Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng phản ứng PCR
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 77 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.19: Kết quả điện di phát hiện sản phẩm khuếch đại
Từ hình điện di cho thấy các vạch sang thể hiện rõ nét nằm trong khoảng 500 – 600 bp, chứng tỏ các mẫu này là dƣơng tính. Không bị ngoại nhiễm trong quá trình ly trích.
Kết quả sản phẩm khuếch đại sau khi tinh sạch
Mục đích của tinh sạch sản phẩm PCR nhằm loại bỏ các primer dimmer và các thành phần của phản ứng PCR thừa. Qua hình 4.12 sản phẩm sau khi tinh sạch rất tốt không có băng phụ chứng tỏ sản phẩm không còn lẫn tạp chất có kích thƣớc nằm trong khoảng 500 – 600 bp đƣợc dùng vào giải trình tự.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 78 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 3.7: Nồng độ sản phẩm PCR sau khi tinh sạch
STT Tên mẫu Nồng độ pha (ng/µl) Tỉ lệ OD 260/OD 280
1 A1 22 1,84
2 A2 19 1,90
3 A3 18 1,89
4 A4 22 1,98
5 A5 23 1,93
Kết quả giải trình tự đoạn gen vi khuẩn
Thực hiện giải trình tự, ta có đƣợc đoạn gen trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn nhƣ sau
o Chủng A1:
Kết quả giải đƣợc đoạn gen dài 456 bp, với trình tự các Nucleotide nhƣ sau:
AGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCG AAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGG AAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAA TGTGGCCGTTCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTT ACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGGCCATCCCATAGCGACAGCTTAC GCCGCCTTTTATAAGCTGATCATGCGATCTGCTTTATTATCCGGTATTAGCACC TGTTTCCAAGTGGTATCCTAGACTATGGGGCAGGTTCCCCACGTGTTACTCAC CCATCCGCCGCTCGCGTCCCCAGCGTCATTACCGAAGTAAATCTGCTGGTTCT GCTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCC
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 79 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.21: Tín hiệu huỳnh quang chủng A1 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 80 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 3.8: Kết quả tra trình tự mẫu A1 từ trang web NCBI BLAST
o Chủng A2:
Kết quả giải đƣợc đoạn gen dài 457 bp, với trình tự các Nucleotide nhƣ sau:
AAGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCC GAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCA ATGTGGCCGTTCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCG TTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGGCCATCCCATAGCGACAGCTTA CGCCGCCTTTTATAAGCTGATCATGCGATCTGCTTTATTATCCGGTATTAGCAC CTGTTTCCAAGTGGTATCCTAGACTATGGGGCAGGTTCCCCACGTGTTACTCA CCCATCCGCCGCTCGCGTCCCCAGCGTCATTACCGAAGTAAATCTGCTGGTTC TGCTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCC
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 81 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.23: Tín hiệu huỳnh quang chủng A2 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 82 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 3.9: Kết quả tra trình tự mẫu A2 từ trang web NCBI BLAST
o Chủng A3:
Kết quả giải đƣợc đoạn gen dài 535 bp, với trình tự các Nucleotide nhƣ sau:
GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATG CAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGG TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC GGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTG GCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGG TAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAAT AGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAA
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 83 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.25: Tín hiệu huỳnh quang chủng A3 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 84 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 3.10: Kết quả tra trình tự mẫu A3 từ trang web NCBI BLAST
o Chủng A4:
Kết quả giải đƣợc đoạn gen dài 533 bp, với trình tự các Nucleotide nhƣ sau:
GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATG CAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGG TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC GGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTG GCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGG TAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAAT AGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCCGCGG
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 85 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.27: Tín hiệu huỳnh quang chủng A4 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 86 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 3.11: Kết quả tra trình tự mẫu A4 từ trang web NCBI BLAST
o Chủng A5:
Kết quả giải đƣợc đoạn gen dài 225 bp, với trình tự các Nucleotide nhƣ sau:
GGCCGCGTTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAG GGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAG TAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAA
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 87 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 3.29: Tín hiệu huỳnh quang chủng A5 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 88 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 3.12: Kết quả tra trình tự mẫu A5 từ trang web NCBI BLAST
Bảng 3.13: Kết quả định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong Probiotic
STT Chế phẩm HL vi khuẩn Chủng vi khuẩn HL NSX Công bố Chủng vi khuẩn NSX công bố
1 Antibio 267 x 107CFU/g Lactobacillus acidophilus
108 CFU/g
Lactobacillus acidophilus
2 Probio 137 x 107CFU/g Lactobacillus acidophilus
109 CFU/g
Lactobacillus acidophilus
3 L. Bio 139 x 104CFU/g Lactobacillus acidophilus
108 CFU/g
Lactobacillus acidophilus
4 Biolac 44 x 107CFU/g Bacillus
polyfermenticus 2 x (106– 107) CFU/g _Lactobacillus acidophilus _Lactobacillus sporogenes _Lactobacillus kefir 22 x 107CFU/g Bacillus amyloliquefaciens
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 89 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Nhận xét kết quả:
Do thời gian và khả năng có hạn nên chỉ thực hiện đƣợc trên bốn loại chế phẩm Probiotic đƣợc chọn từ các nhà thuốc tây trên thị trƣờng trong nƣớc.
Giải trình tự gen của năm chủng vi khuẩn nhận đƣợc có kích thƣớc dài ngắn khác nhau, có thể do các nguyên nhân sau: Do lƣợng DNA mẫu cho vào phản úng PCR sequencing chƣa phù hợp (nếu lƣợng DNA mẫu cho vào quá nhiều làm cho phản ứng PCR dễ bị ức chế, ngƣợc lại nếu cho lƣợng DNA vào quá thấp tần suất các primer bắt cặp vào không cao làm cho kích thƣớc chuổi trình tự ngắn). Mặt khác, do thuật toán phân tích đoạn gen của phần mềm sequencing analysis tự loại bỏ nhƣng tính hiệu mờ, không rõ làm ảnh hƣởng đến kích thƣớc chuỗi trình tự gen.
Ba chủng vi khuẩn A1, A2, A5 tuy có độ dài trình tự gen thấp nhƣng vẫn nằm trong vùng đặc hiệu gen 16S của vi khuẩn nên kết quả định danh vẫn đạt đƣợc mức chính xác và độ tin cậy cao.
Thực hiện định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong bốn loại sản phẩm Probiotic, trong đó sản phẩm Antibio sản xuất ngoài nƣớc có hàm lƣợng vi khuẩn cao hơn nhà sản xuất công bố, ba mẩu sản xuất trong nƣớc trong đó: mẫu Probio có số lƣợng vi khuẩn đúng nhƣ nhà sản xuất công bố, mẫu L-bio có hàm lƣợng vi khuẩn thấp hơn nhà sản xuất công bố, mẫu Biolac chƣa phát hiện đƣợc vi khuẩn nhƣ nhà sản xuất công bố, có thể do các nguyên nhân sau:
o Do thao tác trong quá trình lấy mẫu và pha loãng ở các nồng độ không đƣợc trộn đều, đã làm cho nồng độ trong sản phẩm có thể tăng hoặc giảm.
o Chƣa tìm đƣợc môi trƣờng cấy phân lập và nhiệt độ ủ thích hợp cho vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus trong chế phẩm Biolac.
o Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn vi yếm khí, không sinh bào tử nên khó bảo quản. Nếu bảo quản không đúng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất có thể làm cho vi khuẩn bị ức chế, hoặc chết làm cho hàm lƣợng vi khuẩn trong chế phẩm giảm, hay mọc kém trên môi trƣờng nuôi cấy.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 90 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
o Do điều kiện sản xuất và chất lƣợng sản phẩm chƣa đƣợc quan tâm, việc vệ sinh trong quá trình sản xuất chƣa đƣợc quản lý chặt chẽ. Và có thể do các đơn vị sản xuất chƣa có đủ thiết bị để kiểm tra chất lƣợng, và thƣờng chỉ dùng phƣơng pháp định danh bằng các phản ứng sinh hóa thông thƣờng thì khó biết đúng loài vi khuẩn.
Hóa chất dùng ly trích DNA đạt chất lƣợng tốt, không bị ngoại nhiễm.
Mồi thiết kế hoàn toàn đặc hiệu cho đoạn gen 16S trên vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, đƣợc thể hiện trên hình điện di sản phẩm khuếch đại.
Chất lƣợng các mix PCR tốt thể hiện qua sản phẩm khuếch đại có độ dài từ 500 – 600 bp. Hóa chất dùng tinh sạch sản phẩm tốt, loại đƣợc các primer và các thành phần thừa trong phản ứng PCR, thu đƣợc kết quả giải trình tự nhƣ mong muốn.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 91 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
CHƢƠNG 4: TỔNG KẾT
So sánh các phƣơng pháp:
4.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống
API20E KIT: Nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trƣờng hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ tuổi tế bào, lƣợng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.
Phân biệt bằng thực khuẩn thể: phƣơng pháp này cũng bộc lộ một số nhƣợc điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
Phân biệt theo Typ huyết thanh: Nói chung đây là phƣơng pháp khá ổn định nhƣng hạn chế chủ yếu của phƣơng pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại.
4.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen