Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lƣợng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phƣơng pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuếch đại theo cách này. Phƣơng pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thƣớc sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR đƣợc lai với mẫu dò đặc hiệu đã đƣợc đánh dấu. Phƣơng pháp đƣa lại thông tin nhiều nhất là xác định đƣợc trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định đƣợc sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tƣợng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật.
- Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR:
Phản ứng chuỗi PCR nhằm khuếch đại ADN lần đầu tiên đƣợc Saki (1985) giới thiệu và đây đƣợc coi là một trong những tiến bộ khoa học quan trọng nhất về sinh học trong thập kỷ 80. Phản ứng PCR sử dụng enzyme chịu nhiệt tạo ra nhiều phiên bản theo hàm số mũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi ADN sau vài giờ có thể nhân lên 1011 phiên bản ADN tƣơng đƣơng với 100 ng ADN. Sau khi thực hiện phản ứng PCR thì cần tiến hành một số kỹ thuật để xác định sản phẩm, đơn giản nhất là điện di và xác định kích thƣớc của sản phẩm PCR. Trong các nghiên cứu chẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa, nó chứng tỏ sự có mặt của ADN đích trong mẫu nghiên cứu. Có thể nhận đƣợc tính đặc hiệu và độ
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 29 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
nhạy cao hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên, thông tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản phẩm PCR. Ngay từ khi đƣợc giới thiệu thì PCR đã đƣợc xem là phƣơng pháp đƣa lại kết quả khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh vật. Tính ƣu việt của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ cho phản ứng xảy ra và khuếch đại tới mức có thể phát hiện đƣợc trong thời gian ngắn. Kỹ thuật PCR còn đƣợc dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi đã đƣợc chuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã ngƣợc (RT). Mặt khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch với kháng thể thì phải cần tới 8 ngày mới có đáp ứng miễn dịch trong máu, trong khi đó với kỹ thuật PCR thì toàn bộ quy trình phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với nguồn ADN hay RNA).
Lợi thế của kỹ thuật PCR đƣợc tận dụng cho việc chuẩn bị ADN làm mẫu dò với số lƣợng lớn cho các phép lai ADN đã trình bày ở trên. Các mẫu dò có thể đƣợc đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành phản ứng khuếch đại. Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ƣu thế hơn các phƣơng pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy (nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primer labeling).
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 30 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Bảng 2.5: Một số ví dụ về ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vật.
Vi sinh vật Tài liệu
Acanthamoeba sp Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Brucella sp Candida albicans Carnobacterium spp Chlamydia trachomatis Clostridium difficile Coxiella burneti Cryptosporidium parvum Cytomegalovirus Dengue virus Epstein-barr virus Erwinia amylovora Escherichia coli Frankia spp Gaeumannomyces spp Helicobacter pylori Hepatitis C virus
Human immunodeficiency virus (HIV)
Vokin et al (1992) Houard et al (1989)
Marconi ADN Garon (1992) Herman an Derider (1992) Miyakawa et al (1992) Brook et al (1992) Hayes et al (1992) Gumerlock et al (1991) Stein an Raoult (1992) Laxer et al (1991) Gozlan et al (1991) Henchal et al (1991) Samoszuk (1991) Bereswill etal (1992) Jackson (1992) Simonet et al (1990) Henson (1992) Claton et al (1992) Okamoto et al (1992) Dawood et al (1992)
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 31 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC Influenza virus Leptospira spp Litsteria monocytogenees Luteovirus Mycobacterium leprae Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningitis Papillomavirus Parvovirus Plsmodium falciparum Pneumocystis carini Polio virus Pseudomonas solanacearum Rickettsia spp Rotavirus Salmonella spp Staphylococcus spp Toxoplasma gondii Treponema pallidum Trichomonas vaginalis Trypanosoma cruzi Vibrio vulnificus Yersinia Claas et al (1992) Merien et al (1992) Niederhauser et al (1992) Robertson et al (1991) Hackel et al (1990) Altamirano et al (1992) Maiden et al(1992) Charlotte et al (1993) McOmish et al (1993) Barker et al (1992) Olsson et al (1993) Yang et al (1991) Seal et al (1992) Gage et al (1992) Taniguchi et al (1992) Rahn et al (1992) Murakami et al (1991) Vanevan et al (1991) Grimprel et al (1991) Riley et al (1992) Breniere et al (1992) Hill et al (1991) Nakajima et al (1992)
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 32 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR: Nguyên tắc cơ bản của PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phƣơng pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene đƣợc thực hiện với enzyme ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bƣớc (xem hình vẽ minh hoạ): Bƣớc 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bƣớc 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bƣớc 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’- 3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng đƣợc quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Nhƣ vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thƣớc 20-30 nucleotid đƣợc thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ nhƣ vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuếch đại đƣợc đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao nhƣ rADN thì khi cặp mồi đƣợc thiết kế thì chúng có thể nhân đƣợc gene từ nhiều đối tƣợng. Ngƣợc lại, trong nhiều trƣờng hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân đƣợc các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều đƣợc dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzyme ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzyme này bị biến tính tại 94oC và nhƣ vậy cần phải bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã đƣợc cải thiện do dùng enzyme Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus) chịu nhiệt. Enzyme này đƣợc tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nƣớc nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzyme này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 755oC. Hoạt tính enzyme giảm
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 33 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Nhƣ vậy khi dùng enzyme này thì không cần bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.
+ Các thông số kỹ thuật:
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhƣng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị ADN theo phƣơng pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân đƣợc đoạn gene dài 10 Kb nhƣng trong thực tế thƣờng dùng để nhân các đoạn có kích thƣớc ngắn hơn (< 2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng dƣới đây.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 34 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Số lƣợng ADN khuôn 10-100 ng dNTP (mỗi loại) 200 mM Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM Mồi ngƣợc 0.1 – 1.0 mM Taq polymerase 1 U KCL 50 mM Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05%
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tƣợng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay ngƣời ta có thể tối ƣu hoá việc chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chƣơng trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tƣợng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thƣờng hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trƣờng hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế đƣợc các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần nhƣ nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzyme có
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 35 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
ảnh hƣởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.
Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể đƣợc thực hiện nhƣ sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với ethanol. Kết tủa đƣợc hoà với đệm thích hợp và sau đó đƣợc xử lý với enzyme cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thƣờng trên gel agarose, trong một số trƣờng hợp có thể trên gel polyacylamid để thu đƣợc độ phân giải cao hơn. Chú ý rằng thông thƣờng hoạt tính enzyme giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Nhƣ vậy có thể ƣớc lƣợng 50% hiệu quả khuếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.
+ Sử dụng kỹ thuật PCR cho xác định typ vi sinh vật:
Nhƣ đã trình bày ở trên, dùng cặp mồi đặc hiệu có thể xác định đƣợc gene đặc trƣng cho loài hay thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Các chiến lƣợc ứng dụng lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định typ vi sinh vật trong nghiên cứu dịch tễ học đƣợc chia làm 4 nhóm sau:
- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Trong trƣờng hợp này dùng kết hợp kỹ thuật PCR và xử lý sản phẩm PCR với enzyme cắt hạn chế và quan sát kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid Một dẫn chứng cho kỹ thuật này là kết quả nhân gene synthase citrat trong Ricketsiae sau đó sản phẩm PCR đƣợc xử lý với enzyme cắt hạn chế để phân biệt giữa các chủng với nhau (Regnery và Ctv, 1991). Các ví dụ sau (bảng 1.8) đã cho thấy
+ Kỹ thuật rep-PCR:
Một phƣơng pháp trực tiếp cho kết quả finger printing không cần sử dụng enzyme cắt hạn chế là rep-PCR dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn gene lặp lại. Thuật ngữ rep- PCR là chỉ phƣơng pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Các chuỗi lặp lại có độ bảo thủ cao trong các đối tƣợng thuộc Enterobacteriaceae và một số đối tƣợng khác (Versalovic và Lupsky,
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 36 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
1991). Dùng các đoạn mẫu dò bảo thủ có thể lai với cả hai đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích thƣớc 126bp (Enterobacterial repetitive intergeneic concensus-ERIC) và đoạn 38bp (repetitive extrageneic palindromic-REP) từ bộ gene của Enterobacteriaceae vi khuẩn gram âm và một số chủng có quan hệ xa khác. Có thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene bảo thủ để thu đƣợc kết quả finger printing sau khi nhân gene dùng bộ gene của các vi sinh vật có mang các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát hiện đƣợc trên agarose các đoạn gene có kích thƣớc khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác nhau. Phƣơng pháp tƣơng tự cũng cho phép phát hiện sự khác nhau từ các nguồn ADN trên các đối tƣợng nhân thực thuộc chi Naegleria nhƣ mô tả của Belkim và Quint (1992). Phƣơng pháp này dùng cho phát hiện đa hình các đoạn gene chung cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn.