Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic từ bacilus dùng để kiểm soát edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC TỪ BACILUS DÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA Sinh viên thực hiện: Đỗ Phương Quỳnh Nguyễn Thị Thúy Nguyễn Thị Diệu Hiền Võ Ngọc Yến Nhi Nguyễn Hoàng Tuấn Duy Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh TP Hồ Chí Minh, 2013 LỜI CẢM ƠN Lời chúng muốn cảm ơn ông bà, ba mẹ điểm tựa vững chắc, ngƣời sinh ra, nuôi khôn lớn, lo lắng, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho chúng học tập tốt Chúng em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình dạy dỗ, truyền đạt kinh nghiệm, lòng hăng say kiến thức cho chúng em suốt thời gian học tập trƣờng Đó hành trang vững giúp chúng em bƣớc vào chặng đƣờng phía trƣớc Với lịng biết ơn sâu sắc, chúng em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh cô Dƣơng Nhật Linh bên cạnh định hƣớng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập hoàn thành đề tài Chúng em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Cát Đông – Trƣởng mơn vi kí sinh trùng, phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh công nghệ Dƣợc – Trƣờng đại học Y dƣợc TP HCM, thầy Nguyễn Thanh Thuận, giảng viên trƣờng đại học Thủ Dầu Một tạo điều kiện, hỗ trợ, giúp đỡ chúng em nhiều trình làm đề tài Chúng em xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Tuấn Duy, anh Đan Duy Pháp chị Võ Ngọc Yến Nhi bạn, em phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh ln bên cạnh, động viên nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian làm nghiên cứu Bình dƣơng, tháng 04 năm 2013 Nhóm thực hiện: Đỗ Phƣơng Quỳnh Nguyễn Thị Thúy Nguyễn Thị Diệu Hiền Võ Ngọc Yến Nhi Nguyễn Hoàng Tuấn Duy MỤC LỤC M ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1.1 1.2 1.3 1.4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU TÌNH HÌNH NI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình ni trồng thủy sản 1.1.2 Tình hình ni trồng cá tra TỔNG QUAN CÁ TRA 1.2.1 Phân loại cá tra 1.2.2 Bệnh gan thận mủ cá tra VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI 10 1.3.1 Hệ thống phân loại 10 1.3.2 Đặc điểm sinh hóa 11 1.3.3 Con đƣờng xâm nhiễm Edwardsiella ictaluri (Shotts cs.,1986) 12 PROBIOTIC – CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 13 1.5 1.6 1.7 1.4.1 Định nghĩa probiotic 14 1.4.2 Điều kiện yêu cầu cho probiotic 14 1.4.3 Vai trị probiotic ni trồng thủy sản 15 VI KHUẨN BACILLUS 19 1.5.1 Đặc điểm chung chi Bacillus 19 1.5.2 Dinh dƣỡng phát triển .20 1.5.3 Ứng dụng Bacillus nuôi trồng thủy sản 20 ĐỊNH DANH VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ 21 1.6.1 Kỹ thuật giải trình tự (Sequencing) .21 1.6.2 Ứng dụng PCR giải trình tự để định danh vi sinh vật .24 Quy hoạch thực nghiệm 25 1.7.1 Định nghĩa quy hoạch thực nghiệm .25 1.7.2 Ƣu điểm quy hoạch thực nghiệm 26 1.7.3 Đối tƣợng quy hoạch thực nghiệm 26 1.7.4 Thí nghiệm sàng lọc .28 MỤC LỤC 1.7.5 Tối ƣu hóa 29 1.7.6 Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Minitab 16 .34 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 41 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 41 2.3 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 41 2.2.2 Chủng vi khuẩn thử nghiệm 41 2.2.3 Mơi trƣờng - hóa chất 41 2.2.4 Thiết bị - dụng cụ 42 2.2.5 Một số phần mềm sử dụng 42 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 43 2.3.2 Tái phân lập Bacillus .44 2.3.3 Thử đối kháng với Edwardsiella Ictaluri 46 2.3.4 Định danh vi sinh vật kỹ thuật giải trình tự 48 2.3.5 Xây dựng đƣờng tƣơng quan giá trị OD610 mật độ tế bào (Trần Linh Thƣớc, 2010) 53 2.3.6 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng Bacillus Q16 Bacillus Q111 55 2.3.7 Chọn lựa nguồn dinh dƣỡng 56 2.3.8 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett – Burman .58 2.3.9 Thí nghiệm khởi đầu 59 2.3.10 Tìm khoảng tối ƣu cho trình lên men phƣơng pháp leo dốc 60 2.3.11 Thí nghiệm bề mặt tiêu xác định giá trị tối ƣu yếu tố .61 2.3.12 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm từ hai chủng vi khuẩn Bacillus Q16 Bacillus Q111 62 2.3.13 Thử nghiệm khảo sát LD50 64 2.3.14 Thí nghiệm ảnh hƣởng vi khuẩn Bacillus Q16 Bacillus Q111 lên tỷ lệ sống cá tra giống 65 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 MỤC LỤC 3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP 69 3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG 70 3.3 3.4 3.2.1 Phƣơng pháp cấy vạch vng góc 70 3.2.2 Phƣơng pháp giếng khuếch tán 71 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ 72 3.3.1 Tách chiết DNA gen Bacillus Q16 Bacillus Q111 72 3.3.2 Kết điện di gel agarose 72 3.3.3 Kết hiệu chỉnh trình tự 73 3.3.4 Kết so sánh trình tự sở liệu GenBank 74 KẾT QUẢ TỐI ƢU HĨA MƠI TRƢỜNG LÊN MEN CHO BACILLUS SUBTILIS Q16 VÀ BACILLUS SUBTILIS Q111 76 3.4.1 bào Kết xây dựng đƣờng tƣơng quan giá trị OD610 mật độ tế .76 3.4.2 Kết xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng vi khuẩn Bacillus subtilis Q16 Bacillus subtilis Q111 78 3.4.3 Kết sàng lọc nguồn dinh dƣỡng 80 3.4.4 Kết xác định yếu tố ảnh hƣởng theo ma trận Plackett – Burman .86 3.4.5 Kết thí nghiệm bƣớc khởi đầu 95 3.4.6 Kết thí nghiệm tìm khoảng tối ƣu phƣơng pháp leo dốc .99 3.4.7 Kết xác định nồng độ tối ƣu trình lên men theo thiết kế Box – Behnken 102 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN LÊN MÊN THỬ NGHIỆM 113 3.6 KẾT QUẢ LÊN MEN THỬ NGHIỆM CHO BACILLUS SUBTILIS Q16 VÀ BACILLUS SUBTILIS Q111 114 3.7 KẾT QUẢ THU SINH KHỐI VÀ PHỐI TRỘN CHẾ PHẨM 115 3.8 KẾT QUẢ LD50 115 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 4.1 KẾT LUẬN 117 4.2 ĐỀ NGHỊ 118 MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 119 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC DANH M C CHỮ VIẾT TẮT 16S rDNA Trình tự DNA mã hóa cho RNA ribosome tiểu phần 16S ANOVA One-way analysis of variance BLAST Basic Local Alignment Search Tool BOD Biochemical Oxygen Demand bp base pair CFU Colony forming unit CMC Carboxymethyl cellulose Cs Cộng ddNTP dideoxynucleotide triphosphate DNA Deoxyribo Nucleotide Triphosphate ĐBS Đồng sông Cửu Long FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations h Giờ LD50 Lethal Dose, 50% nm nanomet NTTS Nuôi trồng thủy sản OD Optical Density PTN Phịng thí nghiệm rRNA ribosomal RNA VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization DANH MỤC DANH M C CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa E ictaluri (Holt J G cs., 1994) 12 Bảng 1.2 Bảng kết hợp dấu ma trận .29 Bảng 1.3 Ma trận quy hoạch với N = 12, k = 11 29 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 51 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 51 Bảng 2.3 Các nguồn nitơ cần khảo sát 56 Bảng 3.1 Kết phân lập 69 Bảng 3.2 Kết thử đối kháng phƣơng pháp cấy vạch vng góc 71 Bảng 3.3 Kết thử khả kháng giếng khếch tán .71 Bảng 3.4 Kết so sánh trình tự 16S rDNA chủng Bacillus Q16 Bacillus Q111 .75 Bảng 3.5 Kết test sinh hóa 76 Bảng 3.6 Giá trị OD610 mật độ tế bào (log (N/ mL)) 76 Bảng 3.7 Giá trị đo OD610 mật độ tế bào (Log N/ mL) 77 Bảng 3.8 Mật độ tế bào B subtilis Q16 B subtilis Q111 thời điểm nuôi cấy (Log (N/ mL) 78 Bảng 3.9 Bảng giá trị Log (N/mL) thu đƣợc từ nguồn nitơ khảo sát .80 Bảng 3.10 Bảng giá trị Log (N/ mL) thu đƣợc từ nguồn cacbonkhảo sát 82 Bảng 3.11 Các giá trị Log (N/ mL) thu đƣợc từ nguồn khoáng khảo sát .84 Bảng 3.12 Giá trị biến số thí nghiệm Plackett – Burman tìm yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men 86 Bảng 3.13 Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman kết thí nghiệm với mức độ yếu tố 87 Bảng 3.14 Giá trị biến số thí nghiệm Plackett – Burman tìm yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men 91 Bảng 3.15 Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman kết thí nghiệm với mức độ yếu tố 91 Bảng 3.16 Bảng bố trí trí nghiệm khởi đầu cho yếu tố ảnh hƣởng 96 Bảng 3.17 Bảng bố trí thí nghiệm khởi đầu cho yếu tố ảnh hƣởng 98 DANH MỤC Bảng 3.18 Bảng tính bƣớc chuyển động phƣơng pháp leo dốc chủng B subtilis Q16 99 Bảng 3.19 Kết Log (N/ mL) thu đƣợc sau thí nghiệm leo dốc chủng B subtilis Q16 100 Bảng 3.20 Bảng tính bƣớc chuyển động phƣơng pháp leo dốc chủng B subtilis Q111 101 Bảng 3.21 Kết sinh khối thu đƣợc sau thực phƣơng pháp leo dốc chủng B subtilis Q111 101 Bảng 3.22 Bảng giá trị biến số thí nghiệm Box – Benhken chủng B subtilis Q16 102 Bảng 3.23 Bố trí kết thí nghiệm Box – Benhken chủng B subtilis Q16 103 Bảng 3.24 Bảng giá trị biến số thí nghiệm Box – Benhken chủng B subtilis Q111 109 Bảng 3.25 Bố trí kết thí nghiệm Box – Benhken chủng B subtilis Q111 109 Bảng 3.26 Kết khảo sát thời gian tăng trƣởng môi trƣờng tối ƣu 113 Bảng 3.27 Kết LD50 115 DANH MỤC N M CÁC B ỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Biểu đồ thể tƣơng quan giá trị OD610 mật độ tế bào 77 Biểu đồ 3.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính OD610 mật độ tế bào 78 Biểu đồ 3.3 Đƣờng cong tăng trƣởng của B subtilis Q16 B subtilis Q111 theo thời gian 79 Biểu đồ 3.4 Kết nguồn nitơ khác 81 Biểu đồ 3.5 Kết nguồn cacbon khác 83 Biểu đồ 3.6 Kết nguồn khống vơ khác 85 Biểu đồ 3.7 Đƣờng cong tăng trƣởng môi trƣờng tối ƣu .114 PHỤ LỤC PH L C Hình 0.1 Hình chạy điện di gel agarose chụp hình máy Bio-rad Hình 0.2 Kết thử CMC 130 PHỤ LỤC Hình 0.3 Kết thử khả sinh α-D-glucosidase Hình 0.4 Đơng khơ thu sinh khối Bacillus Q16 Bacillus Q111 131 PHỤ LỤC PH L C  Kết giải trình tự chủng Bacillus Q16 công ty Macrogen gửi  Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Bacillus Q16 132 PHỤ LỤC  Kết giải trình tự chủng Bacillus Q111 cơng ty Macrogen gửi 133 PHỤ LỤC  Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Bacillus Q111 Bảng 0.1 Bảng số test sinh hóa phân biệt với Bacillus subtilis Bacillus subtilis Acid from inulin + Bacillus Bacillus licheniformis amyloliquefaciens D _ 134 PHỤ LỤC Arginine dihyrolase _ + _ α-D-glucosidase production D + _ β-D-glucosidase production + + _ α-D-arbinosidase production + D _ _ + + Anaerbic growth _ + _ Probionate untilization _ + _ Chain formation D D + DNA hydrolysis + + _ CMC hydrolysis + + _ L-Tryptophan-aminopeptidase production  Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm thử đối kháng phương pháp khuếch tán Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Q111 69 Q16 64.5 21.5 0.25 SS df MS F P-value 13.5 0.021312 7.708647 23 0.25 ANOVA Source of Variation F crit Between Groups 3.375 3.375 Within Groups 0.25 Total 4.375 135 PHỤ LỤC  Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố nguồn nitơ khảo sát đo OD610  Đối với chủng B subtilis Q16 Đối với chủng B subtilis Q111 136 PHỤ LỤC  Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố nguồn cacbon khảo sát đo OD610 Đối với chủng B subtilis Q16 137 PHỤ LỤC Đối với chủng B subtilis Q111  Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố nguồn khống vơ khảo sát đo OD610 Đối với chủng B subtilis Q16 138 PHỤ LỤC 139 PHỤ LỤC Đối với chủng B subtilis Q111  Kết xử lý số liệu thí nghiệm Plackett – Burman phần mềm Minitab 16.2.0 Đối với chủng B subtilis Q16 Đối với chủng B subtilis Q111 140 PHỤ LỤC  Kết phân tích hồi quy cho thí nghiệm khởi đầu phần mềm Minitab 16.2.0 Đối với chủng B subtilis Q16 141 PHỤ LỤC Đối với chủng B subtilis Q111  Kết xử lý số liệu thí nghiệm Box - Behken phần mềm Minitab 16.2.0 Đối với chủng B subtilis Q16 142 PHỤ LỤC Đối với chủng B subtilis Q111 143 PHỤ LỤC Log (N/ mL)  Đường tương quan độ đục mật độ tế bào Edwardsiella ictaluri Đƣờng tƣơng quan độ đục mật độ tế bào y = 3.7556x + 7.4056 9.4 9.2 8.8 8.6 8.4 8.2 7.8 7.6 R² = 0.9986 mật độ 0.1 0.2 0.3 0.4 Giá trị O 610nm 0.5 0.6 144 ... Q111 để sản xuất thành chế phẩm ứng dụng Và việc định danh đến lồi tiêu chí an tồn chủng làm probiotic Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: ? ?Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic từ Bacillus dùng kiểm. .. sinh vật Các chủng vi khuẩn không gây hại sản xuất siderophore sử dụng nhƣ probiotic để cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh tính gây bệnh có liên quan đến việc sản xuất siderophore đấu tranh giành... ức chế Vibrio sp Sau đó, Rosenfeld Zobell (1947) mô tả nghiên cứu sản xuất chất ức chế vi sinh vật biển từ có nhiều nghiên cứu tiếp theo, nghiên cứu sử dụng vi sinh vật nhƣ tác nhân kiểm soát