+ Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ:
Ƣu điểm nổi bật của phƣơng pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể đạt tới dƣới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phƣơng pháp này là không đạt đƣợc sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho ngƣời sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng nhƣ việc quản lý chất thải.
+ Phƣơng pháp phát hiện dựa vào thay đổi màu:
Lợi thế của phƣơng pháp này là việc phát hiện đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ phát hiện và ứng dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật.
+ Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian.
Phƣơng pháp này khá nhạy nhƣng hạn chế lớn nhất của nó là cần thiết bị kích hoạt và đo bức xạ huỳnh quang.
+ Quá trình lai:
Lai trong môi trƣờng dịch thể: Hạn chế ở đây là mẫu trong dịch cho nên có thể tạo lên các nền kém đặc hiệu, do vậy cần các giải pháp làm hạn chế mức độ nhiễu của nền cho thích hợp.
Kỹ thuật lai dựa vào màng: Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN:
Hạn chế chính của kỹ thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu trú phần gene bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trƣng cho cả hệ gene.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 94 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Nhìn chung phƣơng pháp lai ADN chứng tỏ ƣu thế của nó nhƣ là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Về nguyên tắc phƣơng pháp này cũng có ƣu điểm và nhƣợc điểm của nó.
Ƣu điểm:
Sử dụng cho nhiều đối tƣợng vi sinh vật.
Có các mẫu dò vạn năng đƣợc bán rộng rãi trên thị trƣờng.
Kết quả lai có độ lặp lại cao và khá đơn giản cho việc phân tích kết quả.
Có thể sử dụng sự trợ giúp của computer để lƣu giữ và phân tích kết quả thí nghiệm.
Hạn chế:
Phƣơng pháp sử dụng khá phức tạp và tốn thời gian.
Thông tin kết quả chỉ phản ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng. Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai nhƣ: khi có ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn ADN plasmid. Mặt khác khi lai với mẫu dò tổng hợp thì phản ứng tiến hành nhanh với độ đặc hiệu cao hơn.
Cho dù kỹ thuật này đƣợc sử dụng tốt cho nhiều đối tƣợng vi sinh vật khác nhau nhƣng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN đƣợc xử lý với enzym cắt hạn chế trong trƣờng xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác.
Ribotyping và PFGE có chung nguyên tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí enzym cắt hạn chế trên ADN của ribosom. Tuy nhiên, sự khác biệt ở chỗ ribotyping phản ánh sự phân bố của vị trí các enzym cắt hạn chế nằm trong các gene mã hoá cho rRNA hay nằm trong vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao, còn đối với PFGE phản ánh sự phân bố của các enzym cắt hạn chế phân bố trên toàn bộ gene nghiên cứu. Nghiên cứu của Prevost (1992) cho thấy là kỹ thuật PFGE có thể hiệu quả hơn kỹ thuật ribotyping đối với phép phân tích các chủng Staphylococus aureus kháng methicillin.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 95 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
Một số khó khăn với phản ứng PCR:
PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhƣng cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dƣơng tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự nhiễm ADN đều có thể đƣa đến sản phẩm dƣơng tính giả trong kết quả. Để hạn chế thực tế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết đƣợc sự nhiễm tạp từ các thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm.
Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene với enzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị sao chép khoảng 9000 nucleotid và đột biến dịch khung xảy ra với số lƣợng tƣơng ứng khoảng 40 000 nucleotid.
Một số kỹ thuật PCR khác:
Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho định danh và định typ vi sinh vật là nested PCR (PCR lồng), revert transtriptase PCR (sao chép ngƣợc) và asymmetric PCR (PCR một chiều). PCR lồng là phản ứng PCR bao bồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở vòng ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho phản ứng sau cho đoạn nằm trong gene. Nhƣ vậy phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để nhân phần gene nằm trong sản phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng PCR.
Phản ứng PCR phiên mã ngƣợc đƣợc dùng để nhân ADN từ ARN của virus. Việc kết hợp phản ứng này với PCR lồng có tác dụng phát hiện ARN tại thời điểm nhất định của mẫu.
Kỹ thuật PCR một chiều đƣợc ứng dụng trong phƣơng pháp giải trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 96 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Thị Ngọc Huyền ; Nguyễn Ngọc Huyền ; Nguyễn Thùy Châu, 2005, Phân lập, tuyển chọn và định loại các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh phytaza, Tạp chí Nông Nghiệp và phát triển nông thôn, số 7.
2. Hoàng Tƣờng Vi, 2007. Xây dựng quy trình định danh Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự RDNA 16S, Luận văn Thạc sỹ Công Nghệ Sinh Học, ĐHBK TPHCM.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng. (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, tr.129-133, 190-206
4. Khuất Hữu Thanh, 2005. Cở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. ĐH Bách khoa Hà Nội, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
5. Lƣơng Đức Phẩm, 2007. Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
6. Lƣơng Đức phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
7. Lê Thúy Quyên (1999). PCR phát hiện và định lƣợng HBV – DNA, luận án thạc sĩ khoa học sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, tr.27-30
8. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006. Thí nghiệm công nghệ sinh học và thí nghiệm vi sinh vật học. 2006. Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP.HCM
9. Nguyễn Lân Dũng, Dƣơng Văn Hợp, 2007. Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử, Vietsciences.
10. Nguyễn Lân Dũng - Đinh Thúy Hằng, 2006. Phƣơng pháp thực nghiệm dùng để định tên các loài vi khuẩn, Vietsciences.
11. Phạm Hùng Vân (2002), Cẩm nang Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sang, trƣờng Đại học Y dƣợc TP. Hồ Chí Minh, tr. 39,93.
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 97 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
12. Phạm Hùng Vân, 2006, Từ Real-time PCR đến Sequencing : giải pháp toàn diện cho chẩn đoán sinh học phân tử phát hiện tác nhân gây bệnh nhiễm trùng
13. Tô Minh Châu, Lâm Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Xác định môi trƣờng tối ƣu để thu sinh khối, enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis,
Lactobacillus acidophilus và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học. Tạp chí KHKT Nông lâm nghiệm. Số 2.
14. Trần Thu Hoa, 2003. Nghiên cứu khả năng dùng bào tử Bacillus tái tổ hợp làm nguyên liệu thuốc chủng ngừa qua niêm mạc. Luận văn TS Dƣợc-Tp.HCM, tr 13- 18.
15. Võ Thị Thu, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một sổ chủng vi khuẩn thuộc chi 8 Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, tr 7-22. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH
16. Anthony di Fabio et al, Friendly bacteria – Lactobacillus acidophilus and
Bifidobacterium, the Arthritis Trust of Amerian, 1989.
17. Bonen et al., « Cyanobacterial evolution : reuslts of 16S ribosomal ribonucleic acid sequence analysis, « Can.J.Biochem. 57 :879 -888(1979)
18. Christèle Humblot, Australia,Malène Sutren, Evelne Lhoste, Joel Doré, Brussels spoits, inulin and fermented milk alter the feacal microbiota ofhuman microbiota-associated tars as shown by PCR-temporal temperature gradient gel electrophoresis using universal, Lactobacillus and Bifidobacterium, Bristish Journal of Nutrition 93, 2006, p677-684.
19. Cowan and Steel. (2005), Manual for the Identification of Medical Bacteria, Third edition, Edited by G.I. Barrow and R.K.A. Feltham, p 87-90
20. Jean F. MacFaddin. (2000), Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, Third edition, Lippincott Willianms & Wilkins, tr. 484, 506-509,582.
21. John G. Holt, Noel R.Krieg, Peter H.A.Sneath, James T. Staley, Stanley T.Williams. (1994), Berger’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth edition, tr. 24,559
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 98 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC
22. José Luis Balcázar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, Daneil Vendrell, Olivia Gironés, José Luis Balcázar, Sequencing of variable regions of the 16s rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids, Comparative Immunology, Microbiology and Infectiuos Disease 30.2007. p 111-118
23. Jean-Marc Neefs, Yves Van de Peer, Peter De Rijk, Compilation of small ribisomal subunit RNA structures, Nucleic Acids Research, Vol 21, No. 13, 1993, p 3025-3049.
24. Gerald W. Tannock, Identification Lactobacilli and Bifidobacteria, Current Issues Molec. Biol 1999, 1, p 53-64
25. Hand G.H.J. Heilig, Erwin G. Zoetendal, Elaine E. Vaughan, Philippe Marteau, Antoon D.L. Akkermans,1 and Willem M. de vos, Molecuar Diversity of
Lactobacillus spp.and Other lactic Acid Bacteria in the Human Intestine as Determined by specific Amplification of 16S Ribosomal DNA, applied and Environ mental Microbiology, January 2002, p.114-123, Vol.68, No. 1
26. Iris L. Gonzales, James E. Sylverster, Beyond ribosomal DNA : ontowards the telomere, chromosoma 1997, 105, 431 -437
27. Kirsten L. Simpson, Bertil Pettersson and Fergus G.Priest, Chazacterization of lactobacilli from Scotch malt shisky distilleries and desciptrion of Lactobacillus ferintoshensis sp.nov., a new species isolated from malt whisky fermentations, Microbiology (2001), 147, 1007-1016 Website: 1. http://.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_acidophilus 2. http://vietsciences.free.fr 3. http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/21 4. http://cahoney-l-acidophilus.pbworks.com/structure 5. www.ncbi.nlm.nih.gov 6. www.thuocbietduoc.com 7. www.promega.com