Là phƣơng pháp có hiệu quả để tách plasmid, trên thực tế hiệu quả tách các plasmid có kích thƣớc nhỏ cao hơn nhiều so với các plasmid có kích thƣớc lớn (>100 Kb). Với các plasmid có kích thƣớc lớn cần các thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do các nguyên nhân cơ học. Với cách tách plasmid nhƣ trên thì sản phẩm thu đƣợc có lẫn các đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 500 bp và nhiễm ARN. Để tránh nhiễm ARN thì cần xử lý với RNase (ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể tách theo các phƣơng pháp nhƣ:
Tách bằng Caeseium chloride. Tách bằng KIT QIAGENE.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 92 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Tách bằng kỹ thuật khác.
Một số vấn đề cần lƣu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông thƣờng plasmid đƣợc thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi endonuclease. Dạng di chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn
Đôi khi việc tách plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong những trƣờng hợp plasmid có kích thƣớc nhỏ có lẫn các mảnh ADN của nhiễm sắc thể. Trong mọi trƣờng hợp đều có nhiễm các RNA và chúng di động nhanh nhất trừ các trƣờng hợp plasmid nhƣ vậy không đƣợc nhầm lẫn giữa plasmid siêu xoắn và dạng chính plasmid đứt gãy và plasmid khác. Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh kích thƣớc giữa các plasmid siêu xoắn và dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng. Thực tế là chỉ có thể so sánh các plasmid siêu soắn với nhau về kích thƣớc.
Khi tiến hành phân biệt giữa các chủng vi khuẩn thì đƣơng nhiên là chỉ có thể thực hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid với nhau. Cũng nên chú ý là không phải các chủng đều giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết quả phân tích plasmid nhƣ nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu quả trong các mẫu có nhiều loại plasmid, tuy nhiên cũng phải tính đến việc các plasmid cũng có thể bị mất trong quá trình bảo quản.
4.2.2 Phân tích ADN nhiễm sắc thể
Một trong những nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích trên là các phƣơng pháp tách ADN thông thƣờng đều dẫn đến thay đổi kích thƣớc do đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác sự có mặt của plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết quả phân tích, để khắc phục nhƣợc điểm trên ngƣời ta phải thực hiện phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết quả phân tích.
Phƣơng pháp phân tích plasmid là phƣơng pháp đƣợc dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật. Việc kết hợp giữa phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn chế sẽ tạo đƣợc sự phân tích chính xác với các thông tin đáng tin cậy đối với các mẫu phân tích. Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trên plasmid thì cần lƣu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên cứu. Khi thực hiện phép phân tích PFGE với các plasmid lớn sẽ khắc phục đƣợc
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 93 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
hạn chế của các phép phân tích hiện tại với plasmid nhỏ nhƣ trên. Phƣơng pháp PFGE hiện đang đƣợc dùng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng trên các đối tƣợng dễ nuôi cấy có thể cho các kết quả tốt hơn nhƣng hạn chế về giá thành thiết bị cũng nhƣ yêu cầu cao về kỹ thuật và kinh nghiệm. Mặt khác khi sử dụng các enzym cắt hạn chế hiếm có thể sẽ khó phát hiện đƣợc mức độ sai khác. Nhƣ vậy sự kết hợp giữa các phép phân tích plasmid, PFGE và lai ADN sẽ cho kết quả tin cậy hơn.