Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 73 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
73
Dung lượng
2,8 MB
Nội dung
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------
NGUYỄN VĂN THÀNH
SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG
(MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM
PHỤC VỤ BẢO TỒN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÀ NỘI - 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------
NGUYỄN VĂN THÀNH
SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG
(MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM
PHỤC VỤ BẢO TỒN
Chuyên ngành
: Di truyền học
Mã số
: 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Cán bộ hướng dẫn:
TS. Lê Đức Minh
PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Đức Minh cùng PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, là những người đã trực tiếp
hướng dẫn và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Thầy cô đã cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên môn cũng như bồi đắp niềm
đam mê, tính sáng tạo trong quá trình nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi cũng muốn
bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo của Bộ môn Di truyền học,
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và
động viên tôi trong quá trình học tập tại bộ môn, đã tạo điều kiện thuận lợi về
trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
Đồng thời tôi cũng gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ thuộc Trung
tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội; cùng các
bạn đồng nghiệp đã giúp tôi thu thập, phân loại các mẫu vật quý giá để sử dụng
trong nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân,
bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó
khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 06 năm 2015
Học viên
Nguyễn Văn Thành
MỤC LỤC:
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
i
DANH MỤC CÁC HÌNH
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
iii
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2
1.1. Tổng quan về nhóm Mang
2
1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới
2
1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam
4
2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử
8
2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài Mang sử dụng trong
nghiên cứu
8
2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh
10
2.3. Phân tích thời gian tiến hóa
13
2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích
13
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
16
16
1.1. Mẫu vật nghiên cứu
16
1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
16
1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR
17
1.4. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:
23
2. Phương pháp nghiên cứu
23
2.1. Tách chiết ADN tổng số
23
2.2. Phản ứng PCR
24
2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen
26
2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa
27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
31
1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
31
2. Kết quả khuyếch đại gen bằng phản ứng PCR
32
3. Kết quả giải trình tự
34
4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại
35
4.1. Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ
36
4.2. Nhánh B
36
5. Kết quả phân tích thời gian tiến hóa
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
42
45
KẾT LUẬN
45
KIẾN NGHỊ
46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
47
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
47
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
47
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
ADN
Deoxyribo nucleic acid
Axit deoxyribonucleic
bp
base pair
Cặp bazơ nitơ
EDTA
Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
Axit ethylen diamin tetraaxetic
kb
kilobase(=1000bp)
Kilo bazơ
ML
Maximum Likelyhood
Hợp lý tối đa
MP
Maximum Parsimony
Tiết kiệm tối đa
mtDNA
mitochondrial DNA
Hệ gen ty thể
OD
Optical Density
Mật độ quang học
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
rcf
relative centrifugal force
Lực ly tâm tương đối
nR
Number of root tree
Số cây có gốc
nU
Number of unroot tree
Số cây không gốc
unweighted pair group with
unweighted pair group with
arithmetic mean
arithmetic mean
UPGMA
i
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.
Mang Ấn Độ (M. vaginalis)
4
Hình 2.
Mang Vũ Quang (M. vuquangensis)
6
Hình 3.
Mang Trường Sơn (M truongsonensis)
7
Hình 4.
Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu
22
Hình 5.
Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu xương trên gel
Agarose 1%, Marker 1kb
Hình 6.
Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu da khô trên gel
Agarose 1%, Marker 1kb
Hình 7.
Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp
Hình 8.
Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-2
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp
Hình 9.
Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp
Hình 10.
Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen G-fib
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp
Hình 11.
Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2
Hình 12.
Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng
giải trình tự
Hình 13.
Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên dữ liệu gen
cytochrome b (1140bp) sử dụng phương pháp Bayesian
Hình 14.
31
31
32
32
33
33
33
34
38
Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 3 gen
ty thể và 1 gen nhân (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị
41
thông tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML
Hình 15.
Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của
nhóm Mang
ii
44
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.
Danh sách các loài Mang trên thế giới
3
Bảng 2.
Số lượng cây không gốc và có gốc với số lượng taxa
10
từ 2 - 10
Bảng 3.
Danh sách và thông tin mồi sử dụng cho nghiên cứu
17
Bảng 4.
Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự cùng tên
18
mẫu, địa điểm thu mẫu
Bảng 5.
Thành phần phản ứng PCR
25
Bảng 6.
Chu trình nhiệt phản ứng PCR
25
Bảng 7.
Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang
40
Roosevelt dựa trên dữ liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4,
16S, G - fibrinogen
Bảng 8.
Khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn
42
Bảng 9.
Địa điểm thu các mẫu Mang lớn
42
Bảng 10.
Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến
43
hóa
iii
MỞ ĐẦU
Việt Nam được biết đến là một đất nước đa dạng cao về hệ sinh thái, sông ngòi,
cũng như hệ thống các loài động thực vật. Các vùng tự nhiên của Việt Nam có
nhiều loài và nhiều trong số đó không tìm thấy ở nơi khác trên thế giới. Các nghiên
cứu nhằm tìm kiếm các loài mới, đánh giá chi tiết về mức độ đa dạng của hệ thống
động thực vật ở Việt Nam đã và đang được tiếp tục thu hút sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu. Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều loài ở Việt Nam chưa được nghiên cứu chi
tiết bởi nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình nghiên cứu.
Cụ thể, trong 15 năm trở lại đây, năm loài Mang (Muntiacus) đã được tìm thấy
ở Việt Nam dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có ở trong nước [7 , 12 , 42].
Mặc dù vậy, vẫn chưa có các nghiên cứu chi tiết, đánh giá phân bố, đa dạng di
truyền cũng như quan hệ tiến hóa giữa các loài Mang trên lãnh thổ Việt Nam. Điều
này một phần do tính quý hiếm, khó bắt gặp cùng tập tính nhút nhát của các loài
Mang. Ngoài ra, chúng đã được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu, sắp nguy cấp và
nguy cấp trong sách đỏ thế giới. Do đó, việc điều tra sử dụng các phương pháp
truyền thống có thể không đánh giá được chính xác mức độ đa dạng trong nhóm
này, vì những mẫu thu được từ điều tra thực địa hầu như không cho phép thực hiện
những nghiên cứu so sánh kỹ lưỡng về mặt hình thái. Trong khi đó, với sự phát
triển của sinh học phân tử trong những năm gần đây, những phương pháp sử dụng
ADN đã dần trở thành những công cụ hữu hiệu để điều tra tổng thể những loài khó
bắt gặp và có thể giúp làm sáng tỏ những mối quan hệ tiến hóa của những loài được
nghiên cứu. Trong hoàn cảnh này, việc nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu
không trực tiếp dựa, và các chỉ thị phân tử ADN đối với các mẫu Mang hứa hẹn có
hiệu quả cao.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong
nghiên cứu tiến hóa các loài Mang (Muntiacinae) ở Việt Nam nhằm phục vụ
bảo tồn” với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, cũng như phân bố, cùng
mối quan hệ tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam.
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về nhóm Mang
1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới
Mang là một nhóm các loài thú móng guốc thuộc họ hươu nai Cervidae, phân
họ Muntiacinae, giống Muntiacus; nhóm này hiện nay trên thế giới cho đến nay,
dựa theo dữ liệu thu được của sách đỏ thế giới (The IUCN red list of threatended
species) được xác định có 13 loài (Bảng 1). Mang có cơ thể nhỏ, sống đơn độc hoặc
theo các nhóm nhỏ, môi trường sống của chúng thường là các khu rừng xanh nhiệt
đới ở châu Á với độ cao tương đối lớn. Rất nhiều loài Mang hiện đang bị đe dọa bởi
tình trạng săn bắn bất hợp pháp, cũng như tình trạng mất dần môi trường sống của
chúng [20 , 30].
Hiện nay, một vài loài Mang như Mang đen (Muntiacus crinifrons), Mang
Reeve (Muntiacus reevesi) đang được tập trung nghiên cứu, đánh giá [11 , 31 , 35].
Tuy nhiên, phần lớn các loài Mang khác đều chưa có các nghiên cứu cụ thể. Do đó,
thông tin về các loài này còn rất ít, thậm chí một số loài Mang đã không được phát
hiện cho đến cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21 (như Mang Roosevelt ở Việt Nam - Lào,
Mang Ghongshan ở tây nam Trung Quốc, Mang lớn ở vùng biên giới Việt Nam Lào) [30]. Loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) từ sau khhi được mô tả năm
1932 rất hiếm khi được bắt gặp, cho đến năm 1999 được tái phát trở lại tại hiện tại
Lào, mặc dù vậy các mẫu tìm thấy chỉ là các mẩu xương nhỏ sọ [7]; và từ thời điểm
1999 cho đến nay chưa có công bố của nghiên cáo nào cho thấy sự xuất hiện của
loài này. Loài Mang Putao (M. putaoensis) được mô tả năm 1999 [6] có vùng phân
bố ở phía Bắc Myanmar có quan hệ rất gần với 2 loài Mang khác có khu phân bố ở
trong dãy Trường Sơn là Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) và Mang
Roosevelt (M. rooseveltorum). Ba loài này có hình thái nhỏ và nhiều đặc điểm khá
giống nhau kể cả về quan hệ di truyền [6 , 23]. Mang vàng Borneo (Muntiacus
2
atherodes) là loài đặc hữu ở Borneo. Trong suốt một thời gian dài, đã có sự nhầm
lẫn giữa loài Mang vàng Borneo và loài Mang thường [30].
Bảng 1. Danh sách các loài Mang trên thế giới
STT
Tên loài
Phân bố
1
Muntiacus atherodes
Đảo Borneo (Brunei, Indonesia và Malaysia)
2
Muntiacus crinifrons
Trung Quốc
3
Muntiacus feaes
Myanmar, Thái Lan
4
Muntiacus gongshanensis
Trung Quốc, Myanmar
5
Muntiacus montanus
Indonesia
6
Muntiacus muntjak
Bruine, Indonesia, Malaysia, Thái Lan
7
Muntiacus vaginalis
8
Muntiacus puhoatensis
Việt Nam
9
Muntiacus putaoensis
Ấn độ, Myanmar
10
Muntiacus reveesi
Trung Quốc, Đài Loan
11
Muntiacus rooseveltorum
Lào, Việt Nam
12
Muntiacus truongsonensis
Lào, Việt Nam
13
Muntiacus vuquangensis
Lào, Việt Nam
Campuchia, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Thái
Lan, Việt Nam, Trung Quốc.
Nhóm Mang hiện được các nhà tiến hóa rất quan tâm bởi sự đa dạng trong số lượng
nhiễm sắc thể giữa các loài Mang. Cụ thể, ở Mang thường, đây là cũng là loài thú
có số lượng nhiễm sắc thể ít nhất với 2n = 6 ở giống cái và 2n = 7 ở giống đực;
Mang Trung Quốc (M. reevesi) có 2n = 46 ở cả hai giới, M. crinifrons 2n = 8 ở
giống cái và 2n = 9 ở giống đực, M. feae 2n = 13 ở giống cái và 2n = 14 ở giống
đực [44]. Tuy nhiên, cho đến nay, nguyên nhân của hiện tượng này còn chưa được
biết rõ.
3
1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam
Hiện nay, Việt Nam được thống kê có 5 loài Mang sinh sống [7 , 12 , 42] bao
gồm: Mang Ấn Độ (M. vaginalis) [42], Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) [10], Mang
Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) [36], Mang
Vũ Quang hay Mang lớn (Megamuntiacus vuquangensis hay Muntiacus
vuquangensis) [40 , 43]. Sau đây là một số mô tả về 5 loài Mang được xác định là
có thể có mặt ở Việt Nam.
1.1.2.1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis)
Hình 1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis)
Mang Ấn Độ (M. vaginalis) hay Mang thường (common muntjac) là tên gọi
thông thường của loài Mang này (Hình 1). Loài này, con đực có sừng nhỏ dài
khoảng 15cm và chỉ có duy nhất 1 nhánh. Mang Ấn Độ đôi lúc còn được gọi là
“Mang sủa” bởi tiếng kêu đặc trưng của nó khi có nguy hiểm. Những bằng chứng
cổ sinh vật học cho thấy Mang Ấn Độ đã xuất hiện ít nhất là từ cuối kỷ Pleistocene
cách đây 12.000 năm. Loài này thường bị săn bắn để lấy da và thịt. Mang Ấn Độ là
loài có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang.
Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet,
Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy loài này có sự đa dạng
rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân loài đã được mô tả dựa trên vùng phân
bố về địa lý [16].
4
1.1.2.2. Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis)
Loài Mang này được mô tả một cách ngẫu nhiên trong một bài báo phổ thông
[10] dựa trên cơ sở các mẫu gạc và một phần trán được Lê Trọng Trải và Đỗ Tước
thu được từ khu vực Pù Hoạt, Quế Phong, Nghệ An, Việt Nam vào năm 1997 [41].
Tuy vậy, loài Mang này chưa từng được nghiên cứu chi tiết về mặt hình thái cũng
như chưa từng được đưa vào những nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loại
để đánh giá tính xác thực về mặt di truyền. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi
sẽ tiến hành phân tích di truyền cho loài này dựa trên các mẫu được xác định về mặt
hình thái là của loài Mang Pù Hoạt.
1.2.3. Mang Roosevelt (M. rooseveltorum)
Loài Mang Roosevelt được mô tả vào năm 1932 bởi Osgood [33] và trong
suốt 60 năm tiếp theo không có bất kỳ mẫu vật nào được ghi nhận. Loài này được
ghi nhận tại 3 địa điểm ở Lào, và các mẫu thu được từ thợ săn đều là các mẫu vật
không nguyên vẹn. Cụ thể, vào tháng 2 năm 1995, hai mẫu xương sọ gần như
nguyên vẹn và 6 phần xương sọ khác đã được tìm thấy tại Lào [7]. Loài này hiện
nay được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu trong danh sách đỏ thế giới (IUCN). Hiện
nay phân loại cho loài này còn khá nhiều tranh cãi. Về mặt hình thái, loài này rất
khó phân biệt với các loài Mang có quan hệ gần khác như Mang Putao và Mang
Trường Sơn. Nguyên nhân của vấn đề này là bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật
cho đến nay rất ít [42]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai
khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân
Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào,
chúng tôi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này. Khi thực
hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên
Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng
tôi đã xác nhận sự có mặt của loài Mang này. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái
phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định loài này có khu vực phân bố ở
Việt Nam [28]. Ngoài ra, chúng tôi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di
5
truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn Xuân Liên, kết quả cho thấy, trong loài
này có những nhánh tiến hóa riêng biệt. Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể
loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách
biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu
bảo tồn. Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể
trong hai khu bảo tồn [4].
Hình 2. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis)
1.2.4. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis)
Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) hay còn được gọi là Mang lớn (Giant
muntjac hay Megamuntiacus vuquangensis) (Hình 2). Vào năm 1994 nhóm nghiên
cứu của Tổ chức Bảo tồn Động vật Hoang dã (Wildlife Conservation Society) đã
tìm thấy một số mẫu sừng có kích thước lớn bất thường của nhóm Mang tại các
ngôi làng thuộc dãy Trường Sơn ở phía Đông trung tâm Lào, gần với biên giới VN
và họ cũng tìm thấy một con đực có sừng Mang các đặc điểm tương tự bị nhốt ở
một gánh xiếc vào tháng 3 năm 1994. Với kích thước lớn và có nhiều đặc điểm hình
thái khác biệt với các loài đã mô tả, các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết về khả
năng đây là một loài mới [17 , 40]. Trong giai đoạn này, các mẫu sừng và hộp sọ có
các đặc điểm tương tự cũng được tìm thấy xung quanh khu bảo tồn Vũ Quang ở
Việt Nam [38], và ở một số khu vực khác cùng địa bàn trên [12]. Vì vậy, loài Mang
lớn (Megamunticus vuquangensis) đã được mô tả vào năm 1994. Chúng đã được
chứng minh là một loài mới dựa trên cơ sở về kích thước và sự sai khác của trình tự
6
ADN của các gen ty thể giữa Mang lớn, Mang Ấn Độ, Mang Trung Quốc
(Muntiacus reevesi) [19].
Vncreatures
W. Robichaud
Hình 3. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis)
1.2.5. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis)
Về mặt hình thái, Mang Trường Sơn (Hình 3) được mô tả có kích thước cơ
thể nhỏ hơn Mang Ấn Độ. Chúng có màu đen, trọng lượng xấp xỉ 15kg; đuôi rộng
và ngắn, đen ở đỉnh đồng thời có dải trắng bên dưới. Hộp sọ của Mang Trường Sơn
nhỏ hơn so với Mang thường, gạc chính ngắn [36]. Trình tự ADN của 6 mẫu có đặc
điểm nhận dạng của Mang Trường Sơn cho thấy đây là loài Mang khác với các loài
đã biết. Với phát hiện mới này, đây là loài móng guốc thứ 3 được xác nhận là loài
mới ở Việt Nam trong vòng 5 năm. Mang Trường Sơn là loài Mang thứ hai được
tìm thấy và mô tả ở dãy Trường Sơn là loài mới sau Mang Vũ Quang (M.
vuquangensis). Các mô tả này dựa trên hình thái xương sọ, trình tự ADN và thông
qua phỏng vấn người dân [36].
Trong các loài trên, ngoại trừ loài Mang Ấn Độ, bốn loài Mang còn lại đều
được tìm thấy trong vòng 15 năm trở lại đây hoặc dưới dạng loài mới hoặc được xác
nhận là có mặt trong nước. Những loài Mang cho đến nay vẫn được coi là không có
ở Việt Nam nhưng phân bố ở gần biên giới , như loài M. reevesi có thể có mặt ở
nước ta nếu có những điều tra chi tiết hơn ở khu vực phía Bắc. Đồng thời loài Mang
7
Pù Hoạt được mô tả vào năm 1997 cho đến nay vẫn chưa có bất cứ nghiên cứu nào
ở cấp độ phân tử để đánh giá tính xác thực của loài này. Hơn nữa, Việt Nam có thể
còn có những loài ẩn sinh chưa được biết đến. Để hiểu rõ hơn mức độ đa dạng của
nhóm này ở nước ta, xác định những thông tin cơ bản như vùng phân bố và số
lượng chính xác của các loài thuộc nhóm Mang cần có những nghiên cứu chi tiết
hơn đặc biệt cần có những nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để
đánh giá mức độ đa dạng di truyền [2].
2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử
2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử
dụng trong nghiên cứu
Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di
truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu
hiệu hình thái bên ngoài, tập tính, cấu trúc tế bào. Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu
hình thái cho thấy một số hạn chế, cụ thể như ở các loài rất xa nhau nhưng do hiện
tượng đồng hình nên có hình thái giống nhau, hay ở một số trường hợp, đặc điểm
kiểu hình rất khó quan sát như ở các vi sinh vật [1]. Từ giữa những năm 1990, với
sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một số phương pháp nghiên cứu mới
trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại
học phân tử [1]. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN)
trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) để giúp xây dựng cây
phát sinh chủng loại. Trong đó, việc sử dụng chỉ thị là trình tự ADN cho hiệu quả và
độ tin cậy cao trong các nghiên cứu [25]. Trong trường hợp này, các dấu hiệu phân
tử (chủ yếu là nucleotide) có thể khắc phục những khó khăn của phương pháp phân
loại dựa trên hình thái [1].
Hiện nay có một số phương pháp cơ bản sử dụng chỉ thị ADN để xác định các
mối quan hệ di truyền như: Microsatellites, RFLP (restriction fragment length
polymorphisms), giải trình tự ADN (DNA sequence). Với phương pháp giải trình tự
(DNA sequence) các vùng gen cần thiết được nhân lên bằng phản ứng PCR để tiến
hành xác định chính xác trình tự các nucleotide trên đoạn gen mong muốn. Dựa vào
8
tốc độ biến đổi của các nucleotide trên các vùng gen, chúng ta có thể xác định mối
quan hệ di truyền giữa các loài. Cụ thể, mức độ thay thế các nucleotide tại mỗi vùng
ADN của hệ gen là khác nhau và phụ thuộc áp lực chọn lọc tự nhiên trên mỗi locut
và chức năng của sản phẩm gen. Tuy vậy, ở các locut có áp lực chọn lọc tương
đương thì tốc độ thay đổi trong các trình tự ADN là ổn định, khi xét trong quãng
thời gian tiến hóa lâu dài. Quan hệ di truyền giữa tất cả các dạng sống đều có thể
được xác định dựa trên việc so sánh các chỉ thị phân tử giữa chúng với nhau. Có
nhiều phương pháp được thiết lập nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các
loài. Một trong nhưng phương pháp cơ bản nhất là xây dựng sơ đồ hình cây dựa
trên các chỉ thị di truyền để mô tả mối quan hệ giữa các loài, gọi là cây phát sinh
chủng loại hay cây tiến hóa (Phylogenetic tree). Ngoài việc khắc phục được một số
hạn chế của phân loại học truyền thống, nó cũng có nhiều ưu điểm khác như: kết
quả thí nghiệm thường khách quan, chính xác, không phụ thuộc vào chủ quan của
người quan sát như trong phân loại học dựa trên hình thái [25].
Cơ sở phân loại của phương pháp này chủ yếu dựa trên trình tự ADN được xây
dựng từ bốn nucleotide là giống nhau ở mọi sinh vật do đó tiện so sánh, nghiên cứu
ngay cả ở những sinh vật khác xa nhau [25]. Sự sai khác trong các trình tự ADN
được xem là kết quả của quá trình tiến hóa phân tử theo thời gian. Do vậy, các nhà
khoa học xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng việc so sánh các trình tự ADN và
phân tích sử dụng các thuật toán xác suất. Cây phát sinh chủng loại thể hiện đa dạng
di truyền, mối quan hệ và tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Dựa trên loại thuật toán
xác suất được sử dụng để phân tích dữ liệu, người ta chia thành nhiều phương pháp
xây dựng cây phát sinh chủng loại khác nhau. Phân tích phát sinh chủng loại sử
dụng trình tự ADN là một phần quan trọng trong các nghiên cứu như: sinh học phân
tử, sinh học phát triển, di truyền học quần thể, tiến hóa và đa dạng sinh học [25].
Mỗi cây phát sinh chủng loại thường chỉ là một phần của cây tiến hóa xuất phát
từ một tổ tiên chung. Tận cùng của mỗi cây phát sinh chủng loại thường là một hoặc
một số taxon. Điểm nằm giữa phân nhánh (node) đại diện cho tổ tiên chung của các
nhóm loài riêng biệt trước khi phân li tiến hóa. Chiều dài mỗi nhánh thể hiện mức
9
độ khác biệt giữa các taxon. Các cây tiến hóa có điểm xác định tổ tiên chung gọi là
các cây tiến hóa có gốc (root trees), ngược lại, các cây tiến hóa không gốc (unroot
trees) chỉ phản ánh mối quan hệ và sự sai khác giữa các taxon. Số lượng cây tiến
hóa tăng lên cùng với số lượng taxon nghiên cứu (Bảng 2) [1]. Cụ thể, số cây phát
sinh chủng loại có gốc (NR) và không gốc (NU) tương ứng là:
NR = (2n-3)!/[2n-2(n-2)!]
với n ≥ 2
(Phương trình 2.1)
NU = (2n-5)!/[2n-3(n-3)!]
với n ≥ 3
(Phương trình 2.2)
Dù vây, việc xây dựng cây tiến hóa nào cũng đều cần đến nhóm ngoài, hay còn
gọi là các taxon đối chứng [1 , 34].
Bảng 2. Số lượng cây không gốc và có gốc với số lượng taxon từ 2-10
Số
Số lượng
Số lượng
taxon
cây không gốc
cây có gốc
2
1
1
3
1
3
4
3
15
5
15
105
6
105
945
7
945
10395
8
10395
135135
9
135135
2027025
10
2027025
34459425
2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh
Để xác định được cây loài phát sinh, các dữ liệu ADN thường được phân tích
bằng các thuật toán xác suất. Hiện nay nhiều dạng thuật toán khác nhau được dùng
trong các phần mềm máy tính là cơ sở của nhiều phương pháp xây dựng cây loài
phát sinh khác nhau như: ma trận khoảng cách (Distance Matrix), neighbour
joining, tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum
Likelihood) và Bayesian. Trong nghiên này, chúng tôi sử dụng đồng thời 3 phương
10
pháp là tiết kiệm tối đa (MP), hợp lý tối đa (ML) và Bayesian nhằm so sánh các kết
quả thu được để tăng độ tin cậy cho kết quả cuối cùng. Ba phương pháp kể trên đều
đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu tiến hóa và đã cho kết quả với độ tin cậy
tốt ở các nghiên cứu trước đây [1 , 25 , 34].
2.2.1. Ma trận khoảng cách (Distance matrix)
Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ
lâu trong các nghiên cứu tiến hóa. Trong số đó, thuật toán UPGMA (unweighted
pair group with arithmetic mean) phân tích tất cả các dấu hiệu, qua đó xác định
khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp nhóm từng cặp mẫu có
khoảng cách di truyền ngắn nhất. Thuật toán này coi tốc độ tiến hóa của các
nucleotide là như nhau ở mọi nhánh tiến hóa. Tuy nhiên, điều này không phải lúc
nào cũng đúng, bởi vì tốc độ tiến hóa tại các vùng gen khác nhau có tốc độ khác
nhau phụ thuộc sản phẩm chúng mã hóa và áp lực chọn lọc đối với vùng gen đó [1].
Do vậy, ưu điểm của thuật toán này là có tốc độ phân tích nhanh và đơn giản,
UPGMA sẽ phù hợp nhất khi sử dụng với cây tiến hóa có tốc độ tiến hóa ở các
nhánh là như nhau. Thuật toán này cũng sẽ dùng phù hợp để xử lý một lượng lớn dữ
liệu, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài, nhưng không phản ánh
được tiến hóa ở mỗi gen [1].
2.2.2. Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony)
Phương pháp này được đề xuất vào năm 1963 bởi Edwards và Cavalli-Sforza
[15]. Tích phân tiến hóa là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên
hệ dữ liệu là các trình tự ADN, so sánh các vị trí giữa các nucleotide tương ứng
trong hệ dữ liệu ADN này. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi phương pháp này
dựa trên nguyên tắc sinh học “đột biến hiếm khi xảy ra”. Thuật toán này cho rằng
cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có số đột biến thấp nhất trong tất cả các cây có thể
tìm được giữa các taxon được phân tích [1 , 34]. Thuật toán của tích phân tiến hóa
đầu tiên sẽ xác định tất cả các vị trí có giá trị thông tin bằng cách so sánh tất cả các
trình tự nucleotide tại mỗi vị trí, rồi từ xác định ra cây cần ít đột biến nhất tại mỗi vị
11
trí. Cây phát sinh nào cần ít đột biến nhất khi xét tại tất cả các vị trí được gọi là cây
tiến hóa phỏng đoán. Đây là cây được cho là gần với cây tiến hóa đúng nhất. Với
phương pháp này, chúng ta có thể dự đoán tổ tiên của mỗi nhánh tiến hóa. Tuy
nhiên, tốc độ biến đổi giữa các nucleotide là không như nhau, ví dụ như các đột
biến đồng hoán có tỷ lệ xảy ra cao gấp 3 lần các đột biến dị hoán. Bởi vậy đôi khi
phương pháp tiêt kiệm tối đa có thể không phản ánh đúng về thời điểm xảy ra sự
tách ly tiến hóa giữa các loài vì tốc độ tiến hóa của các nucleotide giữa các nhánh là
khác nhau [1].
2.2.3. Hợp lý tối đa (Maximum Likelihood)
Phương pháp hợp lý tối đa là một phương pháp xác suất thuần túy. Phương
pháp này đánh giá một giả thuyết tiến hóa bằng việc xây dựng tất cả cây tiến hóa có
thể có dựa trên mô hình tiến hóa và cơ sở dữ liệu đưa vào, rồi từ đó xác định cây có
xác suất xảy ra cao nhất. Phương pháp này thường được xem là phương pháp cung
cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn các phương pháp khác [1]. Tuy nhiên, khi dữ
liệu đưa vào lớn thì số cây phát sinh chủng loại thu được sẽ trở nên rất lớn (với số
taxa > 30 thì số cây phát sinh chủng loại thu có thể có > 5x1038 [1]) từ đó khiến khả
năng tính toán rất chậm. Do vậy, phương pháp này bước đầu sẽ chỉ được áp dụng
với một số lượng dự liệu nhỏ và với các mẫu có đủ số liệu.
2.2.4. Bayesian
Trong phân tích Bayesian, kết quả về phát sinh chủng loại dựa trên xác suất
hậu nghiệm thu được qua cây phát sinh chủng loại.
Bayesian là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng Markov
Chain Monte Carlo (MCMC) có kết hợp của mô hình tiến hóa và dữ liệu đưa vào,
từ đấy tính toán ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây.
Xác suất hậu nghiệm là xác suất có điều kiện mà cây nhận được khi đưa các mô
hình vào, cơ sở dữ liệu. Phương pháp Bayesian với MCMC đã được được chấp
nhận và sử dụng rộng rãi như là một phương pháp tin cậy trong xây dựng cây phát
sinh chủng loại [22].
12
2.3. Phân tích thời gian tiến hóa
Phân tích xác định thời gian phân tách của các nhóm Mang được thực hiện
dựa trên phần mềm BEAST. Trên thực tế, đây là một gói phần mềm, bao gồm các
chương trình BEAST, BEAUti do đó gọi tắt là BEAUti & BEAST. Gói phần mềm
này sử dụng thuật toán thống kê Bayesian và do đó sẽ cần cung cấp các giá trị tiền
nghiệm kết hợp với các thông tin có được từ hệ dữ liệu phân tử. Để chạy phân tích,
chúng tôi đưa vào hai hệ dữ liệu. Hệ dữ liệu thứ nhất là dữ liệu ADN chúng tôi thu
được, hệ dữ liệu thứ hai là mốc thời gian phân tách (calibration point ) của loài
Mang và các tham số tiền nghiệm (prior) [5]. Cả hai hệ dữ liệu này được đưa vào
chương trình BEAUti, để từ đó, với phần mềm này chúng tôi lựa chọn các tùy chỉnh
phù hợp cho hai hệ dữ liệu trên, cuối cùng sẽ tạo ra file định dạng mà chương trình
BEAST có thể hiểu và sử dụng để chạy phân tích [14]. Kết quả thu được qua phần
mềm BEAST là cây phát sinh chủng loại đi kèm với mốc thời gian phân tách của
các nhánh nhờ việc mô phỏng mô hình tốc độ tiến hóa phân tử của các nhánh này
trên cây. Ở mức độ đơn giản nhất, điều này có thể thống nhất một tỷ lệ về thời gian
trên toàn bộ cây phát sinh chủng loại dựa trên các thông tin hiệu chỉnh (calibration)
đã có [14]. Do vậy, BEAST là phần mềm đầu tiên cho phép suy luận để xây dựng
cây phát sinh chủng loại thể hiện được mô hình đồng hồ phân tử giữa các loài [13].
2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích
Hiện nay, rất nhiều các chỉ thị phân tử được xác định với các vai trò khác nhau,
phụ thuộc các mục đích và đối tượng trong các nghiên cứu. Trong đó, hệ gen ty thể,
so với hệ gen nhân, có phương thức sao chép và di truyền khá khác biệt. Bởi vậy,
tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những sai khác nhất định so với
hệ gen nhân. Đồng thời, mỗi loại chỉ thị đều có các ưu điểm và nhược điểm riêng.
Các gen được lựa chọn vào việc xây dựng cây phát sinh chủng loại tùy thuộc vào
mục đích nghiên cứu và thời gian tiến hóa của nhóm loài cần quan tâm. Thông
thường, những nghiên cứu tập trung vào nhóm loài có thời gian tiến hóa ngắn đòi
13
hỏi cần có những gen có tốc độ tiến hóa nhanh và ngược lại những nhóm loài có
thời gian tiến hóa dài cần có những gen có tốc độ tiến hóa chậm hơn [1 , 8].
Hệ gen ty thể ở nhóm thú và người chứa một phân tử ADN (ký hiệu là mtADN)
có dạng sợi kép, mạch vòng, dài khoảng 15000 bp. Tỷ lệ đột biến đồng nghĩa của hệ
gen ty thể ở người vào khoảng 5,7x10-8 mỗi năm, gấp 10 lần so với đột biến đồng
nghĩa trung bình trong vùng mã hóa của gen nhân [1 , 45]. Tỉ lệ đột biến khác nghĩa
ở các gen mã hóa protein ở hệ gen ty thể rất khác nhau, nhưng trong mọi trường
hợp, tỷ lệ này vẫn cao hơn rất nhiều so với đột biến ở hệ gen nhân. Cơ chế dẫn đến
mtADN có tốc độ đột biến cao như thế có thể do sai sót trong quá trình sửa chữa
mtADN. Một lý do khác là áp lực của chọn lọc tự nhiên đối với hệ gen ty thể cao
hơn sao với gen nhân, bởi vì mỗi tế bào chứa hàng chục tỷ ty thể và trung bình mỗi
ty thể chứa 2 bản sao mtADN. Một khác biệt cơ bản nữa của hệ gen ty thể là gen ty
thể nằm ở tế bào chất, di truyền theo dòng mẹ (không xảy ra trao đổi chéo do không
giảm phân). Do đó, các đột biến xảy ra trên hệ gen ty hầu hết là đột biến thay thế
chứ không phải do tái tổ hợp. Với kích thước nhỏ, cùng với tốc độ đột biến thay thế
cao, hệ gen ty thể là một công cụ hiệu quả cho nghiên cứu tiến hóa, đa dạng di
truyền giữa các loài, và các quần thể [1].
Các vùng gen trong hệ gen ty thể, tùy thuộc vào tốc độ biến đổi khác nhau
được sử dụng với các mục đích nghiên cứu khác nhau. Ví dụ, với gen cytochrome b
(Cyt-b) đã đươc sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại ở
động vật. Tốc độ biến đổi của gen Cyt-b phù hợp với mục đích so sánh các loài ở
mức độ giống và họ. Kết quả của rất nhiều nghiên cứu phát sinh chủng loại cho
thấy, gen Cyt-b cho các kết quả cây phát sinh chủng loại khá chính xác. Xa hơn nữa,
sử dụng gen Cyt-b có thể hỗ trợ việc xác định giống đối với các loài mới [36]. Dựa
trên các lý do tương tự, các vùng gen khác như Cytochrome c Oxidase subunit I
(COI), NADH dehydrogenase 4 (ND4) được dùng cho di truyền quần thể, quan hệ
phát sinh chủng loại ở mức độ loài và phân loài của lớp thú [24].
Hệ gen nhân có tốc độ, thời gian biến đổi chậm hơn rất nhiều so với hệ gen ty
thể. Do đó, hệ gen nhân phù hợp với việc phân tích, làm rõ các nhánh có thời gian
14
tiến hóa lâu hơn. Tuy nhiên, hệ gen nhân cũng có các hạn chế nhất định. Với các
mẫu có tuổi mẫu lớn (các mẫu của chúng tôi có tuổi mẫu xấp xỉ 10 năm kể từ khi
mẫu được thu bởi người dân) hay điều kiện bảo quản mẫu không tốt, việc nhân
dòng hệ gen nhân gặp khá nhiều khó khăn bởi số lượng bản sao ít hơn rất nhiều so
với hệ gen ty thể. Ngoài ra, kích thước lớn khiến hệ gen nhân dễ bị biến đổi, phá
hủy [1 , 8].
Từ các ưu và nhược điểm riêng của từng loại chỉ thị, chúng tôi lựa chọn sử dung
cả hệ gen ty thể và hệ gen nhân để có thể có được các kết quả tốt nhất. Cụ thể, trong
nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn 3 gen ty thể là gen Cytochrome b, ND4 (NADH
dehydrogenase subunit 4), gen 16S và 1 gen nhân là gen G-fibrinogen (G-fib).
Ngoài các lý do như đã nêu, chúng tôi lựa chọn các gen trên còn bởi vì các gen này
đã được sử dụng thành công ở các nghiên cứu trên nhóm Mang trước đây. Thậm
chí, cho đến nay, một số loài Mang chỉ có trình tự duy nhất của 1 gen (Mang
Ghongsang hiện nay chỉ có duy nhất 1 trình tự gen ND4 (AF190678)). Do vậy, khi
lựa chọn các gen kể trên, chúng tôi hi vọng sẽ cho kết quả tốt và có thể kết hợp với
các nghiên cứu trước đây nhằm đưa ra các kết luận phù hợp nhất [7 , 36] [23]. Với
gen Cyt-b chúng tôi quyết định nhân lên toàn bộ chiều dài đoạn gen này là 1140bp
đối với tất cả các mẫu. Gen 16S và G-fib có kích thước khoảng 600bp, gen ND4 có
kích thước khoảng 700bp. Số lượng chi tiết của các gen được chúng tôi tiến hành
giải trình tự và các gen từ GenBank sử dụng cho nghiên cứu được thể hiện ở Bảng
4.
15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
1.1. Mẫu vật nghiên cứu
Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu bởi các chuyên gia thuộc Trung
tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Quy
hoạch Lâm Nghiệp. Tổng cộng 78 mẫu gồm 43 mẫu xương và 35 mẫu da khô được
thu thập tại 12 khu bảo tồn trên cả nước (Hình 4), nơi được ghi nhận là có sự xuất
hiện của các loài Mang. Thông tin chi tiết về các địa điểm thu mẫu được thể hiện
trong Bảng 4.
1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Kít tách chiết DNeasy blood and tissue của Qiagen
Ethanol của Merk
PCR Mastermix của Fermentas
Hotstart Taq Mastermix của Qiagen – Đức
Kit GeneJET PCR Purification – Thermo
Agarose của Invitrogen
Tris-Base của Sigma
Boric axit của Merk
EDTA của Merk
Ethidium bromide của Invitrogen
16
Marker 100bp, 1kb của Fermentas
Dye 6X của Fermentas
1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR
Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đã được sử dụng và cho kết quả tốt
trong các nghiên cứu về nhóm Mang cũng như các nhóm thú khác trong các nghiên
cứu trước. Ngoài ra, trình tự mồi cho phản ứng nhân phân đoạn gen ND4 được
chúng tôi tự thiết kế trong nghiên cứu này. Các mồi được đặt tại hãng IDT – Mỹ.
Trình tự các cặp mồi này được thể hiện ở dưới đây (Bảng 3).
Bảng 3. Danh sách và thông tin mồi sử dùng trong nghiên cứu
Phân
Tên
đoạn
mồi
gen
Cyt-b-1
Cyt-b-2
ND4
Kích
thước
phân Trình tự mồi
đoạn
gen
5’-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’
Irwin et al 1991
5’-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’
Irwin et al 1991
5’-GCAAGCTTCTACCATGAGGACAAATATC-3’
Irwin et al 1991
5’-GGAATTCATCTCTCCGGTTTACAAGAC-3’
Irwin et al 1991
5’-CTCATRCCYCTGACCTGACTAT-3’
Le et al 2013
5’-GCTATAAATTCGGTAAGTGGATT-3’
Le et al 2013
5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’
Palumbi
BR
5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’
Palumbi
GL1
5’-AGAHAAYTGCTGCATCTTAGATG-3’
Gatesy et al 1997
5’-TTCRTATTTCATAATTTCTTC-3’
Gatesy et al 1997
L14724
H15149
L15162
H15915R
ND4-F
ND4-R
450
750
700
AR
16S
G-fib
Tác giả
600
GR1
590
17
et
al
et
al
1991
1991
Bảng 4. Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự, cùng tên mẫu, địa điểm thu mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên
cứu. Tất các trình tự được nhân lên trong nghiên cứu này đánh dấu “xxxxxx”, các đoạn gen không có trình tự được đánh
dấu “-”
Cyt-b
ND4
Panolia eldi
HM138200
HM138200
HM138200
-
-
-
Kong and Li (unpublished)
Elaphodus cephalophus
NC008749
NC008749
NC008749
-
-
-
Pang và cộng sự, 2008
Muntiacus crinifrons
NC004577
NC004577
NC004577
-
-
-
Li và cộng sự, 2003
Muntiacus crinifrons
AY239042
AY239042
AY239042
-
-
-
Li và cộng sự, 2003
Muntiacus crinifrons
EF523660
-
-
-
-
-
James (unpublished)
Muntiacus crinifrons
EF523661
-
-
-
-
-
James (unpublished)
Muntiacus crinifrons
EF523664
-
-
-
-
-
James (unpublished)
Muntiacus feae
FJ556561
-
-
-
-
-
Tungsudjaivà cộngsự(unpublished)
Muntiacus feae
AF042721
-
-
-
-
-
Giao và cộng sự, 1998
Muntiacus gongshanensis
G-fib
Tên mẫu
Tài liệu tham khảo
AF190678
-
-
-
-
Wang and Lan, 2000
Muntiacus putaoensis
EF523665
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus putaoensis
EF523666
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus putaoensis
EF523667
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus putaoensis
KJ425280
KJ425299
-
M4.1
Myanmar
Muntiacus reevesi
EF035447
EF035447
-
-
-
-
Wang và cộng sự(unpublished)
Muntiacus reevesi
AF527537
AF527537
AF527537
-
-
-
Zhang và cộng sự, 2002
-
Amato và cộng sự, 1998
Muntiaucs rooseveltorum
-
16S
Địa điểm thu mẫu
Tên loài
-
KJ425290
-
AF108031
-
Muntiacus rooseveltorum
KJ425278
-
KJ425271
-
Muntiacus rooseveltorum
KJ425279
KJ425298
KJ425272
Muntiacus rooseveltorum
KJ425281
KJ425300
KJ425273
Muntiacus rooseveltorum
KJ425282
KJ425301
KJ425274
Muntiacus rooseveltorum
xxxxxx
-
-
-
Muntiacus rooseveltorum
xxxxxx
-
-
-
-
Le và cộng sự, 2014
M2.18
KBTTN Xuân Liên
Le và cộng sự, 2014
KJ425289
M2.20
KBTTN Pù Hoạt
Le và cộng sự, 2014
KJ425291
M6.3
KBTTN Pù Hoạt
Le và cộng sự, 2014
KJ425292
M6.4
KBTTN Pù Hoạt
Le và cộng sự, 2014
X22
KBTTN Xuân Liên
-
X44
KBTTN Xuân Liên
-
18
Muntiacus rooseveltorum
xxxxxx
-
-
-
X8
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus rooseveltorum
xxxxxx
-
-
-
X33
KBTTN Xuân Liên
-
-
-
-
-
-
Amato và cộng sự, 1999
Muntiacus truongsonensis
AF042718
-
-
-
-
-
Giao và cộng sự, 1998
Muntiacus truongsonensis
xxxxxx
-
-
-
M1.2
KBTTN Sông Thanh
Muntiacus truongsonensis
KJ425276
KJ425296
-
Muntiacus truongsonensis
xxxxxx
xxxxxx
-
Muntiacus truongsonensis
AF108033
Muntiacus truongsonensis
xxxxxx
-
-
Muntiacus truongsonensis
KJ425277
KJ425297
-
Muntiacus truongsonensis
xxxxxx
M1.9
KBTTN Sao La
Le và cộng sự, 2014
-
M6.20
KBTTN PNKB
-
-
M1.8
KJ425287
KJ425288
-
M2.4
KBTTN Sao La
KBTTN Sao La
Le và cộng sự, 2014
-
-
M2.7
NC004563
-
-
-
Shi và cộng sự (unpublished)
-
-
-
-
-
Giao và cộng sự, 1998
-
-
-
-
-
Giao và cộng sự, 1998
AF042717
-
-
-
-
-
Giao và cộng sự, 1998
Muntiacus vaginalis
EF523655
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus vaginalis
EF523656
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus vaginalis
EF523657
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus vaginalis
EF523658
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus vaginalis
EF523659
-
-
-
-
-
James và cộng sự, 2008
Muntiacus vaginalis
JN861030
-
-
-
-
-
Suresh và cộng sự (unpublished)
Muntiacus vaginalis
JN861033
-
-
-
-
Suresh và cộng sự (unpublished)
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
Mu5.11
KBTTN Na Hang
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
Mu1.6
KBTTN Sông Thanh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
Mu1.7
KBTTN Sông Thanh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
Mu5.14
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X1
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X11
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X31
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
xxxxxx
-
xxxxxx
Mu6.5
KBTTN Pù Hoạt
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X39
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.16
KBTTN Pù Hoạt
-
Muntiacus vaginalis
NC004563
Muntiacus vaginalis
AF042715
Muntiacus vaginalis
AF042716
Muntiacus vaginalis
-
-
NC004563
-
19
-
-
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X3
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X45
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M5.7
KBTTN Na Hang
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M6.17
KBTTN Ngọc Linh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X26
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M1.3
KBTTN Sông Thanh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.14
KBTTN Sao La
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M6.19
KBTTN Ngọc Linh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.8
KBTTN Sao La
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
xxxxxx
-
xxxxxx
M2.10
KBTTN Ngọc Linh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M6.11
KBTTN Kon Chư Răng
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M3.6
KBTTN Sốp Cộp
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M3.7
KBTTN Ngọc Linh
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X17
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.2
KBTTN Pù Hoạt
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
xxxxxx
-
xxxxxx
M2.21
KBTTN Pù Hoạt
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X6
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X9
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.1
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.19
KBTTN Pù Hoạt
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X5
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X15
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.5
KBTTN Mường Nghé
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M2.11
KBTTN Sao La
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M3.5
KBTTN Sốp Cộp
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
M3.8
KBTTN Sốp Cộp
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X19
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X37
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vaginalis
xxxxxx
-
-
-
X43
KBTTN Xuân Liên
-
Muntiacus vuquangensis
NC016920
NC016920
NC016920
-
-
-
Hassanin và cộng sự, 2012
Muntiacus vuquangensis
AF042720
-
-
-
-
-
Giao và cộng sự, 1998
20
Muntiacus vuquangensis
KJ425275
KJ425295
-
Muntiacus vuquangensis
KJ425293
-
-
M1.1
KBTTN Dakrong
Le và cộng sự, 2014
-
M6.21
KBTTN Sao La
Le và cộng sự, 2014
-
KJ425286
Muntiacus vuquangensis
xxxxxx
-
-
M1.5
KBTTN Sao La
Muntiacus vuquangensis
KJ425283
KJ425302
-
KJ425293
M6.9
KBTTN Kon Chư Răng
Le và cộng sự, 2014
Muntiacus vuquangensis
KJ425284
KJ425303
-
KJ425294
M6.13
KBTTN Kon Chư Răng
Le và cộng sự, 2014
21
-
Hình 4. Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu.
22
1.4. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:
Các thiết bị chúng tôi sử dụng thuộc phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền
học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Phương pháp nghiên cứu
Với mục đích thu nhận trình tự các đoạn gen chỉ thị, từ đó sử dụng để phân
tích, đánh giá đa dạng di truyền, cũng như tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam,
quá trình nghiên cứu của chúng tôi được chia ra gồm 4 bước chính: (1) tách chiết
ADN tổng số, (2) khuyếch đại các phân đoạn gen quan tâm bằng phản ứng PCR, (3)
tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quan tâm, (4) phân tích đa dạng di truyền dựa
trên trình tự thu được bằng phần mềm tin sinh học.
2.1. Tách chiết ADN tổng số
Các mẫu của chúng tôi bao gồm các mẫu xương và da khô thu được qua người
dân bản địa, do vậy điều kiện bảo quản các mẫu này không tốt, dẫn đến chất lượng
ADN tổng số lưu dữ được rất ít, và đứt gãy rất nhiều. Ngoài ra, chúng tôi cũng lấy
các mẫu bảo tàng được bảo quản trong điều kiện tốt, nhưng tuổi mẫu đã khá cao,
(khoảng xấp xỉ vài chục năm). Do vậy, chúng tôi tách chiết ADN tổng số sử dụng
bộ kit Dneasy Blood and tissue, với các quy trình đã mô tả trong nghiên cứu của Lê
Đức Minh và cộng sự năm 2013 [3] . Quy trình này của chúng tôi đã được tối ưu để
nhằm phục vụ tách chiết các mẫu có chất lượng ADN thấp.
Đầu tiên, mẫu được tiền xử lý rửa bề mặt bằng phương pháp ngâm trong dung
dịch Clorox 10% . Bước này giúp loại bỏ các thành phần bề mặt không cần thiết,
các loại nấm mốc, vi sinh vật. Tiếp đó, mẫu đựơc lấy ra, rửa sạch bằng nước cất
nhiều lần, cuối cùng để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, chúng tôi sử
dụng bộ kít DNeasy blood and tissues với protocol được chỉnh lý [3] để tách chiết
ADN tổng số từ các mẫu xương và da khô đã được làm sạch.
23
Mẫu đã khô được chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung 180µl
dung dịch đệm ATL và 20µl proteinase K. Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong 72 giờ.
Proteinase K được bổ sung tiếp tục sau mỗi 24 tiếp theo (tổng cộng lượng
proteinase K sử dụng là 60µl).
Sau 72 giờ, dung dịch và mẫu được lấy ra khỏi bể ổn nhiệt, vortex nhẹ trước khi
bổ sung 200µl dung dịch đệm AL. Hỗn hợp mới này lại tiếp tục được ủ ở 70°C
trong 7 phút, sau đó đựơc lấy ra bổ sung thêm 200µl dung dịch Ethanol 100. Dung
dịch trong hỗn hợp thu được sẽ chuyển qua cột lọc 2ml, ly tâm với tốc độ 6000 rcf
trong 1 phút. Cột lọc sau ly tâm được chuyển sang ống 2ml mới. Dung dịch sau ly
tâm được loại bỏ.
Bổ sung 500 µl dung dịch đệm AW1 vào cột lọc mới và ly tâm ở 6000 rcf trong
1 phút.
Tương tự bước trên, lần này, cột lọc cũng được chuyển vào ống 2ml mới và loại
bỏ dung dịch sau ly tâm. Đồng thời, dung dịch AW2 được bổ sung 500µl vào cột
lọc và ly tâm ở 20000 rcf trong 3 phút.
Cuối cùng, cột lọc được chuyển sang ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung
vào cột lọc 90 µl dung dịch đệm AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ống
eppendorf và cột lọc được ly tâm ở 6000 rcf trong 1 phút. Lần này, dung dịch thu
được chứa ADN tổng số nên được giữ lại trong ống eppendorf và bảo quản ở âm
4°C.
2.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR sử dụng máy PCR Systerm 9700, với tổng thể tích một phản ứng
là 20µl bao gồm 10µl HotstarTaq mastermix (Qiagen, Đức), 5µl nước, 2µl mồi mỗi
chiều xuôi và chiều ngược, 1µl ADN khuôn (Bảng 5).
24
Điều kiện phản ứng PCR cụ thể : 95C trong 15 phút để hoạt hoá loại Taq
polymerase này, 40 chu kỳ gồm; 95C trong 30 giây, 45C trong 45 giây, 72C
trong 60 giây, và bước kéo dài cuối cùng trong 6 phút.
Chúng tôi sử dụng HotStar Taq là loại Taq polymerase hiệu quả trong việc nhân
gen với nồng độ ADN khuôn thấp, và có tính đặc hiệu cao. Đối với các mẫu có
nồng độ ADN quá thấp, chúng tôi tiến hành thêm phản ứng PCR lần thứ hai sử
dụng ADN khuôn là sản phẩm PCR lần thứ nhất. Lần PCR thứ hai, chúng tôi sử
dụng Taq polymerase (Fermentas). Với loại Taq polymerase chúng tôi thực hiện
phản ứng với các điều kiện tương tự như với HotStar Taq, ngoại trừ thời gian hoạt
hoá cho Taq Polymerase là 95C trong 5 phút. (Bảng 6)
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần
Thể tích
1
ADN khuôn
1-1.5 µl
2
Mồi xuôi
2 µl
3
Mồi ngược
2 µl
4
Nước cất
5 µl
5
Taq Master mix
10 µl
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước
Nhiệt độ (°C)
Hoạt hóa
95
Biến tính
95
Thời gian (phút)
Taq polymerase: 5
Hot Start Taq: 15
Chu kỳ (vòng)
1
0.5
1
0.5
35
Cyt-b-1,2: 45
Gắn mồi
ND4, 16S: 50
G-fib: 52
25
Kéo dài
72
1
1
Ổn định
72
6
1
Bảo quản
4
∞
2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen
Sản phẩm sau khi tách chiết ADN tổng số và sau phản ứng PCR đều được tiến
hành điện di trên gel Agarose 1% để xác định sự có mặt của phân tử ADN. Với
ADN tổng số, điện di sử dụng gel Agarose 1%, chạy trong môi trường đệm TBE 1X
(Tris base, axit Boric, EDTA, H2O), marker 1kb. Điện di sản phẩm PCR sử dụng
gel Agarose, chạy trong môi trường đệm TBE 1X, marker 100bp.
Các sản phẩm PCR thành công (xác định nhờ điện di) được tiến hành tinh sạch
bằng bộ kit sạch sản phẩm PCR của Thermo trước khi gửi giải trình tự hai chiều tại
FirstBase - Malaysia. Các bước tinh sạch cụ thể như sau:
Bước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:1 của Buffer Binding vào hỗn hợp PCR
để được một dung dịch hoàn chỉnh (ví dụ cho mỗi 100µl của hỗn hợp phản ứng,
thêm 100µl Buffer Binding). Trộn kỹ và đều hỗn hợp dung dịch. Kiểm tra màu sắc
của dung dịch: màu vàng thể hiện pH tối ưu cho việc cố định ADN. Nếu màu sắc
của dung dịch có màu cam hoặc tím, thêm 10µl dung dịch acetate 3M, pH 5.2 và
trộn đều, màu sắc của hỗn hợp sẽ trở thành màu vàng.
Bước 2: Chuyển tối đa 800µl dung dịch từ bước 1 vào cột GeneJET ™. Ly
tâm 30-60s. Loại bỏ các dung dịch thông qua cột. Lưu ý: nếu tổng khối lượng vượt
quá 800µl, dung dịch có thể được thêm vào các cột thành từng giai đoạn. Sau khi bổ
sung 800µl dung dịch, ly tâm cột 30-60s và loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc. Lặp
lại cho đến khi toàn bộ dung dịch đã được thêm vào màng cột.
Bước 3: Thêm 700µl Wash Buffer (đã được thêm Ethanol) vào cột lọc
GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc và đặt các cột lọc
trở lại vào ống thu.
26
Bước 4: Ly tâm cột GeneJET ™ thêm 1 phút để hoàn toàn loại bỏ phần đệm
rửa còn sót lại. Lưu ý: bước này là điều cần thiết vì đệm rửa còn sót lại trong mẫu
DNA có thể ức chế các phản ứng sau đó.
Bước 5: Chuyển cột GeneJET ™ tới một ống 1,5 ml sạch (không kèm theo trong bộ
kit). Thêm 50µl Elution buffer đến trung tâm màng của cột GeneJET ™ và ly tâm trong 1
phút.
Kết quả giải trình tư hai chiều nhận được sẽ được đối chiếu với nhau để nhận
được 1 trình tự duy nhất dựa trên phần mềm Geneious ver 8.0. Trình tự thu được sẽ
được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) nhằm đảm bảo tính xác
thực qua công cụ Blast.
2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa
Với các trình tự gen thu được, chúng tôi tiến hành sắp xếp thẳng hàng cùng
với các đoạn gen chuẩn lấy từ ngân hàng gen bằng phần mềm BioEdit v5 để xây
dựng dữ liệu để tiến hành phân tích cây phát sinh chủng loại. Cơ sở dữ liệu của
chúng tôi bao gồm:
- Nhóm ngoài (out group): Trình tự gen của hai loài Panolia eldii và
Elaphodus cephalophus được chúng tôi sử dụng làm nhóm ngoài. Hai loài trên có
quan hệ khá gần gũi với nhóm Mang. Trong đó Elaphodus cephalophus thuộc cùng
tông Muntiacini cùng với nhóm Mang. Đồng thời, 2 loài trên cũng được sử dụng rất
nhiều làm nhóm ngoài trong các nghiên cứu trước về nhóm Mang [6 , 7 , 36].
- Nhóm trong (in group): 45 trình tự có được từ ngân hàng gen của 9 loài
Mang (loài Mang M. antherodes, M. montanus và M. muntjak hiện nay chưa có dữ
liệu gen); và 86 trình tự của 5 loài Mang thu được qua nghiên cứu này.
Sau đó, các dữ liệu về gen được sắp xếp thẳng hàng và đưa vào tập tin định
dạng nexus (.nex) để từ đó có thể đưa vào các phần mềm tin sinh và tiến hành phân
tích. Thông tin về các cơ sở dữ liệu các gen chi tiết ở Bảng 4. Tập tin chứa cơ sở dữ
liệu về gen này được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên 3
27
phương pháp: phương pháp Tiết kiệm tối đa (MP) và phương pháp Hợp lý tối đa
(ML) có trong phần mềm PAUP ver 4 beta 10 [39], phương pháp Bayesian có trong
phần mềm Mr.Bayes (ver 3.4) [22]. Việc sử dụng cả ba phương pháp cho phép
chúng tôi so sánh và đối chiếu các kết quả thu được nhằm đưa ra các kết luận đáng
tin cậy cho nghiên cứu.
2.4.1. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tiết kiệm tối đa
(Maximum Parsimony – MP)
Sử dụng phần mềm PAUP ver 4b10, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng
loại bằng phương pháp tiết kiệm tối đa với các tùy chỉnh bước đầu với 100 taxa
ngẫu nhiên lặp lại nhờ thuật toán phân cắt và nối chéo các nhánh của cây phân tích
(Tree-bisection and reconnection - TBR), không chọn giới hạn trên cho số cây được
ghi nhớ. Đánh giá khả năng xảy ra của các nhánh, phân tích với chỉ số tin cậy
bootstrap (BP) được áp dụng là 1000 vòng lặp [18 , 27 , 29]. Chúng tôi chạy phần
mềm PAUP với phương pháp tiết kiệm tối đa sử dụng dữ liệu kết hợp của cả 4 gen
chỉ thị. Giá trị độ tin cậy của nhánh tiến hóa sau phân tích được coi là có độ tin cậy
cao khi đạt giá trị lớn hơn 70% và được coi là thấp khi nhỏ hơn 70% [21].
2.4.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp hợp lý tối đa
(Maximum Likelihood - ML)
Với phương pháp ML, để xác định mô hình tiến hóa phù hợp, chúng tôi sử dụng
phần mềm Modeltest v3.7 [37]. Dữ liệu đầu vào cho phần mềm này là file định
dạng nex, chúng tôi đã sử dụng để tiến hành phân tích MP. Sau khi có được mô
hình tiến hóa, chúng tôi tiến hành xây dựng file định dạng nex cho phân tích ML
dựa trên cơ sở là dữ liệu ADN tương tự như với phân tích MP, các tùy chỉnh, câu
lệnh mặc định dựa theo hướng dẫn của phần mềm PAUP.
Phân tích ML được thực hiện nhờ phần mềm PAUP. Phân tích ban đầu được
tiến hành với các tùy chỉnh cụ thể: cây cộng thêm theo từng bước, với một taxon
được thêm vào mỗi vòng lặp (simple taxon addition) và sử dụng thuật toán hoán đổi
nhánh (TBR). Để đánh giá độ tin cậy (BP) của nhánh, phân tích bootstrap được lặp
28
lại 100 vòng với một taxon được thêm vào mỗi vòng lặp. Với các nhánh có giá trị
BP ≥ 70% được coi là có độ tin cậy cao, ngược lại các nhánh có giá trị BP < 70%
được coi là có độ tin cậy thấp [21]
2.4.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Bayesian
Tương tự, mô hình tiến hóa cho phân tích Bayesian cũng giống với phân tích
ML, có được nhờ phần mềm Modeltest v3.7, hai phân tích này sử dụng chung mô
hình tiến hóa.
Phân tích Bayesian được thực hiên nhờ phần mềm MrBayes v3.1 [22]. Phân
tích được thực hiện với việc bắt đầu từ một cây ngẫu nhiên và chạy trong 10x106
thế hệ. Bốn chuỗi Markov, một nóng và ba lạnh (giá trị mặc định) được lấy mẫu sau
mỗi 1000 thế hệ. Hai phân tích đồng thời sẽ được tiến hành song song. Sau phân
tích, cần xác định các điểm lấy mẫu, mà tại đó giá trị của chuỗi Markov bắt đầu ổn
định, các cây ở trước thời điểm lấy mẫu này sẽ được loại bỏ. Chúng tôi tiến hành
phân tích, xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng cả dữ liệu kết hợp trình tự cả
4 gen thành một tổ hợp chung (combined); và phân tích riêng từng gen trong tổ hợp
(partitioned) của cả 4 gen nhằm xác định sự sai khác về tốc độ biến đổi của các
nucleotide trong các mã bộ ba (codon) [9 , 32]. Xác suất hậu nghiệm (PP) của
nhánh tiến hóa được xác định là cao khi giá trị đạt lớn hơn 95% và ngược lại.
2.4.4. Phân tích thời gian tiến hóa
Để xác định thời gian tiến hóa, phân tách của các loài Mang, chúng tôi sử dụng
phần mềm BEAST v 1.8 [14]. Phần mềm này hiện nay đã và đang được sử dụng rất
phổ biến trong các nghiên cứu về tiến hóa, và đã cho nhiều kết quả khả quan [14 ,
26].
Với dữ liệu đầu vào cho phần mềm BEAUti, chúng tôi sử dụng file định dạng
nex, tương tự như với phân tích MP, ML. Dữ liệu ADN này đã được lựa chọn, chỉ
dữ lại các taxa đại diện cho các nhánh tiến hóa tương ứng của các loài Mang. Chúng
tôi sử dụng phương pháp “relaxed-clock” để đánh giá thời gian phân tách [13].
Chúng tôi sử dụng một mốc thời gian là 7.4 triệu năm, đây là thời điểm tông
Muntiacini đã tách thành một nhánh riêng biệt [5]. Cho các tham số tiền nghiệm,
29
chúng tôi sử dụng các tùy chỉnh “Tree prior” là “Coalescent-Constant size”. Phân
tích chạy trong 10x106 thế hệ, lấy mẫu sau 1000 thế hệ. Sau cùng, BEAUti tạo ra
file dữ liệu dựa trên các thông tin chúng tôi khai báo, file này sử dụng cho phần
mềm BEAST để chạy phân tích.
30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN tổng số thành công của 58 mẫu bao gồm
35 mẫu xương và 23 mẫu da khô. Với ADN của các mẫu xương sau khi kiểm tra kết
quả tách chiết thông qua điện di, cho thấy có băng khá rõ, tương ứng với vị trí của
chỉ thị (marker) có kích thước lớn, tuy nhiên, các băng này vẫn tạo thành các vệt mờ
dài (smear), cho thấy vẫn có sự đứt gãy khá nhiều của ADN tổng số (Hình 5). Trong
khi đối với các mẫu da khô, trên bản điện di, không cho băng với kích thước lớn (dù
có cũng khá mờ nhạt) mà tạo thành vệt smear dài, cho thấy, trong các mẫu này,
Hình 5. Ảnh điện di ADN tổng số
Hình 6. Ảnh điện di ADN tổng số của
của một số mẫu xương trên gel
Agarose 1%, Marker 1kb
một số mẫu da khô trên gel Agarose
1%, Marker 1kb
ADN dường như bị đứt gãy rất nhiều; thậm chí ở một số mẫu không thể quan sát
thấy sản phẩm của ADN tổng số (Hình 6). Kết quả thu được cho thấy, các mẫu
xương có khả năng giữ ADN tốt hơn so với các mẫu da. Tiếp theo, ADN tổng số
được tiến hành đo mật độ quang phổ (OD) ở bước sóng 260nm và 280nm để xác
định hàm lượng ADN tổng số. Tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1.5-2, nồng độ
ADN dao động trong khoảng 20-300 µg/ml. Cụ thể hơn, đối với các mẫu xương
nồng độ ADN nằm trong khoảng 80-300 µg/ml, trong khi đối với các mẫu da khô,
nồng độ ADN là 20-100 µg/ml. Qua đó cho thấy, đối với các mẫu có tuổi lâu năm,
31
các mẫu xương có khả năng bảo quản, giữ ADN tốt hơn so với các mẫu có bản chất
là da khô.
Kết quả thu được cho thấy, phương pháp tách chiết đã thu được ADN tổng số
đủ tinh sạch để tiến hành phản ứng PCR, tuy nhiên, nồng độ ADN tổng số ở một số
mẫu thấp, đứt gãy nhiều, do đó có thể sẽ dẫn tới khó khăn trong quá trình tiến hành
nhân gen.
2. Kết quả khuyếch đại gen bằng phản ứng PCR
Do nồng độ ADN khuôn thấp nên Hotstar Taq của Qiagen đã được chúng tôi sử
dụng để nhân lên các phân đoạn cần thiết. Hotstar Taq là loại Taq chuyên dụng sử
dụng cho các phản ứng PCR với nồng độ khuôn thấp, bởi loại Taq này có độ nhạy
cũng như tính đặc hiệu cao. Đồng thời, do ADN tổng số có tỷ lệ đứt gãy cao, nên
450bp
750bp
Hình 7. Ảnh điện di một số sản phẩm
Hình 8. Ảnh điện di một số sản phẩm
nhân phân đoạn gen cyt-b-1 (450bp)
trên gel Agarose 1%, marker 100bp
nhân phân đoạn gen cyt-b-2 (750bp)
trên gel Agarose 1%, marker 100bp
chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen Cyt-b dài 1140bp bằng 2 phân đoạn ngắn là
Cyt-b-1 (450bp) và Cyt-b-2 (750bp) để tăng khả năng nhân gen thành công. Với các
phân đoạn gen ND4, 16S, G-fibriniogen được nhân lên với kích thước từ 600bp –
800bp.
Với một số mẫu có nồng độ ADN quá thấp, dẫn đến kết quả phản ứng PCR
(chúng tôi tạm gọi là PCR lần 1 sử dụng Hot Start Taq) có thể kém (băng điện di
mờ) hoặc không cho kết quả PCR (không có băng điện di), chúng tôi tiến hành dùng
32
sản phẩm PCR này làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR sử dụng Taq Polymerase
(chúng tôi tạm gọi là PCR lần 2). Sau khi thực hiện lần thứ 2 này, băng điện di của
600bp
600bp
Hình 9. Ảnh điện di một số sản phẩm
Hình 10. Ảnh điện di một số sản phẩm
nhân phân đoạn gen ND4 (600bp) trên
gel Agarose 1%, marker 100bpA
nhân phân đoạn gen G-fib (600bp) trên gel
garose 1%, marker 100bp
phản ứng PCR trên gel Agarose sáng rõ hơn. Thậm chí 1 số mẫu ở lần PCR thứ nhất
không cho băng điện di thì ở lần PCR thứ 2 cho kết quả băng điện di sáng rõ (Hình
11).
Kết quả, với tổng cộng 58 mẫu ADN tổng số, chúng tôi đã nhân thành công 58
mẫu với gen Cyt-b. Dựa trên dữ liệu của 58 gen Cyt-b thu được, chúng tôi đã có kết
quả bước đầu về phân loại các loài Mang ở Việt Nam. Qua kết quả bước đầu thu
(a)
(b)
Hình 11. Điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2
(a). Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 nhân phân đoạn gen Cytb-2 (600bp) trên gel
Agarose 1%, marker 100bp.
(b). Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 2 nhân phân đoạn gen Cytb-2 (600bp) trên gel
Agarose 1%, marker 100bp.
được (sẽ được bàn kỹ hơn ở mục 4), chúng tôi lựa chọn và tiến hành nhân gen thành
công 13 mẫu đối với phân đoạn gen ND4, 4 mẫu đối với gen 16S, 12 mẫu đối với
gen G-fib (Bảng 4). Tiêu chí lựa chọn các mẫu để nhân các đoạn gen ND4, G-fib là
33
các mẫu đại diện cho nhánh mà nó đại diện, và sản phẩm PCR của gen Cyt-b cho
kết quả tốt. Tuy vậy, trong 13 mẫu lựa chọn để tiến hành nhân gen, có 1 mẫu chúng
tôi không nhân gen thành công đối với gen G-fib. Đối với gen 16S, gen này phục vụ
mục đích là xác định các mẫu thu được là của loài Mang Roosevelt (loài này cho
đến thời điểm chúng tôi tiến hành nghiên cứu chỉ có 1 trình tự gen 16S duy nhất trên
ngân hàng gen NCBI là AF108031), do đó, đối với gen này, chúng tôi chỉ nhân lên
với 4 mẫu Mang được cho là loài Mang Roosevel; các gen 16S của các loài khác
chúng tôi sử dụng gen chuẩn của loài có được qua ngân hàng gen NCBI. Kết quả
sản phẩm PCR cho băng điện di lên đúng kích thước của gen cần nhân, độ sáng các
băng tương đối tốt, đủ để thực hiện phản ứng giải trình tự (Hình 7,8,9,10).
3. Kết quả giải trình tự
Kết quả giải trình tự được chúng tôi kiểm tra nhằm đảm bảo tín hiệu rõ ràng,
ít xảy ra sự chồng lên nhau của các tín hiệu. Khoảng 20-30 nucleotide đầu tiên và
cuối cùng của trình tự, tín hiệu thường bị nhiễu, các đỉnh có thể bị chồng lên nhau
(Hình 12). Hiện tượng này xảy ra ở tất cả các mẫu, do ở những nucleotide đầu, máy
giải trình tự chưa thể đọc tốt bởi phản ứng giải trình tự chưa diễn ra ổn định, đây
cũng là hạn chế của phản ứng giải trình tự hiện nay. Đoạn trình tự bị nhiễu này sẽ
được chúng tôi sử dụng phần mềm chuyên dụng để loại bỏ, tránh gây nhầm lẫn khi
xây dựng cây phát sinh chủng loại. Việc loại bỏ đoạn trình tự ở hai đầu này hoàn
toàn không làm ảnh hưởng tới độ dài của đoạn gen chúng tôi cần bởi các đoạn mồi
sử dụng đã được thiết kế để có thể nhân lên trình tự dài hơn phân đoạn gen mong
muốn.
Hình 12. Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng giải trình
34
Hai chiều của đoạn gen sau khi được xác định là đủ tin cậy để sử dụng,
chúng tôi tiến hành đối chiếu với nhau để thu được trình tự tin cậy nhất của đoạn
gen. Chúng tôi sử dụng phần mềm Genenious v8.0 để thực hiện quá trình đối chiếu
này. Hình ảnh của tín hiệu và trình tự của mỗi chiều sẽ được sắp xếp thẳng hàng với
nhau, khi tín hiệu và tại từng nucleotide của mỗi chiều đều tốt và trình tự nucleotide
ở cả hai chiều trùng nhau thì nucleotide đấy chúng tôi chấp nhận (Phụ lục 5,6,7,8,9).
Trình tự sau cùng chúng tôi thu được sẽ được kiểm tra lại bằng cách so sánh
với ngân hàng gen của hệ thống NCBI để xác nhận đã nhân đúng đoạn gen, đúng
loài mong muốn thông qua công cụ BLAST có sẵn trên hệ thống này. Kết quả cuối
cùng, chúng tôi đã thu được trình tự của 58 gen Cyt-b, 13 trình tự gen ND4, 12 trình
tự gen G-fib và 4 trình tự gen 16S.
4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại
Bước đầu, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương
pháp Bayesian của tất cả các gen Cyt-b có được sử dụng dữ liệu gen tổ hợp chung
(combined) và dữ liệu từng gen trong tổ hợp (partitioned). Sở dĩ chúng tôi lựa chọn
phương pháp Bayesian vì với hệ dữ liệu gồm tất cả các trình tự của nghiên cứu và
các trình tự thu được qua ngân hàng gen, khi phân tích bằng phương pháp MP, ML
sẽ mất tới hàng tuần để phân tích do số liệu của nhiều mẫu không đầy đủ. Phân tích
Bayesian lại không bị phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ số liệu còn thiếu và có thể hoàn
thành trong vài ngày. Đối với phân tích MP, ML sẽ xây dựng riêng các cây phát
sinh chủng loại cho số lượng taxon nhỏ hơn và số liệu đầy đủ. Với phương pháp
Bayesian, bước đầu tiên phân tích cần tiến hành là xác định mô hình tiến hóa phù
hợp với hệ dữ liệu của chúng tôi nhờ phần mềm Model Test (Phụ lục 4,5).
Cụ thể, chúng tôi thu được cây phát sinh chủng loại như trên hình 13. Cây
này cho thấy các loài Mang ở Việt Nam phân thành 2 nhánh lớn, tạm gọi là nhánh A
và nhánh B. Trong đó, đối với nhánh A, nhánh này tương ứng với loài Mang thường
(Mang Ấn Độ). Cụ thể, trong nhánh này gồm các mẫu có trình tự từ ngân hàng gen
ở các nghiên cứu trước đây đã được khẳng định thuộc về loài Mang thường, đồng
35
thời nhánh này cũng bao gồm các mẫu của chúng tôi đã được nhận định sơ bộ ban
đầu về hình thái là Mang thường. Nhánh B có số lượng loài đa dạng hơn so với
nhánh A. Bước đầu kết luận được có 4 loài Mang có quan hệ gần gũi về mặt di
truyền ở trong nhánh này: Mang Trường Sơn, Mang Putao, Mang Roosevelt và
Mang lớn.
Sau đó, chúng tôi tiến hành chọn các mẫu (hay taxa) có thể đại diện cho các
nhánh và đồng thời có đầy đủ các gen để tiến hành chạy 3 phân tích Bayesian, MP,
ML. Kết quả được thể hiện ở hình 15.
4.1. Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ
Qua cây phát sinh chủng loại cho thấy, loài Mang Ấn Độ có sự đa dạng rất lớn
về mặt di truyền tuy nhiên các nhánh của loài Mang này phân tách không rõ ràng và
chỉ số tin cậy cho các nhánh còn chưa cao. Các mẫu của chúng tôi và mẫu từ ngân
hàng gen có nguồn gốc từ nhiều nơi trên lục địa châu Á, như Việt Nam, Ấn Độ,
Trung Quốc, Thái Lan. Tuy các quần thể này sống ở những khu vực địa lý khá tách
biệt, nhưng kết quả phân tích di truyền cho thấy chúng chưa có sự phân tách rõ ràng
về mặt địa lý. Nguyên nhân dẫn tới hiện tượng này có thể do tập tính của loài Mang
này. Đây là loài Mang có thể sống ở những vùng bìa rừng hoặc rừng tái sinh là hệ
sinh thái khá phổ biến trong khu vực [33]. Do không bị giới hạn phân bố như những
loài Mang chỉ sống trong rừng nguyên sinh, loài này có thể đã phát tán rất nhanh
trong một thời gian ngắn. Ngoài ra, do đặc điểm dễ phát tán, sự trao đổi gen thường
xuyên giữa các quần thể khác nhau vẫn diễn ra và ngăn cản sự phân tách di truyền
giữa các quần thể.
4.2. Nhánh B
Đối với nhánh B, nhánh này được chia làm 4 nhánh riêng biệt, tương ứng với
4 loài Mang: Mang Trường Sơn (Muntiacus truongsonensis), Mang putao
(Muntiacus putaoensis), Mang Roosevelt (Muntiacus rooseveltorum), Mang lớn
(Muntiacus vuquangensis).
36
4.2.1. Nhánh Mang Roosevelt, Mang Trường Sơn, Mang Putao
Đối với nhánh Mang này, chúng tôi kết hợp với cây phát sinh chủng loại thu
được từ nghiên cứu của Amato và cộng sự [6]. Qua kết quả, chúng tôi nhận thấy ở
nhánh này có 3 loài Mang là Mang Roosevelt, Mang Trường Sơn, Mang Putao.
Cụ thể, nhánh Mang Roosevelt gồm các mẫu chúng tôi thu tại 2 khu bảo tồn
có chung ranh giới tự nhiên với nhau ở miền Trung nước ta, Khu Bảo tồn Thiên
nhiên (KBTTN) Pù Hoạt thuộc tỉnh Nghệ An và KBTTN Xuân Liên thuộc tỉnh
Thanh Hóa. Các mẫu được nhận định hình thái là Mang Roosevelt và Mang Pù
Hoạt. Trong đó, Mang Pù Hoạt gồm 2 mẫu là M 2.18 và M 2.20 được xác nhận về
mặt hình thái bởi chuyên gia Đỗ Tước là người đã tìm thấy các mẫu được xác nhận
là của loài Mang này. Cho đến nay vẫn chưa có các bằng chứng phân tử cũng như
hình thái chứng minh tính xác thực của loài này bởi tập tính sống (chỉ sống trong
vùng rừng nguyên sinh) cũng như số lượng cá thể nhỏ của loài này.
37
A
B
Hình 13. Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên hệ giữ liệu kết hợp gen cytochrome b
(1140bp), sử dụng phương pháp Bayesian, theo mô hình GTR (General Time Reversible) chọn
mẫu cách 1000 thế hệ, chạy trong 5x106 thế hệ. Các chỉ số trước và sau “/” lần lượt là các chỉ số
xác suất hậu nghiệm (PP) của phân tích Bayesian sử dụng dữ liệu gen tổ hợp chung (combined)
và dữ liệu từng gen trong tổ hợp (partitioned). Ký hiệu * tương ứng với giá trị đạt 100%. Nhánh
A bao gồm các mẫu mang thường (M. vaginalis); nhánh B gồm các mẫu của 4 loài mang M.
truongsonensis, M. putaoensis, M. rooseveltorum, M. vuquangensis.
38
Kết quả nghiên cứu này một lần nữa khẳng định loài Mang Roosevelt có
phân bố tại Việt Nam như những công bố trước đây của chúng tôi [4 , 28]. Cụ thể,
với kết quả nghiên cứu, chúng tôi xác nhận Mang Roosvelt có khu vực phân bố tại 2
khu bảo tồn là KBTTN Xuân Liên và KBTTN Pù Hoạt. Các mẫu này của chúng tôi
chỉ vừa được thu cách đây 2,3 năm và còn có khá nhiều báo cáo về việc quan sát
thấy loài này từ người dân bản địa [28]. Bên cạnh đó, dựa trên nghiên cứu đánh giá
chi tiết về yếu tố di truyền của các loài Mang trong KBTTN Xuân Liên của chúng
tôi cho thấy, loài này đã có sự phân tách về yếu tố di truyền mặc dù các mẫu sử
dụng cho nghiên cứu chỉ thu thập ở 2 KBTTN Xuân Liên và Pù Hoạt [4]. Nguyên
nhân của hiện tượng này đến nay còn chưa được làm rõ. Có thể sự phân tách này
được tạo ra bởi các ranh giới tự nhiên trong khu vực này. Vì vậy, trong tương lai
cần có các nghiên cứu chi tiết, cụ thể hơn để đánh giá về tình trạng các quần thể loài
Mang này tại hai KBTTN kể trên.
Kết quả nghiên cứu qua hình 13 đồng thời cũng cho thấy, loài Mang Pù
Hoạt được Đỗ Tước và cộng sự nhận định trước đây [41] rất có thể là loài Mang
Roosevelt. Do vậy, để củng cố thêm cho nhận định, chúng tôi đã xây dựng bảng
khoảng cách di truyền của 2 loài Mang này dựa trên hệ dữ liệu là 4 gen Cyt-b, ND4,
16S và G-fib (Bảng 7). Với bảng khoảng cách di truyền thu được, sự khác biệt về
mặt di truyền hoàn toàn không lớn, chỉ số cao nhất xấp xỉ 0.8%. Chỉ số cho thấy sự
khác biệt về mặt di truyền giữa loài Mang Pù Hoạt và Mang Roosevelt là rất thấp.
Kết quả này rất tương đồng với kết quả thu được từ cây phát sinh chủng loại. Như
vậy, loài Mang trước đây được cho là loài Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) đã có thể
có sự nhầm lẫn, vậy nên loài Mang này và loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum)
rất có thể chỉ là một loài.
Ngoài ra, khi chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho nhánh Mang
Roosevelt, Mang Trường Sơn và Mang Putao với hệ dữ liệu ADN chỉ sử dụng gen
16S là gen chuẩn mô tả loài Mang Roosevelt (Phụ lục 1) và hệ dữ liệu ADN gồm 2
gen ty thể Cyt-b, ND4 và 1 gen nhân G-gib (Hình 14) sử dụng cả 3 phương pháp
39
MP, ML và Bayesian. Kết quả của cây sử dụng cả 3 gen cho thấy, 3 loài nay thuộc
cùng 1 nhánh với các chỉ số tin cậy cao ở cả 3 phân tích (chỉ số BP ở MP và ML lần
lượt là 100 và 98, chỉ số PP là 100), trong khi chỉ số xác suất hậu nghiệm của gốc
Bảng 7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang Roosevelt dựa trên dữ
liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4, 16S, G-gibrinogen
Taxa
1
2
3
4
5
6
7
8
1. M 2.18
-
2. M 2.20
0.000 -
3. M 6.3
0.000 0.041 -
4. M 6.4
0.078 0.247 0.165 -
5. X 22
0.721 0.730 0.730 0.729 -
6. X 24
0.789 0.804 0.804 0.710 0.000 -
7. X 8
0.088 0.000 0.078 0.157 0.721 0.877 -
8. X 33
0.000 0.000 0.000 0.078 0.721 0.789 0.088 -
nhanh giữa Mang Trường Sơn và Mang Putao lại thấp PP là 65 (Hình 14). Kết quả
cho thấy 3 loài Mang này có mối quan hệ di truyền rất gần nhau, mặc dù Mang
Putao chỉ có vùng phân bố ở Ấn Độ và Burma. Kết quả này của chúng tôi tương
đồng với kết quả của Amato và cộng sự [6]. Điều này có thể giải thích bởi vì trong
quá khứ đã có sự hình thành cùng lúc 3 loài này trong thời gian ngắn, nên tuy rằng
đã có sự phân tách, hình thành nên 3 loài nhưng khoảng cách di truyền giữa 3 loài
lại không lớn, hoặc giữa 3 loài trên trong quá khứ vẫn có sự lai tạo.
4.2.2. Nhánh Mang lớn (Muntiacus vuquangensis)
Trong nhánh B còn cho thấy, Mang lớn cũng có mối quan hệ gần với 3 loài
Mang Trường Sơn, Roosevelt và Putao. Qua cây phát sinh chủng loại chúng ta có
thể thấy, các chỉ số tin cậy cho nhánh Mang lớn rất cao ở cả 3 phương pháp (chỉ số
BP và PP đều là 100). Đồng thời cho thấy loài này có sự tách biệt thành 2 nhóm
riêng biệt. Các chỉ số tin cậy cho sự tách biệt này đều rất cao (BP thấp nhất là 89 và
PP đều là 100) (Hình 14). Ngoài ra, chúng tôi cũng xây dựng bảng khoảng cách di
40
truyền cho loài Mang lớn (Bảng 8). Kết quả cũng cho thấy có sự tách biệt về
khoảng cách di truyền giữa 2 quần thể Mang lớn miền Trung và miền Nam Việt
Nam tương tự với kết quả thu được ở cây phát sinh chủng loại.
Hình 14. Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 2 gen ty thể ( Cyt-b
và ND4 )và 1 gen nhân (G-fib) (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị thông tin) sử
dụng phương pháp Bayesian, MP, ML. Các chỉ số phía trên nhánh lần lượt là giá
trị bootstrap của phân tích MP và ML, chỉ số phía dưới là giá trị xác suất hậu
nghiệm thu được ở phương pháp Bayesian. Dấu * tương ứng với giá trị đạt
100%. Với các thông tin của cây MP như sau: chiều dài cây = 524, chỉ số chắc
chắn = 0.82, chỉ số duy trì = 0.84.
41
Bảng 8. Bảng khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn.
Taxa
1
2
3
4
5
6
7
1. NC016920
-
2. M 1.1
0.970
-
3. M 6.21
0.963
0.089
-
4. AF042720
2.200
1.587
1.674 -
5. M 1.5
2.265
1.476
1.494 0.969 -
6. M 6.9
2.112
1.280
1.555 0.790 0.498 -
7. M 6.13
2.032
1.421
1.462 0.695 0.404 0.083 -
Sự tách biệt này khi so sánh với địa điểm thu mẫu của Mang lớn (Bảng 9)
cho thấy có sự tương ứng với miền phía Bắc và phía Nam của đèo Hải Vân. Qua đó,
chúng ta có thể tạm thời kết luận là nhóm này bị chia cắt bởi dãy Trường Sơn và cụ
thể là đèo Hải Vân. Kết quả này cho thấy đây có thể là biên giới tự nhiên của hai
quần thể có sự khác biệt di truyền do cách ly về mặt địa lý.
Bảng 9. Địa điểm thu các mẫu Mang lớn:
Mẫu
Thông tin địa điểm thu mẫu
NC016920
-
M 1.1
KBTTN Dakrong – Quảng Trị
M 6.21
KBTTN Sao La – Huế
AF042720
-
M 1.5
KBTTN Sao La – Quảng Nam
M 6.9
KBTTN Kon Chư Răng – Gia Lai
M 6.13
KBTTN Kon Chư Răng – Gia Lai
5. Kết quả phân tích thời gian tiến hóa
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng cây tiến hóa, xác định thời gian phân
tách giữa các loài Mang. Từ đó có thể liên hệ và đưa ra các giả thiết về sự hình
42
thành các loài Mang, cũng như có thêm thông tin về thời gian phân tách giữa các
loài Mang. Cây tiến hóa thể hiện thời gian phân tách của các loài Mang được thể
hiện trong Hình 15. Bảng 10 gồm thông tin chi tiết về thời gian phân tách giữa các
loài Mang. Qua cây tiến hóa, ta có thể thấy, nhóm Mang được hình thành cách đây
khoảng 7,1 triệu năm; trong đó loài Mang cổ nhất, hay tách ra sớm nhất trong nhóm
Mang là loài Mang reevesi (M. reevesi), loài này hình thành cách đây khoảng 3,65
triệu năm. Trong các loài Mang có vùng phân bố ở nước ta, loài Mang lớn (M.
vuquangensis) hình thành từ cách đây khoảng 2,41 triêu năm còn loài Mang hình
thành muộn nhất là Mang Trường Sơn cách đây khoảng 1,02 triệu năm. Các loài
Mang ở nước ta được không liên quan đến thời điểm hình thành địa chất ở Việt
Nam.
Bảng 10. Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến hóa
Node
Tuổi
(triệu năm)
95% HPD
1
7.79
6.17-9.98
2
7.10
6.02-8.41
3
3.65
2.50-5.02
4
3.03
1.96-4.08
5
2.41
1.49-3.35
6
2.33
1.47-3.28
7
1.51
0.77-2.27
8
1.35
0.75-2.05
9
1.21
0.69-1.76
10
1.02
0.58-1.53
11
0.72
0.38-1.12
12
0.57
0.25-0.95
43
Hình 15. Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của nhóm Mang phân tích bởi
phần mềm BEAST. Các chỉ số phía trên các nhánh lần lượt là giá trị bootstrap của phương pháp
MP, ML; các chỉ số phía dưới các nhánh lần lượt là các chỉ số xác suất hậu nghiệm của phân tích
Bayesian sử dụng dữ liệu gen tổ hợp chung (combined) và dữ liệu từng gen trong tổ hợp
(partitioned). Các gốc nhánh được đánh số theo thời gian phân tách giảm dần. Các chỉ số tại gốc
nhánh thể hiện thời gian phân tách tính theo triệu năm. Vị trí gốc kí hiệu C là vị trí của mốc thời
gian dùng làm chuẩn (Calibration point).
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Bước đầu xác nhận loài Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) và loài Mang Roosevelt
(M. rooseveltorum) rất có thể chỉ là 1 loài, đồng thời qua đó nghiên cứu đã xác nhận
sự có mặt của 4 loài Mang ở Việt Nam là: Mang Ấn Độ (M. vaginalis), Mang
Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) và Mang lớn
(M. vuquangensis). Đặc biệt, việc tái phát hiện loài Mang Roosevelt (M.
rooseveltorum) tại hai địa điểm là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo
tồn thiên nhiên Pù Hoạt có ý nghĩa quan trọng vì kể từ khi được mô tả cách đây hơn
80 năm loài này chưa từng được tìm thấy tại Việt Nam.
2. Ba loài Mang: Mang Putao (M. putaoensis), Mang Roosevelt (M. rooseveltorum)
và Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) có mối quan hệ về mặt di truyền rất gần
nhau, mặc dù Mang Putao (M. putaoensis) chỉ có vùng phân bố ở Ấn Độ và Burma.
3. Loài Mang lớn (M. vuquangensis) có sự tách biệt về mặt di truyền giữa các quần
thể ở miền Trung và miền Nam Việt Nam, điều này xảy ra có thể do sự phân cách
bởi đèo Hải Vân.
4. Trong 4 loài Mang ở Việt Nam, loài Mang lớn (M. vuquangensis) hình thành sớm
nhất cách đây xấp xỉ 3,79 triệu năm; loài Mang Ấn Độ (M. vaginalis), Mang
Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) có thời gian
hình thành loài lần lượt là khoảng 2,33 triệu năm, 1,21 triệu năm và 1,02 triệu năm.
45
KIẾN NGHỊ
1. Cần có thêm các nghiên cứu đánh giá số lượng, tình trạng phân bố các quần thể
và đa dạng di truyền của loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) tại 2 khu bảo tồn
Xuân Liên và Pù Hoạt, để từ đó đưa ra các chiến lược bảo tồn cần thiết cho loài
Mang quý hiếm này.
2. Cần có thêm các nghiên cứu về quần thể của loài Mang Ấn Độ (M. vaginalis) bởi
tính phức tạp về yếu tố di truyền của loài này.
3. Cần có thêm nghiên cứu về loài Mang Vũ Quang để xác nhận sự tách biệt di
truyền giữa các quần thể miền Bắc và miền Nam Việt Nam. Ngoài ra, việc nhân
nuôi nhằm bảo tồn loài mang này cần chú ý tới việc tách riêng các cá thể của hai
nhánh tiến hóa riêng biệt này để tránh hiện tượng giao phối gần làm giảm đa dạng
di truyền.
46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1.
2.
3.
4.
Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009) Cơ sở di truyền học phân tử và tế
bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Lê Đức Minh (2008), “Thuyết trình đề cương cơ bản : Nghiên Cứu Tiến Hóa
và Bảo Tồn của các Loài Mang (Cervidae: Muntiacinae) ở Việt Nam bằng
Phương Pháp Sinh Học Phân Tử”, pp. 1-15.
Lê Đức Minh, Dương Thúy Hà, Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Mạnh Hà,
Đinh Đoàn Long, Đỗ Tước, Nguyễn Đình Hải (2013), “Phương pháp chiết
tách và nhân dòng DNA từ các mẫu mô động vật có chất lượng DNA thấp
phục vụ nghiên cứu đa dạng sinh học. ”, Tạp chí Sinh học 35 pp. 116 - 124.
Lê Đức Minh, Nguyễn Văn Thành, Dương Thúy Hà, Nguyễn Mạnh Hà,
Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Đình Hải, Phạm Anh Tám, Đỗ Trọng Tước
(2014), “Đánh giá đa dạng di truyền các loài mang (Cervidae: Muntiacus) tại
khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học
Tự nhiên và Công nghệ, 30(4S), pp. 117-123.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Alexandre, H., Frederic, D., Anne, R., Catrin, H. (2011), “Pattern and timing
of diversification of Cetartiodactyla (Mammalia, Laurasiatheria), as revealed
by a comprehensive analysis of mitochondrial genomes”, Biologies, 335, pp.
32-50.
Amato, G., Egan, M. G., Rabinowitz, A. (1999), “A new species of muntjac,
Muntiacus putaoensis (Artiodactyla: Cervidae) from northern Myanmar”,
Animal Conservation, 2, pp. 1-7.
Amato, G., Egan, M. G., Schaller, G. B., Barker, R. H., Rosenbaum, H. C.,
and Robichaud, W. G. (1999), “Rediscovery of Roosevelts's Barking Deer
(Muntiacus roosevelttorum)”, Journal of Mammalogy, 80, pp. 639-643.
Birks, S. M. and Edwards, S.V. (2002), “A phylogeny of the megapodes
(Aves: Megapodiidae) based on nuclear and mitochondrial DNA sequences”,
Molecular Phylogenetics and Evolution, 23(3), pp. 408-421.
Brandley, M.C., Schmitz, A., Reeder, T.W. (2005. ), “Partitioned Bayesian
analyses, partition choice, and the phylogenetic relationships of scincid
lizards. ”, Syst. Biol. , 54, , pp. 373–390.
Chau, B. (1997), “Another new discovery in Vietnam”, Vietnam Economic
News, 47, pp. 46-47.
Chen, M., Guo, G. P., Wu, P. J., Zhang, E. D. (2007), “Identification of black
muntjac (Muntiacus crinifrons) in Tibet, China, by cytochrome b analysis”,
Conservation Genetics.
47
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Do, T., D, Vu., Dawson, S., Arctander, P., Mackinnon, J. (1994),
“Introduction of a new large mammal species in Vietnam”, Science and
Technology News, 1994, pp. 4-13.
Drummond, A. J., Ho, S. Y., Phillips, M. J., Rambaut, A. (2006), “Relaxed
phylogenetics and dating with confidence”, PLoS Biol, 4(5), pp. e88.
Drummond, A. J., Rambaut, A. (2007), “BEAST: Bayesian evolutionary
analysis by sampling trees”, BMC Evol Biol, 7, pp. 214.
Edwards A. W. F., Cavalli, S. L. L. (1963), “The reconstruction of evolution.
”, Heredity 18:553.
Egan, M. G. (2000), “The identification of species by diagnostic molecular
characters and the phylogenetic relationships of muntjac”, Ph.D.
Dissertation, Fordham University, New York.
Evans, T. (1995), “Spotlight on Laos”, Wildlife Conservation, 98, pp. 52-57.
Felsenstein, J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using
the bootstrap”, Evolution 39, pp. 783-791.
George, B. S., Elisabeth, S. V. (1996), “Description of the giant muntjac
(Megamuntiacus vuquangensis) in Laos”, Journal of Mammalogy, 77, pp.
675-683.
Gilbert, C., Ropiquet, A., Alexandre, H. (2006), “Mitochondrial and nuclear
phylogenies of Cervidae (Mammalia, Ruminantia): Systematics,
morphology, and biogeography”, Molecular Phylogenetics and Evolution,
40, pp. 18.
Hillis, D. M., Bull, J. J. (1993), “An Empirical Test of Bootstrapping as a
Method for Assessing Confidence in Phylogenetic Analysis”, Systematic
biology, 42(2), pp. 182-192.
Huelsenbeck, J. P., Ronquist, F. (2001), “MRBAYES: Bayesian inference of
phylogenetic trees”, Bioinformatics, 17(8), pp. 754-755.
James, J., Ramakrishnan, U., Datta, A. (2007), “Molecular evidence for the
occurrence of the leaf deer Muntiacus putaoensis in Arunachal Pradesh,
north-east India”, Conservation Genetics, 9(4), pp. 927-931.
Jose, C. (2001), “Cytochrome b Phylogeny and the Taxonomy of Great Apes
and Mammals”, Molecular Biology and Evolution, 18(4), pp. 465-471.
Kumar S., A. J. F. (2001), “Molecular Phylogeny Reconstruction”,
Encyclopedia of life sciences,(Macmillan Publishers).
Le, M., Duong, T. H., Dinh, D. L., Nguyen, Q. T., Pritchard, P.C.H. (2014),
“A phylogeny of softshell turtles (Testudines: Trionychidae) with reference
to the taxonomic status of the critically endangered, giant softshell turtle,
Rafetus swinhoei”, Organisms Diversity & Evolution, 14(3), pp. 279-293.
Le, M., Mccord, W.P., and Iverson, J. B. (2007), “On the paraphyly of the
genus Kachuga (Testudines: Geoemydidae)”, Mol Phylogenet Evolution,
45(1), pp. 398-404.
Le, M., Nguyen, V. T., Duong, T. H., Nguyen, M. H., Dinh, D. L., Do, T.,
Nguyen, D. H., and Amato, G. (2014), “Discovery of the Roosevelt’s
48
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
Barking Deer (Muntiacus rooseveltorum) in Vietnam”, Conservation
Genetics, 15(4), pp. 993-999.
Le, M., Raxworthy, C.J., Mccord, W.P., and Mertz, L. (2006), “A molecular
phylogeny of tortoises (Testudines: Testudinidae) based on mitochondrial
and nuclear genes”, Mol Phylogenet Evolution, 40(2), pp. 517-531.
Mattioli, S., Family Cervidae (Deer), in Hoofed Mammals. 2011.
Mc Cullough, D. R., Pei, K. C. J., Wang, Y. (2000), “Home range, activity
patterns, and habitat relations of Reeves' muntjacs in Taiwan”, Journal of
Wildlife Management, 64, pp. 430-441.
Nylander, J. A., Ronquist, F., Huelsenbeck, J. P., and Nieves-Aldrey, J. L.
(2004), “Bayesian phylogenetic analysis of combined data”, Systematic
biology, 53(1), pp. 47-67.
Osgood, W.H. (1932), “Mammals of the Kelley-Roosevelts and Delacour
Asiatic expeditions. Field Museum of Natural History Publications 312”,
Zoological Series, 18, pp. 192-339.
Page, R. D. M., Holmes, E. C. (1998), Molecular Evolution: Aphylogenetic
Approach, Blackwell Publishing Ltd.
Pei-Yi Chang, C. C. L., Shu-Ju Liao, Lie-Jiau Hsieh, Shuan-Yow Li, MingChieh Chao, Yueuh-Chun Li (2004), “Genetic analysis of two subspecies of
Reeves's Muntjac (Cervidae: Muntiacus reevesi) by karyotyping and satellite
DNA analyses”, Zoological Studies, 43, pp. 749-758.
Pham, M. G., Do, T., Vu, V. D., Geoge, A. (1998), “Description of
Muntiacus truongsonensis, a new species of muntjac (Artiodactyla:
Muntiacidae) from central Vietnam and implication for conservation”,
Animal Conservation, 1, pp. 61-68.
Posada D. and Crandall, K. (1998), “MODELTEST: testing the model of
DNA substitution”, Bioinformatics, 14(817-818).
Scott, K. (1994), “Vietnam explosion”, BBC wildlife, 12, pp. 12.
Swofford, D. L. (2001), “Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and
other methods), version 4”, Sinauer Associates, Massachusetts.
Evans, T., Timmin, R. J. (1994), “News from Laos”, Oryx, 29, pp. 3-4.
Timmins, R. J., Duckworth, J. W. (2012), “Muntiacus. In: 2012 IUCN Red
List of Threatened Species[...]... và thịt Mang Ấn Độ là loài có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet, Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy loài này có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân loài đã được mô tả dựa trên vùng phân bố về địa lý [16] 4 1.1.2.2 Mang Pù Hoạt (M puhoatensis) Loài Mang. .. dựa trên các chỉ thị phân tử 2.1 Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử dụng trong nghiên cứu Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu hiệu hình thái bên ngoài, tập tính, cấu trúc tế bào Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu hình thái cho thấy một số hạn chế,... Bayesian nhằm so sánh các kết quả thu được để tăng độ tin cậy cho kết quả cuối cùng Ba phương pháp kể trên đều đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu tiến hóa và đã cho kết quả với độ tin cậy tốt ở các nghiên cứu trước đây [1 , 25 , 34] 2.2.1 Ma trận khoảng cách (Distance matrix) Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu tiến hóa Trong số đó,... cả các mẫu Gen 16S và G-fib có kích thước khoảng 600bp, gen ND4 có kích thước khoảng 700bp Số lượng chi tiết của các gen được chúng tôi tiến hành giải trình tự và các gen từ GenBank sử dụng cho nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 4 15 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu nghiên cứu 1.1 Mẫu vật nghiên cứu Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu bởi các chuyên gia thuộc Trung tâm Nghiên. .. Fermentas 1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đã được sử dụng và cho kết quả tốt trong các nghiên cứu về nhóm Mang cũng như các nhóm thú khác trong các nghiên cứu trước Ngoài ra, trình tự mồi cho phản ứng nhân phân đoạn gen ND4 được chúng tôi tự thiết kế trong nghiên cứu này Các mồi được đặt tại hãng IDT – Mỹ Trình tự các cặp mồi này được thể hiện ở dưới đây (Bảng... điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu 22 1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: Các thiết bị chúng tôi sử dụng thuộc phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2 Phương pháp nghiên cứu Với mục đích thu nhận trình tự các đoạn gen chỉ thị, từ đó sử dụng để phân tích, đánh giá đa dạng di truyền, cũng như tiến hóa của các loài Mang. .. loại thể hiện được mô hình đồng hồ phân tử giữa các loài [13] 2.4 Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích Hiện nay, rất nhiều các chỉ thị phân tử được xác định với các vai trò khác nhau, phụ thuộc các mục đích và đối tượng trong các nghiên cứu Trong đó, hệ gen ty thể, so với hệ gen nhân, có phương thức sao chép và di truyền khá khác biệt Bởi vậy, tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những... kết quả cho thấy, trong loài này có những nhánh tiến hóa riêng biệt Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu bảo tồn Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể trong hai khu bảo tồn [4] Hình 2 Mang Vũ Quang (M vuquangensis)... Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng tôi đã xác nhận sự có mặt của loài Mang này Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định loài này có khu vực phân bố ở Việt Nam [28] Ngoài ra, chúng tôi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di 5 truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn. .. bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật cho đến nay rất ít [42] Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào, chúng tôi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này Khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt ... NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN... dụng số thị phân tử nghiên cứu tiến hóa loài Mang (Muntiacinae) Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, phân bố, mối quan hệ tiến hóa loài Mang Việt Nam CHƯƠNG... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 16 16 1.1 Mẫu vật nghiên cứu 16 1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 17 1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: 23