hữu hiệu hiện nay cho nghiên cứu dịch tễ học vi sinh vật ở mức độ phân tử.
Tính hợp lý cho việc sử dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNA ribosom có độ bảo thủ cao. Cũng có thể phát hiện thấy những thay đổi chút ít trong quá trình tiến hoá đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu. Gene RNA ribosom đƣợc tổ chức thành các operon mà các gene riêng rẽ mã cho các RNA kích thƣớc 5S, 16S và 23S chúng đƣợc cách nhau bằng các đoạn ADN spacer không mã cho gene nào. Nếu dùng mẫu dò hỗn hợp giữa 16S và 23S thì kết quả phép lai sẽ hiển thị các mảnh tƣơng ứng với phần của gene này trong khi dùng mẫu dò là đoạn của các gene đã đƣợc tách dòng có thể
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 26 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
đƣa đến kết quả hiển thị cả phần gene tƣơng đồng và chuỗi spacer. Nhƣ vậy sự khác nhau của kết quả phụ thuộc vào loại mẫu dò sử dụng.
Yêu cầu kỹ thuật:
Để thu đƣợc kết quả tối ƣu cần có các yêu cầu kỹ thuật cụ thể cho từng bƣớc thực hiện.
Tạo ra đƣợc phổ dấu vân tay thu đƣợc sau khi xử lý mẫu với enzyme cắt hạn chế. Phổ vân tay tối ƣu khi các mảnh cắt phải đƣợc tách rõ và phân bố đồng đều về kích thƣớc trên gel. Số lƣợng các mảnh ADN thu đƣợc phụ thuộc vào mẫu ADN và loại enzyme cắt hạn chế đƣợc sử dụng.
Thực tế cũng cho thấy khi dùng enzyme cắt hạn chế (một hay đồng thời vài loại) để thu đƣợc phổ các đoạn cắt hợp lý cho việc phân tích ribotyping thì các kết quả này cũng rất khác nhau. Nhƣ vậy, điều quan trọng nên tiến hành trƣớc các phép phân tích này, phải chọn đƣợc một số chủng đặc trƣng và thử với một số enzyme cắt hạn chế để chọn giải pháp cho nghiên cứu dịch tễ học với kỹ thuật này.
Nhƣ vậy, khi có đƣợc kết quả hợp lý sau khi xử lý các mẫu ADN với enzyme cắt hạn chế thì tiến hành các bƣớc chuyển các đoạn ADN trên gel lên màng theo các phƣơng pháp đã đƣợc mô tả ở trên. Phƣơng pháp chuyển bằng chân không là hợp lý hơn cả vì kết quả cho việc chuyển các băng có kích thƣớc gần nhau lại đƣợc tách ra sắc nét trên màng. Khi thực hiện phép lai nên chú ý nếu nhƣ dùng nguồn ARN ribosom của một chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì cần phải thay đổi điều kiện lai nhƣ nhiệt độ để phép lai đƣợc thực hiện tốt với các đoạn ADN từ các chủng vi sinh vật khác nhau.
Có một số phƣơng pháp đánh dấu mẫu dò là ADN ribosom. Phƣơng pháp đánh dấu phóng xạ (Grimont, 1986), đây là phƣơng pháp có ƣu thế là chỉ cần vài bƣớc đơn giản cho phép lai và rửa mẫu nhƣng lại mang nhiều hạn chế nhƣ: thời gian bán huỷ ngắn, yêu cầu an toàn cho phòng thí nghiệm riêng biệt, nguy hiểm cho ngƣời dùng và gặp khó khăn với việc xử lý chất thải phóng xạ. Mới đây có một số phƣơng pháp đánh dấu mẫu dò phi phóng xạ đƣợc sử dụng khá thành công. Pitcher (1987) đã mô tả phƣơng pháp tổng hợp mẫu dò gắn với bilatin để phát hiện ARN ribosom của Providencia stuartii. Chất kích hoạt
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 27 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
quang hoá đã đƣợc Koblavi và Grimont mô tả (1990). ARN ribosom cũng đƣợc đánh dấu bằng acetylaminofluorence (AAF) do Grimont (1989) mô tả. Công ty Eurogeneetik (Bỉ) đã cung cấp phức hợp AAF-rARN trên thị trƣờng.
+ Ứng dụng kỹ thuật ribotyping:
Xác định type vi khuẩn bằng kỹ thuật ribotyping có một số ƣu điểm so với một số kỹ thuật định typ khác ở chỗ:
Thực tế là các gene của ribosom khá bền do chúng nằm trên nhiễm sắc thể. Hầu hết các vi sinh vật đều chứa nhiều phiên bản của operon ribosom do đó khi lai với mẫu dò thích hợp thì kết quả là tạo ra một số mảnh lai có kích thƣớc khác nhau. Hiện nay, nguồn rARN của E.coli đánh dấu là mẫu dò khá phổ biến đã đƣợc thƣơng mại hoá.
Do tính đa dạng và phức tạp của kỹ thuật định typ theo ribosom do đó trên thực tế khi nhìn kết quả bằng mắt thƣờng khó có thể phát hiện đƣợc sự khác nhau hay giống nhau giữa các chủng trong cùng một loài khi tiến hành nghiên cứu dịch tễ học trên diện rộng. Owen và cộng sự (1992) đã nghiên cứu khả năng trợ giúp của computer để so sánh kết quả thu đƣợc khi nghiên cứu các chủng Helicobacter pylori. Tƣơng tự nhƣ vậy Bialkowska-Hobranska và cộng sự (1990) dùng thiết bị laze đo mật độ các mảnh ADN lai cùng với sự trợ giúp của computer để phân tích các kết quả thu đƣợc từ các chủng cầu khuẩn nha bào gram âm. Phƣơng pháp này có thể đƣa ra số liệu chung làm cơ sở cho xác định sự giống nhau giữa các loài khác nhau. Các phân tích thu đƣợc từ các số liệu của các các thể khác nhau có thể chỉ ra đƣợc các cá thể mới làm cơ sở cho định danh cũng nhƣ theo dõi.
Mọi nghiên cứu cho thấy một điều quan trọng và có ý nghĩa nhất là cách chọn enzyme cắt hạn chế và loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder và cộng sự 1991).
Nhìn chung phƣơng pháp lai ADN chứng tỏ ƣu thế của nó nhƣ là một kỹ thuật quan trọng cho định type và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Về nguyên tắc phƣơng pháp này cũng có ƣu điểm và nhƣợc điểm của nó.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 28 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC