2. Phương pháp nghiên cứu
2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen
Sản phẩm sau khi tách chiết ADN tổng số và sau phản ứng PCR đều được tiến hành điện di trên gel Agarose 1% để xác định sự có mặt của phân tử ADN. Với ADN tổng số, điện di sử dụng gel Agarose 1%, chạy trong môi trường đệm TBE 1X (Tris base, axit Boric, EDTA, H2O), marker 1kb. Điện di sản phẩm PCR sử dụng gel Agarose, chạy trong môi trường đệm TBE 1X, marker 100bp.
Các sản phẩm PCR thành công (xác định nhờ điện di) được tiến hành tinh sạch bằng bộ kit sạch sản phẩm PCR của Thermo trước khi gửi giải trình tự hai chiều tại FirstBase - Malaysia. Các bước tinh sạch cụ thể như sau:
Bước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:1 của Buffer Binding vào hỗn hợp PCR để được một dung dịch hoàn chỉnh (ví dụ cho mỗi 100µl của hỗn hợp phản ứng, thêm 100µl Buffer Binding). Trộn kỹ và đều hỗn hợp dung dịch. Kiểm tra màu sắc của dung dịch: màu vàng thể hiện pH tối ưu cho việc cố định ADN. Nếu màu sắc của dung dịch có màu cam hoặc tím, thêm 10µl dung dịch acetate 3M, pH 5.2 và trộn đều, màu sắc của hỗn hợp sẽ trở thành màu vàng.
Bước 2: Chuyển tối đa 800µl dung dịch từ bước 1 vào cột GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ các dung dịch thông qua cột. Lưu ý: nếu tổng khối lượng vượt quá 800µl, dung dịch có thể được thêm vào các cột thành từng giai đoạn. Sau khi bổ sung 800µl dung dịch, ly tâm cột 30-60s và loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc. Lặp lại cho đến khi toàn bộ dung dịch đã được thêm vào màng cột.
Bước 3: Thêm 700µl Wash Buffer (đã được thêm Ethanol) vào cột lọc GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc và đặt các cột lọc trở lại vào ống thu.
27
Bước 4: Ly tâm cột GeneJET ™ thêm 1 phút để hoàn toàn loại bỏ phần đệm rửa còn sót lại. Lưu ý: bước này là điều cần thiết vì đệm rửa còn sót lại trong mẫu DNA có thể ức chế các phản ứng sau đó.
Bước 5: Chuyển cột GeneJET ™ tới một ống 1,5 ml sạch (không kèm theo trong bộ kit). Thêm 50µl Elution buffer đến trung tâm màng của cột GeneJET ™ và ly tâm trong 1 phút.
Kết quả giải trình tư hai chiều nhận được sẽ được đối chiếu với nhau để nhận được 1 trình tự duy nhất dựa trên phần mềm Geneious ver 8.0. Trình tự thu được sẽ được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) nhằm đảm bảo tính xác thực qua công cụ Blast.