Nói chung quá trình lai (Hybridization) đƣợc tiến hành theo một trong 3 cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support).
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 20 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 2.5: Kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori
Kỹ thuật này đƣợc thực hiện để định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật sau khi đã đƣợc cố định trong các tiêu bản hiển vi. Tuy nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy đƣợc trực tiếp vi sinh vật dƣới kính hiển vi huỳnh quang. Điều đáng chú ý là phản ứng lai phải tiến hành trong thiết bị đƣợc hàn kín nhằm hạn chế việc bay hơi của dịch lai. Việc bay hơi dịch lai này dẫn đến việc bám không đặc hiệu của chất nhuộm huỳnh quang với tế bào. Nhiệt độ lai phụ thuộc vào oligonucleotid mẫu dò. Sau phản ứng lai thì mẫu phải đƣợc xem ngay hoặc đƣợc bảo quản trong tối trong thời gian 6 tháng. Nếu mẫu dò đặc hiệu cho RNA thì độ nhạy tăng lên rất lớn vì có tới hàng ngàn bản copy của RNA trong mỗi tế bào (Stahl và Amman, 1991).
Lai trong môi trƣờng dịch thể:
Phản ứng lai trong môi trƣờng dịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều so với môi trƣờng có chất mang pha rắn (soild). Do cả phân tử ADN đích và mẫu dò đều có thể di động tự do trong môi trƣờng do đó phản ứng đạt kết quả cao nhất. Nói chung với phép lai thực hiện trong dịch thể thì thời gian kết thúc nhanh hơn từ 5-10 lần so với trong điều kiện là chất mang (Bryan, et al., 1986). Tuy nhiên, cũng có thể bổ sung thêm chất mang làm tăng phản ứng lai. Cần thêm bƣớc cuối cùng là tách phức hợp mẫu dò-sợi ADN đích. Hạn chế ở đây là mẫu trong dịch cho nên có thể tạo lên các nền kém đặc hiệu, do vậy cần các giải pháp làm hạn chế mức độ nhiễu của nền cho thích hợp.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 21 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 2.6: Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trƣờng dịch thể
Trên thực tế hầu hết các KIT thƣơng phẩm dùng cho vi sinh vật đều tiến hành trong môi trƣờng dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên đƣợc phân giải trong điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò. Sau đó là bƣớc lai và tách phức hệ mẫu dò và ADN đích dựa vào các thông số của phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể. Các phép lai theo kiểu kẹp díp (hình 2.6) cần có hai đoạn ADN có trình tự khác nhau; một đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang và một đoạn là mẫu dò. Điều quan trọng là hai đoạn ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù chúng đều gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung. Mẫu dò đánh dấu đƣợc bổ sung vào trong dung dịch có các đoạn ADN đích nghiên cứu. Nhƣ vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để phát hiện gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN đích gắn vào chất mang đã đƣợc hình thành. Phức hợp này đƣợc tách ra khỏi dung dịch và khi có mặt cơ chất thích hợp để phát hiện đƣợc mẫu dò đánh dấu. Khi dùng hệ thống phát hiện dựa vào các hoá chất huỳnh quang hay tạo màu có thể dùng thiết bị phát hiện kết quả một cách tự động.
+ Kỹ thuật lai dựa vào màng:
Kỹ thuật lai Đầu dò
Que dò mực nƣớc Đánh dấu
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 22 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Tác giả đầu tiên giới thiệu kỹ thuật cố định ADN trên màng là Nygaard và Hall (1963, 1964). Sau đó chính Southern (1975) là ngƣời mô tả việc tách ADN khỏi gel sau khi điện di và chuyển chúng lên màng nitrocellulose. Các đoạn ADN đích đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai và đây là bƣớc tiến quan trọng của sinh học phân tử. Ngƣời ta cũng sử dụng một số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt hoá hay có độ bền cho các phép lai. Đối với công việc định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định trên màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp. Mẫu đƣợc ly giải và ADN bị biến tính, sau đó ADN đƣợc cố định trên màng khi đƣa vào tủ sấy tại 80oC trong 2 giờ hoặc đƣa vào xử lý với tia UV trong trƣờng hợp sử dụng màng nylon. Mẫu dò đánh dấu sau đó đƣợc đƣa vào dung dịch. Bƣớc tiền lai đƣợc thực hiện để hạn chế các mẫu bám vào nhau không đặc hiệu. Sau đó là bƣớc lai, màng sau khi lai đƣợc rửa để loại các mẫu dò còn dƣ. Bƣớc rửa tiếp theo để đánh giá mức độ bám đặc hiệu của phép lai. Sau đó các mẫu dò đánh dấu lai với vị trí ADN mẫu trên màng đƣợc phát hiện bằng các hệ thống phát hiện tƣơng thích. Toàn bộ quá trình lai trên màng đã đƣợc Meinkoth và Wahl (1984) mô tả chi tiết.
Khi phát hiện type vi sinh vật, phải sử dụng kỹ thuật Southern. Trong phƣơng pháp này ADN của nhiễm sắc thể đƣợc tinh sạch và đƣợc xử lý với enzyme cắt hạn chế thích hợp, sau đó mẫu lại đƣợc điện di trên gel agarose và tạo ra dấu vân (finger print) của nhiễm sắc thể. Sau khi điện di gel đƣợc đặt dƣới màng nitrocellulose hay màng nylon nằm giữa một số lớp giấy. Lớp giấy lọc phía trên đƣợc đặt trên cùng phần gel và màng kẹp giữa giấy lọc nhƣ trong hình 2.7.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 23 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 2.7: Mô tả phƣơng pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot Kết quả là đệm từ phía dƣới đƣợc thấm một cách tự nhiên lên trên. Điều đó giúp cho việc chuyển các mảnh ADN từ gel lên màng và bám chặt vào màng với kích thƣớc và phiên bản đúng nhƣ trên gel sau khi điện di (mô tả chi tiết theo Sambrook 1989).
Phƣơng pháp truyền thống này cũng đƣợc cải tiến khi dùng màng nylon để chuyển ADN trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985). Thời gian chuyển có thể vài giờ hoặc qua đêm. Việc cố định ADN trên màng đƣợc thực hiện sau đó bằng cách xử lý nhiệt hay tia UV nhƣ đã trình bày ở trên. Tuy nhiên, nhiều phƣơng pháp cải tiến đƣợc thực hiện nhanh nhƣ chuyển bằng điện di (Bittner, Kupfere, Morris, 1980) hay sử dụng bơm chân không (Medveczky, 1987; Olszewsk, 1988).
Trong nhiều trƣờng hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose lên màng thì trƣớc tiên gel phải đƣợc xử lý biến tính và đƣợc làm trung hoà trở lại. Gel đƣợc đặt giữa hai bản điện có các bản giấy thấm (hình 2.8).
Vật nặng Giấy lọc Giá đỡ Khăn giấy DD đệm Màng ngăn Gel
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 24 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Hình 2.8: Minh hoạ bƣớc chuyển ADN lên màng
Sau đó nguồn điện đƣợc nối và lúc đó ADN sẽ đƣợc chuyển lên màng. Thời gian chuyển sẽ phụ thuộc vào kích thƣớc đoạn ADN nhƣng thƣờng dao động trong khoảng 1-3 giờ. Phƣơng pháp có thể thực hiện theo chiều thẳng đứng hay chiều nằm ngang. Hiện nay có một số thiết bị bán trên thị trƣờng đƣợc dùng cho kỹ thuật này. Với thiết bị nằm thẳng đứng, thì toàn bộ đƣợc ngâm trong đệm và có thể tăng cƣờng độ dòng điện (chú ý vì có thể làm tăng nhiệt độ), phƣơng pháp này cần dùng nhiều đệm. Ngƣợc lại theo phƣơng pháp nằm ngang hay phƣơng pháp semi-dry, ở đây gel và màng đƣợc kẹp giữa các bản giấy lọc đã tẩm ƣớt bằng đệm thích hợp. Trƣờng hợp này cần rất ít đệm và cƣờng độ dòng điện là 1mA/cm2 là thích hợp.