XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THIÊN THẢO TRỒNG TẠI AN GIANG BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔKHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG…………..o0o………….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌCMã:7720201XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THIÊN THẢO TRỒNG TẠI AN GIANG BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNAGIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪNSINH VIÊN THỰC HIỆNTS. THIỀU VĂN ĐƯỜNGHọ và tên: MSSVLớp: Cần Thơ , 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔKHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG…………..o0o………….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌCMã:7720201XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THIÊN THẢO TRỒNG TẠI AN GIANG BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNAGIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪNSINH VIÊN THỰC HIỆNTS. THIỀU VĂN ĐƯỜNGHọ và tên: MSSV: LớpCần Thơ , 2021 LỜI CẢM ƠNQuá trình thực hiện tiểu luận tốt nghiệp là giai đoạn quan trọng nhất trong quãng đời mỗi sinh viên. Tiểu luận tốt nghiệp là tiền đề nhằm trang bị cho em những kỹ năng nghiên cứu, những kiến thức quý báu trước khi lập nghiệp.Trước hết, em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Dược – Điều dưỡng, Trường Đại Học Tây Đô đã tận tình chỉ dạy và trang bị cho em những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian ngồi trên ghế giảng đường, Làm nền tảng cho em có thể hoàn thành được bài luận văn này.Em xin trân trọng cảm ơn thầy TS. Thiều Văn Đường đã tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học. Đó là những góp ý hết sức quý báu không chỉ trong quá trình thực hiện tiểu luận này mà còn là hành trang tiếp bước cho em trong quá trình học tập và lập nghiệp sau này.Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp Đại Học Dược 12B, những người luôn sẵn sàng sẻ chia và giúp đỡ trong học tập và cuộc sống. Mong rằng, chúng ta sẽ mãi mãi gắn bó với nhau. Xin chúc những điều tốt đẹp nhất sẽ luôn đồng hành cùng mọi người.”Sinh viên thực hiện (Ký ghi rõ Họ tên) Trần Khánh Duy LỜI CAM ĐOANEm xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân em và được sự hướng dẫn khoa học của TS. Thiều Văn Đường. Các nội dung nghiên cứu trong đề tài “Xác định tên khoa học cây Thiên Thảo trồng tại tỉnh An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA” của em là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được cá nhân thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung bài tiểu luận của mình.Sinh viên thực hiện (Ký ghi rõ Họ tên) Trần Khánh Duy TÓM TẮTTÍNH CẤP THIẾTCây thiên thảo là cây hàng năm với chiều cao khoảng 40cm. Đây là một cây thuốc quý thường được sử dụng trong đông y. Từ lâu, cây Thiên thảo đã được sử dụng chữa xương khớp (phong thấp, đau lưng, mỏi khớp), đầy bụng, trướng bụng, ăn không tiêu. Theo y học cổ truyền, dược liệu Thiên thảo ở Khánh Hoà, nhân dân dùng toàn cây sắc thuốc chữa bạch đới, khí hư. Lá trị phong thấp, kinh phong, tim đập nhanh, bệnh thần kinh (Theo Phạm Hoàng Hộ). Đây là loại cây rất có tiềm năng để khai thác về mặt dược lý, trong tương lai có thể trở thành một dược liệu có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, việc “Xác định tên khoa học của cây Thiên thảo trồng tại An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA” rất cần thiết. Thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu khẳng định tên khoa học cây Thiên thảo bằng chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử và vai trò cây Thiên thảo chữa trị bệnh đối với sức khỏe con người.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUĐề tài này được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứu chính là: Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu. Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng, (trình tự nucleotid gen ITS) của cây Phước lộc thọ theo phương pháp Sanger. Xác định những công bố mới về tác dụng của cây Thiên thảo đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị đối với sức khỏe của con người. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNĐề tài đã tổng hợp và trình bày tương đối đầy đủ tên khoa học, đặc điểm hình thái, vai trò của cây Thiên thảo chữa trị một số bệnh thường gặp trên đất nước Việt nam.Chiết xuất và tinh sạch DNA, giải trình tự gen DNA theo phương pháp Sanger trình tự gen ITS của cây Thiên thảo làm chỉ thị phân tử trong phân loại..Một số công bố mới về tác dụng của cây Thiên thảo đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị đối với sức khỏe của con người. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊĐề tài đã công bố được 04 kết luận chính xác, tin cậy và xác định đúng tên khoa học của cây Thiên thảo. Đưa ra 02 kiến nghị hợp lý nhằm mở rộng đề tài, nghiên cứu rộng về vai trò cây Thiên thảo đối với sự phát triển kinh tế, xã hội tại Đồng bằng Sông Cửu Long.. MỤC LỤCCHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU31.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN31.1.1 Trên thế giới31.1.2 Ở Việt Nam31.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY THIÊN THẢO31.2.1 Khái niệm về chỉ thị31.2.2 Phân loại31.2.3 Đặc điểm hình thái41.2.4. Đặc điểm vi phẫu61.2.5. Đặc điểm sinh thái81.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ91.3.1 Khái niệm91.3.2 Chiết xuất và tinh sạch DNA91.3.3 Phương pháp PCR101.3.4 Giải trình tự gen (DNA)111.4 VAI TRÒ CỦA CÂY THIÊN THẢO VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI121.4.1 Dược liệu121.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền121.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay121.4.4. Một số lưu ý khi sử dụng cây Thiên Thảo131.4.5. Một số chế phẩm sử dụng hôm nay13CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU142.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU142.1.1. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu142.1.2. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị142.1.3. Thời gian nghiên cứu142.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU152.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái152.2.2. Phương pháp chỉ thị phân tử172.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT222.3.1. Nghiên cứu lý thuyết222.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu222.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU22CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN233.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI233.1.1. Thân.233.1.2. Lá233.1.3. Rễ233.1.4. Hoa233.1.5. Quả233.1.6. Hạt233.2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR233.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn233.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn233.3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP233.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA233.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA233.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI233.4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY THIÊN THẢO23CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ244.1. KẾT LUẬN244.1.1.Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí:244.1.2. Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây Thiên Thảo244.1.3. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên Thảo và trình tự gen của cây này244.2. KIẾN NGHỊ24TÀI LIỆU THAM KHẢO25PHỤ LỤC26Phụ lục A26Phụ lục B. Quy trình ly trích DNA27Phụ lục C. CÁC HÌNH ẢNH CÂY THIÊN THẢO TẠI AN GIANG29 DANH MỤC HÌNHHình 1. Hình thái cây và cụm hoa4Hình 2. Cành cây, hoa, đài hoa chia đôi, tràng hoa chia đôi.5Hình 3. Thân và rễ cây5Hình 4. Hoa và tán cây5Hình 5. Hạt cây6Hình 6. Mặt cắt ngang của cuống lá cho thấy các vùng khác nhau8Hình 7. Ảnh hiển vi SEM của hạt phấn và hạt của cây.9Hình 8. Kinh Mạch Xương Khớp – Thiên Thảo Mộc14Hình 9. Thảo Linh Tiên14 DANH MỤC BẢNGBảng 1. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất16Bảng 2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR18Bảng 3. Chương trình cài đặt các bước19 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTSTTKí hiệu chữ viết tắtChữ viết đầy đủ1DNADeoxyribonucleic Acid2SEMScanning Electron Microscope3PCRPolemerase Chain Reaction4SDSSodium Monododecyl Sulfate5TEDung Dịch Đệm Te Chứa Tris6EBDung Dịch Thu Hồi DNA Elution Bufer7ITSInternal Transcribed Spacer8EDTAEthylendiamin Tetraacetic Acid MỞ ĐẦULý do chọn đề tàiTừ xa xưa, con người đã biết sử dụng những loài cây hoang dại để làm thức ăn, vật liệu xây dựng, chất đốt, thức ăn gia súc hay làm đồ gia dụng và đặc biệt hơn là được dùng làm thuốc chữa bệnh. Lúc này, người ta chỉ biết dùng cây cỏ mọc hoang dại để làm thuốc trị một số chứng bệnh thông thường như cảm, sốt, đau đầu, bệnh ngoài da. Sau này, đi sâu tìm hiểu về cây cỏ chữa các bệnh nan y về gan, thận, tim mạch… Cho đến ngày nay, dù cho khoa học hiện đại phát triển theo hướng sử dụng hóa chất làm thuốc chữa trị thì cây cỏ làm thuốc vẫn đóng một vai trò quang trọng trong nền Y học cổ truyền và chính là nguồn nguyên liệu quý giá cho nhiều loại thuốc hiện đại có nguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên. Nước ta nằm trong vùng vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, có địa hình thay đỗi từ Bắc chí Nam, nhiệt độ và lượng mưa trung bình hằng năm phân bố không đồng đều đã tạo nên nhiều kiểu thảm thực vật quan trọng, với nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú và đa dạng chủng loại, trong đó có nguồn tài nguyên cây thuốc. Theo thống kê của Viện Dược liệu (Bộ Y tế), tính đến cuối năm 2016 đã ghi nhận và thống kê được ở Việt Nam có 5.117 loài thực vật có giá trị làm thuốc, đóng một vai trò đặc biệt quan trọng trong việc cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu sản xuất thuốc trong nước và xuất khẩu thế giới.Tuy nhiên, do tình trạng khai thác tài nguyên quá mức, nạn cháy rừng, nóng lên toàn cầu, cũng như áp lực gia tang dân số và nhu cầu sử dụng thuốc chữa bệnh ngày càng nhiều, đặc biệt là các dược liệu nguồn gốc tự nhiên rất được ưa chuộng, dẫn đến nguồn tài nguyên cây thuốc ngày một bị cạn kiệt, nhiều loài cây thuốc đang phải đối mặt với nguy cơ bị tuyệt diệt. Bên cạnh đó, một số loại cây được phát hiện khá sớm ở thời điểm khoa học chưa tiên tiến hay ở những địa điểm mà trình độ kỹ thuật không cao. Điều này rất dễ dẫn đến việc sai sót trong đánh giá tiềm năng chữa bệnh của một số cây. Một số cây khi phát hiện chỉ được nghiên cứu sơ bộ về mặt hình thái hay thậm chí là những mô tả mơ hồ về hình dáng bên ngoài cây. Chính điều này khiến một số cây đáng ra có thể có tiềm năng trở thành một vị thuốc, một dược liệu, lại chỉ được con người dùng như một cây cảnh để trang trí. Điển hình như cây Thiên thảo. Về mặt dược liệu, hầu như không có bất cứ tài liệu khoa học nào nghiên cứu về cây Thiên thảo, cho nên về mặt tác dụng dược lí hầu như là không được biết đến. Điều này có thể do loại cây này lúc được phát hiện đã không được nghiên cứu kỹ. Nói đến cây Thiên thảo sự hiểu biết và mô tả theo chỉ thị hình thái mới được trình bày từ những năm 70 thế kỷ trước. Điều này khiến cho hiểu biết của chúng ta về loại cây này hầu như là rất sơ khai. Đến nay nghiên cứu DNA các cây dược liệu trở thành xu hướng chung trong nghiên cứu dược liệu. Mục đích việc xác định chính xác loài dược liệu là vô cùng cần thiết, vì khi xác định chính xác mới tìm kiếm và sử dụng tốt các sản phẩm của dược liệu. Đây chính là cơ hội cho chúng ta tìm ra những dược liệu mới từ những loại cây mà chúng ta đã lãng quên vì cho rằng chúng chỉ mang tính trang trí. Đến nay, việc tìm hiểu đầy đủ về cây Thiên thảo để đưa loại cây này thành thuốc và thực phẩm chức năng trở thành yêu cầu tất yếu với các nhà Dược học. Sự phát triển vượt bậc của công nghệ DNA và giải trình tự gen từ cuối thế kỷ XX cho tới nay, trở thành công cụ chính xác và kịp thời đã giúp xác định các loài cây cũng như cây làm dược liệu không còn khó khăn. Chỉ thị phân tử trở thành công cụ chính xác tuyệt đối trong phân loại thực vật, động vật. Nhiệm vụ của chúng tôi dựa trên các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định chính xác cây Thiên thảo. Đưa chỉ thị này trở thành chỉ thị chính xác định ngay mà không còn phải chờ đợi thời gian. Vì những lý do trên đi đến thực hiện đề tài “Xác định tên khoa học cây Thiên Thảo trồng tại tỉnh An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA”. Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tử làm công cụ xác định tiềm năng trở thành dược liệu của cây Thiên thảo. Để hoàn thành mục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây: Khái quát được những hiểu biết về cây Thiên thảo cho đến hiện nay. Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Thiên thảo. Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên thảo. Giải trình được trình tự gen ITS của cây Thiên thảo làm chỉ thị phân tử. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN1.1.1 Trên thế giớiBasilicum polystachyon (L.) Moench là một loài thực vật thuộc chi Lamiaceae, phân bố nhiều ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Á và Châu Úc. Loài này được tìm thấy ở phía nam của Đài Loan trong thời kỳ thuộc địa của Nhật Bản, không có tài liệu thu thập nào được thấy sau giải phóng, theo số liệu thu thập thực địa gần đây, loài này được tìm thấy ở những vùng đất trống và hoang vu phía nam Đài Loan. Bài báo này mô tả các đặc điểm phân loại, ảnh và sự phân bố của nó và lần đầu tiên báo cáo rằng nó là hạt phấn 6 khe có kiểu hình lưới trên bề mặt và nhiễm sắc thể 2n = 60. Loài này được (L.) Moench mô tả khoa học đầu tiên năm 1802.1.1.2 Ở Việt NamThường mọc ở chỗ đất hoang từ Thừa Thiên Huế tới Cần Thơ. Được dùng như các vị thuốc Dân gian, chưa có nhiều nghiên cứu khoa học.1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY THIÊN THẢO1.2.1 Khái niệm về chỉ thịĐể phân biệt các cá thể khác nhau của cùng một loài, người ta thường sử dụng các chỉ thị di truyền. Chỉ thị đi truyền là một tính trạng hay một thuộc tính có thể đo đếm được và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.Theo Paterson và cộng sự, một tính trạng được coi là chỉ thị đi truyền nhất thiết phải bảo đảm hai tiêu chuẩn: Phải phản ánh được sự đa hình giữa bố và mẹ. Phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau. Các chỉ thị dị truyền có vai trò như thế nào đối với các nghiên cứu di truyền và chọn giống.Chỉ thị di truyền rất hữu ích trong việc nghiên cứu sự thừa kẻ những dấu hiệu đi truyền và sự biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là những chỉ thị liền quan đến tính trạng nông sinh học có lợi cho con người. Những chỉ thị này từ lâu đã là những công cụ có ích trong chương trình chọn giống (Retter và cộng sự 1993).Theo hai tiêu chuẩn của chỉ thị di truyền, chỉ thị di truyền được chia thành chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tử DNA.1.2.2 Phân loạiTên khoa học: Basilicum polystachyon (L.) Moench (Lamiaceae).Họ: Hoa môi Lamiaceae.Tên khác: Sonakki poondu (Tamil), Thiến thảo, Phòng phong thảo, Thổ hoắc hương.Basilicum polystachyon war. stereocladum Briq, Ocimum dimidiatum,…1.2.3 Đặc điểm hình thái1.2.3.1 ThânCây thảo sống trên cạn, không thơm, cao đến 0,7 m; thân mọc thẳng, phân nhánh nhiều, màu xanh lục, có lông và có tuyến dọc theo các góc, màu đỏ trên các nốt sần. Hình 1. Hình thái cây (A) và cụm hoa (B) của Basilicum polystachyon (L.) Moench1.2.3.2 LáPhiến lá hình tam giác hình trứng hoặc hình mũi mác 27 × 15 cm, đỉnh hẹp hình chóp nhọn hoặc hình chóp, đáy rộng hình nón tròn, mép có răng cưa, màng, nhánh con xen lẫn tuyến vàng; cuống lá dài 25 cm, hình chóp. Hình 2. Basilicum polystachyon: A. Cành cây; B. Hoa; C. Đài hoa chia đôi (mặt lưng); D. tràng hoa chia đôi (mặt bụng); E. Gynoecium; F. Đai ốc.1.2.3.3 Rễ cây Hình 3. Thân và rễ cây1.2.3.4. HoaHoa nhỏ mọc thành vòng; lá bắc cỡ 1mm; đài 5 tai, một cái lớn và 2 cái rất hẹp, tràng đỏ, 4 tai gần như bằng nhau; 4 nhị. Cây ra hoa tháng 34. Hình 4. Hoa và tán cây1.2.3.5. QuảQuả hạch có hình elip theo chiều dọc, màu nâu, hơi dẹt ở lưng và bụng, chiều dài khoảng 7 mm và có các sọc lồi giống lưới tròn trên bề mặt. Thời kỳ đậu quả: tháng 5 đến tháng 10.1.2.3.6 Hạt Hình 5. Hạt cây1.2.4. Đặc điểm vi phẫuThânM