Luận văn thạc sĩ sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài mang muntiacinae ở việt nam nhằm phục vụ bảo tồn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HĨA CÁC LỒI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN Chuyên ngành Mã số : Di truyền học 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Lê Đức Minh PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đức Minh PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, người trực tiếp hướng dẫn nhiệt tình bảo tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Thầy cho nhiều kiến thức chuyên môn bồi đắp niềm đam mê, tính sáng tạo q trình nghiên cứu Bên cạnh đó, tơi muốn bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện thuận lợi động viên trình học tập mơn, tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị sở vật chất cho tơi q trình học tập thực luận văn Đồng thời gửi lời cám ơn chân thành tới cán thuộc Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội; bạn đồng nghiệp giúp thu thập, phân loại mẫu vật quý giá để sử dụng nghiên cứu Cuối cùng, muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè, người bên cổ vũ động viên tơi vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 06 năm 2015 Học viên Nguyễn Văn Thành MỤC LỤC: DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nhóm Mang 1.1.1 Nhóm Mang giới 1.1.2 Nhóm Mang Việt Nam Xây dựng phát sinh chủng loại dựa thị phân tử 2.1 Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài Mang sử dụng nghiên cứu 2.2 Các phương pháp sử dụng để xây dựng loài phát sinh 10 2.3 Phân tích thời gian tiến hóa 13 2.4 Gen thị sử dụng phân tích 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 16 16 1.1 Mẫu vật nghiên cứu 16 1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 17 1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: 23 Phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Tách chiết ADN tổng số 23 2.2 Phản ứng PCR 24 2.3 Điện di, tinh giải trình tự gen 26 2.4 Xây dựng phát sinh chủng loại phân tích thời gian tiến hóa 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 Kết tách chiết ADN tổng số 31 Kết khuyếch đại gen phản ứng PCR 32 Kết giải trình tự 34 Kết xây dựng phát sinh chủng loại 35 4.1 Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ 36 4.2 Nhánh B 36 Kết phân tích thời gian tiến hóa KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 45 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 47 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 47 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribo nucleic acid Axit deoxyribonucleic bp base pair Cặp bazơ nitơ EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit ethylen diamin tetraaxetic kb kilobase(=1000bp) Kilo bazơ ML Maximum Likelyhood Hợp lý tối đa MP Maximum Parsimony Tiết kiệm tối đa mtDNA mitochondrial DNA Hệ gen ty thể OD Optical Density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối nR Number of root tree Số có gốc nU Number of unroot tree Số không gốc unweighted pair group with unweighted pair group with arithmetic mean arithmetic mean UPGMA i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Mang Ấn Độ (M vaginalis) Hình Mang Vũ Quang (M vuquangensis) Hình Mang Trường Sơn (M truongsonensis) Hình Bản đồ địa điểm khu bảo tồn tiến hành thu mẫu 22 Hình Ảnh điện di ADN tổng số số mẫu xương gel Agarose 1%, Marker 1kb Hình Ảnh điện di ADN tổng số số mẫu da khô gel Agarose 1%, Marker 1kb Hình Ảnh điện di số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1 (450bp) gel Agarose 1%, marker 100bp Hình Ảnh điện di số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-2 (450bp) gel Agarose 1%, marker 100bp Hình Ảnh điện di số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4 (450bp) gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 10 Ảnh điện di số sản phẩm nhân phân đoạn gen G-fib (450bp) gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 11 Ảnh điện di sản phẩm PCR lần lần Hình 12 Tín hiệu bị nhiễu nucleotide đầu phản ứng giải trình tự Hình 13 Cây phát sinh chủng loại thu dựa liệu gen cytochrome b (1140bp) sử dụng phương pháp Bayesian Hình 14 31 31 32 32 33 33 33 34 38 Cây phát sinh chủng loại dựa liệu kết hợp gen ty thể gen nhân (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị 41 thơng tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML Hình 15 Cây phát sinh chủng loại thể thời gian tiến hóa nhóm Mang 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Danh sách loài Mang giới Bảng Số lượng khơng gốc có gốc với số lượng taxa 10 từ - 10 Bảng Danh sách thông tin mồi sử dụng cho nghiên cứu 17 Bảng Thông tin mã số ngân hàng gen trình tự tên 18 mẫu, địa điểm thu mẫu Bảng Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng Khoảng cách di truyền mẫu Mang 40 Roosevelt dựa liệu kết hợp gen Cyt-b, ND4, Bảng 16S, G - fibrinogen Khoảng cách di truyền mẫu Mang lớn 42 Bảng Địa điểm thu mẫu Mang lớn 42 Bảng 10 Khoảng thời gian tiến hóa vị trí tiến 43 hóa MỞ ĐẦU Việt Nam biết đến đất nước đa dạng cao hệ sinh thái, sơng ngịi, hệ thống lồi động thực vật Các vùng tự nhiên Việt Nam có nhiều lồi nhiều số khơng tìm thấy nơi khác giới Các nghiên cứu nhằm tìm kiếm lồi mới, đánh giá chi tiết mức độ đa dạng hệ thống động thực vật Việt Nam tiếp tục thu hút quan tâm nhà nghiên cứu Tuy nhiên, cịn nhiều lồi Việt Nam chưa nghiên cứu chi tiết nhiều khó khăn gặp phải trình nghiên cứu Cụ thể, 15 năm trở lại đây, năm loài Mang (Muntiacus) tìm thấy Việt Nam dạng lồi xác nhận có nước [ , 12 , 42] Mặc dù vậy, chưa có nghiên cứu chi tiết, đánh giá phân bố, đa dạng di truyền quan hệ tiến hóa loài Mang lãnh thổ Việt Nam Điều phần tính q hiếm, khó bắt gặp tập tính nhút nhát lồi Mang Ngồi ra, chúng xếp vào hạng mục thiếu liệu, nguy cấp nguy cấp sách đỏ giới Do đó, việc điều tra sử dụng phương pháp truyền thống khơng đánh giá xác mức độ đa dạng nhóm này, mẫu thu từ điều tra thực địa không cho phép thực nghiên cứu so sánh kỹ lưỡng mặt hình thái Trong đó, với phát triển sinh học phân tử năm gần đây, phương pháp sử dụng ADN dần trở thành công cụ hữu hiệu để điều tra tổng thể lồi khó bắt gặp giúp làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa lồi nghiên cứu Trong hồn cảnh này, việc nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu không trực tiếp dựa, thị phân tử ADN mẫu Mang hứa hẹn có hiệu cao Vì vậy, chúng tơi thực đề tài “Sử dụng số thị phân tử nghiên cứu tiến hóa lồi Mang (Muntiacinae) Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn” với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, phân bố, mối quan hệ tiến hóa lồi Mang Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nhóm Mang 1.1.1 Nhóm Mang giới Mang nhóm lồi thú móng guốc thuộc họ hươu nai Cervidae, phân họ Muntiacinae, giống Muntiacus; nhóm giới nay, dựa theo liệu thu sách đỏ giới (The IUCN red list of threatended species) xác định có 13 lồi (Bảng 1) Mang có thể nhỏ, sống đơn độc theo nhóm nhỏ, môi trường sống chúng thường khu rừng xanh nhiệt đới châu Á với độ cao tương đối lớn Rất nhiều loài Mang bị đe dọa tình trạng săn bắn bất hợp pháp, tình trạng dần mơi trường sống chúng [20 , 30] Hiện nay, vài loài Mang Mang đen (Muntiacus crinifrons), Mang Reeve (Muntiacus reevesi) tập trung nghiên cứu, đánh giá [11 , 31 , 35] Tuy nhiên, phần lớn loài Mang khác chưa có nghiên cứu cụ thể Do đó, thơng tin lồi cịn ít, chí số lồi Mang khơng phát cuối kỷ 20, đầu kỷ 21 (như Mang Roosevelt Việt Nam - Lào, Mang Ghongshan tây nam Trung Quốc, Mang lớn vùng biên giới Việt Nam Lào) [30] Loài Mang Roosevelt (M rooseveltorum) từ sau khhi mô tả năm 1932 bắt gặp, năm 1999 tái phát trở lại tại Lào, mẫu tìm thấy mẩu xương nhỏ sọ [7]; từ thời điểm 1999 chưa có cơng bố nghiên cáo cho thấy xuất loài Loài Mang Putao (M putaoensis) mơ tả năm 1999 [6] có vùng phân bố phía Bắc Myanmar có quan hệ gần với lồi Mang khác có khu phân bố dãy Trường Sơn Mang Trường Sơn (M truongsonensis) Mang Roosevelt (M rooseveltorum) Ba lồi có hình thái nhỏ nhiều đặc điểm giống kể quan hệ di truyền [6 , 23] Mang vàng Borneo (Muntiacus 51 Phụ lục Kết đo mật độ quang phổ số mẫu nghiên cứu Mẫu A260/A280 [ADN] (µg/ml) Mu 10 1,50 81,53 Mu 11 1,60 105,5 Mu 2.1 2,00 43,1 Mu 2.2 1,97 81,63 Mu 2.4 1,85 201,8 Mu 2.5 2,00 22,9 Mu 2.6 1,87 36,64 Mu 2.7 1,86 302 Mu 2.8 1,89 86,74 Mu 2.9 2,00 21,02 Mu 1,68 66,44 Mu 1,48 65,53 Phụ lục Mơ hình tiến hóa phát sinh chủng loại thu dựa hệ liệu kết hợp tổ hợp chung gen ty thể phương pháp Bayesian (Hình 13) số burnin Model: Best-fit model (TVM+I+G) selected by AICc in Modeltest 3.7; Lset Base=(0.3147 0.2530 0.1336) 188.9496 6.9418 13.2484 229.4747) Shape=0.7597 Chỉ số Burnin: 15 Pinvar=0.4899; Nst=6 Rmat=(5.5312 Rates=gamma Phụ lục Mơ hình tiến hóa phát sinh chủng loại thu dựa hệ liệu gen tổ hợp chung gen ty thể phương pháp Bayesian (Hình 13) số burnin Model: Codon gen Cyt-b: Best-fit model (K80+G) selected by AICc in Modeltest Lset Base=equal Shape=0.4661 Nst=2 TRatio=4.5858 Rates=gamma Pinvar=0; Codon gen Cyt-b: Likelihood settings from best-fit model (HKY+I) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=(0.2112 0.2433 0.1360) Rates=equal Nst=2 TRatio=6.8847 Pinvar=0.8266; Codon gen Cyt-b: Likelihood settings from best-fit model (TrN+I) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=(0.4165 0.3184 0.0426) 101.3073 1.0000 1.0000 59.2620) Nst=6 Rmat=(1.0000 Rates=equal Pinvar=0.1060; Codon gen ND4: Likelihood settings from best-fit model (K80+I) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=equal Nst=2 TRatio=33.0546 Rates=equal Pinvar=0.7744; Codon gen ND4: Likelihood settings from best-fit model (JC) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=equal Nst=1 Rates=equal Pinvar=0; Codon gen ND4:Likelihood settings from best-fit model (HKY) selected by AICc in Modeltest 3.7 on Lset Base=(0.5062 0.2344 0.0605) Rates=equal Nst=2 TRatio=35.0940 Pinvar=0; Codon gen G-fib: Likelihood settings from best-fit model (JC) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=equal Nst=1 Rates=equal Pinvar=0; Codon gen G-fib: Likelihood settings from best-fit model (JC) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=equal Nst=1 Rates=equal Pinvar=0; Codon gen G-fib: Likelihood settings from best-fit model (JC) selected by AICc in Modeltest 3.7 Lset Base=equal Chỉ số Burnin: 13 Nst=1 Rates=equal Pinvar=0; Phụ lục 5: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự gen ND4 mẫu M1 Phụ lục 6: Hình ảnh tín hiêu giải trình tự phân đoạn gen Cyt-b mẫu M1 Phụ luc 7: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự phân đoạn gen Cyt-b mẫu M1 Phụ lục 8: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự phân đoạn gen 16S mẫu M1 Phụ lục 9: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự phân đoạn gen G-fib mẫu M1 ... NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN Chuyên ngành Mã số : Di truyền học 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ... nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu không trực tiếp dựa, thị phân tử ADN mẫu Mang hứa hẹn có hiệu cao Vì vậy, chúng tơi thực đề tài ? ?Sử dụng số thị phân tử nghiên cứu tiến hóa lồi Mang (Muntiacinae) ... nghiên cứu 16 1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 17 1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: 23 Phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Tách chiết ADN tổng số 23