KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÂY LÔ HỘI TRỒNG Ở MỘT SỐ TỈNH, THÀNH MIỀN TÂY BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI, VI PHẨU VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC ĐIỀU DƯỠNG ❧✶❧ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 7720201 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÂY LÔ HỘI TRỒNG Ở MỘT SỐ TỈNH, THÀNH MIỀN TÂY BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI, VI PHẨU VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS ¬¬¬¬ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG PHẠM QUI QUYỀN MSSV: 1652720401352 LỚP: ĐẠI HỌC DƯỢC 11C Cần Thơ, 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC ĐIỀU DƯỠNG ❧✶❧ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 7720201 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÂY LÔ HỘI TRỒNG Ở MỘT SỐ TỈNH, THÀNH MIỀN TÂY BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI, VI PHẨU VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS ¬¬¬¬ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG PHẠM QUI QUYỀN MSSV: 1652720401352 LỚP: ĐẠI HỌC DƯỢC 11C Cần Thơ, 2021 LỜI CẢM ƠN Sự thành đạt của mỗi con người đều có sự giúp đỡ của biết bao nhiêu người thân quen và đáng trân trọng. Để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến quý thầy, cô của trường Đại học Tây Đô. Đặc biệt em cảm ơn thầy TS. Thiều Văn Đường, người đã nhiệt tình hướng dẫn em hoàn thành bài Khóa luận tốt nghiệp Cùng với kiến thức học được trên lớp, việc tiếp cận công việc nghiên cứu là hết sức cần thiết đối với sinh viên ngành Dược. Tuy nhiên với thời gian ngắn, khả năng nghiên cứu và kinh nghiệm thực tế còn hạn hẹp, nhưng em cũng được mở rộng thêm những kiến thức và có thêm kinh nghiệm làm đề tài Khóa luận, giúp vốn kiến thức của em ngày càng phong phú trong quá trình chăm sóc sức khỏe nhân dân và đó cũng là hành trang quý báu cho công việc của em sau này. Trong quá trình làm Khóa luận, do còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tế nên không tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nhất định. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình, đóng góp ý kiến quý báu của quý thầy cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, phục vụ tốt hơn trong công việc sau này. Một lần nữa em xin chúc quý thầy cô Trường Đại Tây Đô và thầy Thiều Văn Đường dồi dào sức khỏe và luôn thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là tài liệu nghiên cứu riêng của em và được hướng dẫn của thầy TS. Thiều Văn Đường. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực. Những số liệu, tài liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính em thu thập từ các nguồn khác nhau. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung Khóa luận của mình. TÓM TẮT Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học –Khóa học; 20162021 Chuyên ngành: Dược học Mã số: 7720201 Đánh giá sự đa hình di truyền cây Lô Hội trồng ở một số tỉnh, thành miền Tây bằng chỉ thị hình thái, vi phẩu và giải trình tự đoạn gen ITS Sinh viên: Phạm Qui Quyền Giảng viên hướng dẫn: TS. Thiều Văn Đường TÍNH CẤP THIẾT Cây Lô hội là một dược liệu quý và trở thành phổ biến với người dân Việt Nam. Dược liệu là nguồn tài sản vô cùng quý giá. Nhưng thật giả lẫn lộn, do quá trình tiến hóa của nguồn dược liệu từ khi hình thành, tồn tại cho đến ngày nay. Mặt khác nguồn lợi thu được từ dược liệu làm cho một số người mờ mắt, chỉ nghĩ tới lợi nhuận đã giả mạo dược liệu quý, nhằm thu lợi bất chính. Vì vậy, việc “Đánh giá sự đa hình di truyền cây Lô hội (aloe vera) trồng ở một số tỉnh thành miền Tây bằng chỉ thị hình thái,vi phẩu và giải trình tự đoạn gen ITS” rất cần thiết. Thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu khẳng định sự đa hình cây Lô hội bằng chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử và vai trò cây Lô hội chữa trị bệnh, nguồn thực phẩm chức năng đối với sức khỏe con người. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài này được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứu chính là: Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu. Phương pháp phân loại thực vật của Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) để tìm hiểu cây Lô hội theo chỉ thị hình thái. Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng, (trình tự nucleotid gen ITS) của cây Lô hội theo phương pháp Sanger. Xác định những công bố mới về tác dụng của cây Lô hội đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị và vai trò dinh dưỡng đối với sức khỏe của con người. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đề tài đã tổng hợp và trình bày tương đối đầy đủ tên khoa học (Aloe vera), đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu, vai trò của cây Lô hội chữa trị một số bệnh thường gặp và vai trò dinh dưỡng của cây Lô hội trên đất nước Việt Nam. Chiết xuất và tinh sạch DNA, giải trình tự gen DNA theo phương pháp Sanger trình tự gen ITS của cây Lô hội làm chỉ thị phân tử trong phân loại. Một số công bố mới về tác dụng của cây Lô hội đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị và vai trò dinh dưỡng đối với sức khỏe của con người. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đề tài đã công bố được 02 kết luận chính xác, tin cậy và xác định đúng tên khoa học của cây Lô hội. Đưa ra 02 kiến nghị hợp lý nhằm mở rộng đề tài, nghiên cứu rộng về vai trò cây Lô hội đối với sự phát triển kinh tế, xã hội tại Đồng bằng Sông Cửu Long. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iii MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU 1 Chương 1.TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3 1.1. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Ở Việt Nam 5 1.1.3. Nguồn gốc và phân bố 6 1.2. MỘT SỐ KHÁI NIỆM LIÊN QUAN 7 1.2.1. Khái niệm chỉ thị 7 1.2.2. Chỉ thị hình thái (morphological marker). 7 1.2.3. Chỉ thị sinh hóa (biochemical marker). 7 1.2.4. Các chỉ thị phân tử DNA (DNA markers). 8 1.3. TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY LÔ HỘI ( NHA ĐAM ) 8 1.3.1. Chỉ thị hình thái cây Lô hội và phân loại 8 1.3.2. Đặc điểm hình thái 9 1.3.3. Đặc điểm sinh thái 12 1.4. CHỈ THỊ PHÂN TỬ 13 1.4.1. Chiết xuất tinh sạch DNA 13 1.4.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: chủ thị RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphism đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) 13 1.4.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội DNA (Amplificationbased markers hoặc PCRbased markers) 14 1.4.4. Giải trình tự gen (DNA) 15 1.4.5. Những chuối lặp lại (Repeatitive sequences) 15 1.5. DƯỢC CHẤT VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 17 1.5.1. Thành phần hóa học 17 1.5.2 Dược liệu 19 1.5.3 Tác dụng dược lý 19 1.5.4. Công năng 20 1.5.5. Công dụng 20 1.5.6. Cách dùng, liều lượng 20 1.5.7. Bài thuốc 21 1.6. VAI TRÒ CỦA LÔ HỘI ĐỐI VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 22 1.7. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY LÔ HỘI 23 1.7.1 Cách chế biến 23 1.7.2. Những giá trị mới trong điều trị bệnh đối với con người 23 1.7.3. Thực phẩm 26 1.7.4. Làm đẹp 26 1.8. CÁC SẢN PHẨM TỪ NHA ĐAM 27 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30 2.1.1. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị 30 2.1.2. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 30 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái 31 2.2.2. Phương pháp chỉ thị phân tử 33 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 38 2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết 38 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu 38 2.4.VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 38 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. ĐA DẠNG VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY LÔ HỘI 39 3.1.1. Đặc điểm hình thái 39 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu 44 3.1.4. Đặc điểm soi bột dược liệu 47 3. 2. ĐA DẠNG VỀ DI TRUYỀN CÂY LÔ HỘI 48 3. 2. 1. Kết quả thu được các đặc điểm phân tử cây Lô hội 48 Trình tự load NCBI: 50 3.2.2. Kết quả đáng giá độ đa dạng di truyền cây Lô hội ở tám tỉnh, thành miền Tây 52 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 4.1. KẾT LUẬN 55 4.1.1. Sự đa dạng di truyền theo đánh giá chỉ thị hình thái 55 4.1.2. Sự đa dạng về mặt di truyền 55 4.2. KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC A. Cơ sở giải trình tự DNA PL1 PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ ĐO OD, Gel PL2 PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH CÂY LÔ HỘI Ở BẠC LIÊU PL3 DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1 Cây Lô hội 4 Hình 1. 2 Cây Lô hội 9 Hình 1. 3 Các bộ phận cây Lô hội 10 Hình 1. 4 Cây Lô hội 10 Hình 1. 5 Lá cây Lô hội 11 Hình 1. 6 Hoa cây Lô hội 11 Hình 1. 7 Quả cây Lô hội 12 Hình 1. 8 Rễ cây Lô hội 12 Hình 1. 9 Một số công thức đại diện 18 Hình 1. 10 Một số loại nước được sản xuất từ Nha đam 27 Hình 1. 11 Một số loại sữa chua được làm từ Nha đam 28 Hình 1. 12 Các loại mỹ phẩm và thực phẩm chức năng 29 Hình 3. 1 Chiều cao thân cây Lô hội 39 Hình 3. 2 Chiều dài lá Lô hội 40 Hình 3. 3 Chiều rộng lá Lô hội 40 Hình 3. 4 Kích thước rễ Lô hội 41 Hình 3. 5 Kích thước hoa Lô hội 42 Hình 3. 6 Vi phẫu lá Lô hội 45 Hình 3. 7 Vi phẫu rễ Lô hội vùng vỏ 46 Hình 3. 8 Vi phẫu rễ Lô hội vùng trung trụ 46 Hình 3. 9 Vi phẫu thân Lô hội 47 Hình 3. 10 Bột lá Lô hội 47 Hình 3. 11 Cấu tử tìm được trong lá Lô hội 48 Hình 3. 12 Kết quả điện di DNA các mẫu tren gel agaro 49 Hình 3. 13 Sản phẩm PCR của các mẫu Lô hội được sưu tập ở 8 tỉnh ĐBSCL 53 Hình 3. 14 Mối quan hệ di truyển của 8 mẫu Lô hội 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1 Vị trí thu mẫu tại 8 tỉnh thành miền tây 30 Bảng 2. 2 Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất 34 Bảng 2. 3 Thành phần và thứ tự phản ứng PCR 36 Bảng 2. 4 Chương trình cài đặt các bước 37 Bảng 3.1 Chiều cao cây Lô hội 39 Bảng 3.2 Chiều cao cây Lô hội tại 8 tỉnh, thành miền Tây 39 Bảng 3.3 Chiều dài, rộng lá Lô hội 40 Bảng 3. 4 Kích thước lá Lô hội đo được tại 8 tỉnh, thành miền Tây 41 Bảng 3. 5 Kích thước rễ Lô hội 41 Bảng 3. 6 Kích thước rễ Lô hội được đo tại 8 tỉnh, thành miền Tây 42 Bảng 3. 7 Chiều cao hoa Lô hội 42 Bảng 3. 8 Chiều dài hoa Lô hội được đo tại 8 tỉnh, thành miền Tây 43 Bảng 3. 9 Đặc điểm hình thái và nông học của tám mẫu Lô hội (đơn vị: cm). 44 Bảng 3. 10 Giá trị tương đồng của 8 mẫu Lô Hội khi so sánh trình tự trên ngân hàng NCBI. 52 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT STT Số thứ tự DNA Deoxy Ribonucleic Acid NDA Nicotimide Adenine Dinucleotide RNA Acid Ribonucleic TNHH Trách nhiệm hữu hạn PCR Polymerase Chain Reaction NST Nhiễm sắc thể WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới RFLP Restriction Fragment Length Polymorphison STS Sequence Tagged Sites RAPD Randomly Amplified Polymorphicdnas CAP Cleaved Amplification Polymorphism AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism SCARs Sequence Characterized Amplified Region SRFA Selective Restriction Fragmentamplifilcation PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis TAS TelomereAssociated Sequences SSR Simple Sequence Repeats CTV Cộng tác viên EB Extraction Buffer Bộ đệm chiết xuất ITS Internal Transcribed Spacer QTL Quantitave Trait Loci EtBr Ethidium Brimide O.D Giá trị mật độ quang ở bước sóng SDS Sodium Đoecyl Sulfate dNTP Deoxynucleoside Triphosphates RNase Ribonuclease EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia MỞ ĐẦU Thế giới của thế kỷ XXI, hầu như các loài thực vật – đặc biệt các cây làm dược liệu – đã được nghiên cứu tương đối hoàn chỉnh. Xong sự khác biệt và tiến hóa của nguồn dược liệu này (trãi qua quá trình hình thành, sinh trưởng, phát triển hàng trăm năm) đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và xác định lại theo chỉ thị phân tử. Về mặt dược liệu và tác dụng của Lô hội: sử dụng kháng khuẩn, nhuận tràng, làm lành vết thương, trị viêm loét dạ dày, bệnh ngoài da, phòng ngừa sỏi niệu, bệnh viêm xơ gan cổ trướng, bệnh đái tháo đường, bệnh cao huyết áp, trị mụn... thường dùng như nguồn thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao phục vụ sức khỏe con người hay dược phẩm dùng làm đẹp da... Nói đến cây Lô hội, sự hiểu biết và mô tả theo chỉ thị hình thái đã được trình bày từ xa xưa. Đến nay nghiên cứu DNA các cây dược liệu trở thành xu hướng chung trong nghiên cứu dược liệu. Mục đích việc xác định chính xác loài dược liệu là vô cùng cần thiết, vì khi xác định chính xác mới tìm kiếm và sử dụng tốt các sản phẩm của dược liệu. Cây Lô hội dùng làm dược liệu từ xa xưa, nhưng để tránh nhầm lẫn và giả mạo khi trở thành dược liệu là việc làm hết sức quan trọng đối với ngành Dược. Các nhà khoa học đang đi sâu về xác định ADN cây Lô hội, hiện tại theo tôi ở Việt Nam mới thành công trong chiết xuất dược chất dạng nước cây Lô hội làm mỹ phẩm. Còn chiết xuất ADN cây Lô hội hay giải trình tự gen đặc trưng làm chỉ thị phân tử hầu như chưa bắt gặp. Khó khăn này do nhiều nguồn khác nhau: thứ nhất là nguồn tài chính; thứ hai là nhu cầu; thứ ba và tầm nhìn của nhà nghiên cứu. Cả ba cản trở này phần nào đã tác động đến việc nghiên cứu chỉ thị phân tử của cây Lô hội. Đến nay, việc xác định sự đa dạng cây Lô hội về hình thái cho đến đa dạng di truyền, để đưa dược liệu này thành thuốc và thực phẩm chức năng trở thành yêu cầu tất yếu với các nhà Dược học. Sự phát triển vượt bậc của công nghệ DNA và giải trình tự gen từ cuối thế kỷ XX cho tới nay, trở thành công cụ chính xác và kịp thời, đã giúp xác định các loài cây cũng như cây làm dược liệu không còn khó khăn. Chỉ thị phân tử trở thành công cụ chính xác tuyệt đối trong phân loại thực vật, động vật. Nhiệm vụ của đề tài dựa trên các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định chính xác sự đa dạng cây Lô hội. Đưa chỉ thị này trở thành chỉ thị chính, xác định ngay mà không còn phải chờ đợi thời gian. Vì những lý do trên tôi thực hiện đề tài “Đánh giá sự đa hình di truyền của cây Lô hộ trồng ở một số tỉnh thành miền tây bằng chỉ thị hình thái, vi phẩu và giải trình tự đoạn gen ITS”. Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tử làm công cụ xác định dược liệu cây Lô hội. Để hoàn thành mục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây: Khái quát được những hiểu biết về cây Lô hội cho đến hiện nay. Sử dụng chỉ thị hình thái, đặc điểm vi phẫu, mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Lô hội xác định sự đa dạng hình thái cây Lô hội. Xây dựng được các đặc điểm dược liệu qua soi bột dược liệu cây Lô hội và vai trò dược liệu cây Lô hội. Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Lô hội, để thực hiện giải tự đoạn gen ITS của cây Lô hội làm chỉ thị phân tử, xác định sự đa dạng di truyền cây Lô hội. Chương 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 1.1.1. Trên thế giới Nha đam đã được dùng làm thuốc trị bệnh từ khi chưa có lịch sử y học. Sách thuốc cổ Ai Cập (3500 năm trước Tây lịch) đã chỉ dẫn cách dùng Nha đam để trị nhiễm trùng, các bệnh ngoài da và làm thuốc nhuận trường, trị táo bón… Nha đam đã được vẽ và mô tả trên các bản văn làm bằng đất sét tại Mesopotamia từ năm 1750 trước Tây lịch như một cây thuốc. Tên “Aloe’’ có thể phát xuất từ chữ Ả Rập “Alloeh’’ với ý nghĩa là một “chất đắng và óng ánh”. Nha đam là một cây thuốc, không thuộc loại ma túy, nhưng đã gây ra cả một cuộc chiến tranh: Khi Đại đế Alexander chinh phục Ai Cập vào năm 332 trước Tây lịch, ông đã nghe nói đến một cây thuốc có khả năng trị vết thương thần kỳ tại một hòn đảo tên là Socotra, ngoài khơi Somalia, và để lấy cây này về làm thuốc cho quân của mình, đồng thời ngăn chặn địch quân không cho họ chiếm được cây thuốc này, ông đã gửi hẳn một đoàn quân đi chiếm hòn đảo và cây này chính là Nha đam. Trên các văn tự cổ xưa và các bằng chứng trên vách đá đền đài, trong các sách vở y khoa của người Ba Tư cổ, người Ả Rập, La Mã, Ấn Độ, các bộ lạc ở Châu Phi, Châu Mỹ ... đã chứng minh cây nha đam được sử dụng để chữa bệnh tật, tăng cường sinh lực và làm đẹp da. Trên các vách đá của Kim Tự Tháp đã tìm thấy một số tư liệu, hình ảnh về việc Nữ Hoàng Ai Cập nổi tiếng là Merfertiti và Cleopatra đã sử dụng loài dược thảo này để chăm sóc và bảo vệ nhan sắc của mình. Vào khoảng 400 năm trước công nguyên, nhựa nha đam và lá nha đam khô đã được bán sang Châu Á. Vào khoảng 50 năm trước công nguyên, Clesins một thầy thuốc người Hy Lạp đã sử dụng nhựa Nha đam làm thuốc tẩy. Kể từ đó, Nha đam đã được giới y học quan tâm và dùng rộng rãi trong đông y lẫn tây y. Người Trung Quốc gọi Nha đam là Lô hội vì lô là đen, hội là tụ lại, kết lại. Lô hội có nghĩa là cây cho nhựa đen. Lô hội được sử dụng ở Trung Quốc vào khoảng thế kỷ từ 7 đến 8 đời Tùy Đường. Các thầy thuốc Trung Quốc đã dùng nha đam để chữa bệnh sốt cao, co giật ở trẻ em và họ còn dùng Nha đam làm thuốc tẩy xổ. Vào thế kỷ thứ 17, nha đam đã được người Tây Ban Nha xuất sang Châu Mĩ và ở đây là khu vực sản xuất chính cây Nha đam rồi xuất khẩu sang Châu Âu. Năm 1720, cây nha đam được Cart Von Linne mô tả và đặt tên Aloe Vera Linne, tên đó đã thành tên khoa học của Nha đam và được giới khoa học công nhận cho đến nay. Năm 1820, Nha đam chính thức được công nhận trong từ điển Mỹ với tên là Lô hội có tác dụng tẩy xổ và bảo vệ da. Cũng nên ghi nhận là tên của dược chất “Aloe” được ghi trong Phúc Âm Thánh Gioan (19: 39 40) dùng để ướp xác Chúa Jesus không phải từ Nha đam, nhưng từ một cây khác gọi là Aloewood. (Aloewood chính là cây Gió Bầu cung cấp hai hương liệu quý: Trầm hương và Kỳ nam). Dioscorides, y sĩ trứ danh người Hy Lạp, đã dùng Nha đam để trị vết thương ngoài da, bệnh trĩ, vết ung loét và cả rụng tóc. Pliny, y sĩ La Mã đã biết dùng Nha đam để trị táo bón. Các nhà buôn Ả Rập đã đem Nha đam từ Tây Ban Nha sang các nước Á đông trong khoảng thế kỷ thứ 6 và từ đó y học Ayuraveda của Ấn Độ biết dùng Nha đam để trị bệnh ngoài da, ký sinh trùng đường ruột và cả đau bụng khi có kinh. Ngày nay, các công trình nghiên cứu ngày càng nhiều. Đầu tiên là hai sáng chế được đăng ký ở Mỹ vào năm 1975: Sáng chế US3892853 – Stabilized aloe vera gel and preparation of same Ổn định chất gel trong Aloe vera và quá trình sản xuất của Cobble Henry H., tác giả đã nghiên cứu quá trình làm ổn định chất Gel từ lá để tìm cách bảo quản lâu bền hoạt tính chữa bệnh trong gel tươi. Sáng chế US3878197 – Process for preparing extracts of aloe vera Quá trình chiết xuất từ cây Lô hội của Maret Ray H, tác giả tìm hiểu quá trình trích và làm ổn định dịch nước từ lá cây Lô hội, chất gel được lấy bằng cách cắt bỏ vỏ và lớp aloin từ lá, được xử lý bằng tia cực tím ở nhiệt độ môi trường để sản phẩm trích ly ổn định về mặt hóa học và giữ được đặc tính như nước Lô hội tươi. Đến năm 1985, tác giả Tumlinson Larry N (US4555987) đã nghiên cứu thiết bị trích xuất chất gel tinh khiết từ cây Lô hội. Lá cây Lô hội sau khi thu hoạch được đặt giữa cặp dây cua roa chuyển động liên tục qua nhiều con lăn cán được sắp xếp theo khuôn mẫu định trước. Những con lăn cán này vừa nghiền vừa đẩy chất gel ra khỏi lá, sau đó được đưa vào lọc. Vỉ lọc được đặt nghiêng nhằm mục đích cho lá cây di chuyển từ từ qua nhằm hứng chất gel rơi xuống, sau đó lá cây này bị đẩy ra khỏi khu vực thu gom chất gel trước khi gel bị nhiễm bẩn bởi aloin từ lá. Trong những năm sau đó, từ những nghiên cứu cách thức để giữ ổn định chất gel được trích xuất từ cây Lô hội, các nhà khoa học đã từng bước nghiên cứu để sản xuất chất gel theo hướng công nghiệp hóa và tinh khiết hơn. Những năm tiếp theo, lượng sáng chế tăng lên đáng kể, năm 2002 với 38 sáng chế, 2003 với 40 sáng chế…. Trong giai đoạn này các nghiên cứu cũng khá đa dạng, các nhà khoa học của các nước (Mỹ, Nhật, …) tiếp tục nghiên cứu việc làm ổn định chất gel và ứng dụng tính mát, tính mềm mại của cây Lô Hội để sản xuất găng tay, giày dép,… Bên cạnh đó, cây Lô Hội còn được dung làm thức uống: nước ép, nước giải khát… Và cho đến nay, để thương mại hóa các sản phẩm của cây Lô Hội, các nhà nghiên cứu đã từng bước đi sâu vào phương thức tạo ra sản phẩm cho đời sống: Thức uống (sáng chế ES2298003), mỹ phẩm (WO2008051080), găng tay (US2004115250), thuốc trừ sâu (US2008125320) và thậm chí cả phương pháp trồng cây Lô Hội (WO2008007389) (http:cesti.gov.vn; http:www.khoahocphothong.com.vn). 1.1.2. Ở Việt Nam Ở nước ta, Lô Hội cũng đã được biết đến từ rất lâu nhưng chỉ làm cây cảnh và dùng để chữa một số bệnh thông thường ngoài da. Kỹ sư Lê Đình Chức đã nghiên cứu kỹ thuật trồng cây Lô Hội, nêu rõ quy trình từ chọn giống, làm đất, kỹ thuật trồng đến chăm sóc và phòng trừ sâu hại cho cây nhằm đạt được năng suất cao. Cây Lô Hội rất thích hợp trồng ở vùng có khí hậu nóng và không ngập nước, phát triển mạnh ở dạng đất cát và đất pha cát ven biển. Tuy nhiên, cũng có thể trồng Lô Hội trên các loại đất khác, nơi những cây trồng khác kém hiệu quả, như đất hơi kiềm, đất chua, đất sét. Cây đã được trồng nhiều ở Ninh Thuận và một số vùng đất Bình Dương như Tân An. Khi trồng cây Lô Hội, nông dân không phải đầu tư ban đầu cao, kỹ thuật chăm sóc đơn giản và trồng một lần có thể thu hái lâu dài, mang lại hiệu quả rất cao. Dù vậy, điều mà người nông dân lo lắng là khi diện tích trồng ngày càng được nhân rộng thì tìm đầu ra để tiêu thụ sản phẩm là rất khó và ước ao có một thị trường tiêu thụ toàn lá Lô Hội. Các nhà khoa học Việt Nam bước đầu đã nghiên cứu một số công nghệ, góp phần giải quyết những khó khăn cho người trồng. Một số kết quả có thể kể đến như: – Công nghệ sản xuất các chế phẩm thực dưỡng từ cây Nha đam (Lô Hội) Aloe vera, sản phẩm của Công ty TNHH Sức Khỏe Vàng, năm 2003. – Công nghệ và thiết bị sản xuất thực phẩm bảo kiện và dược phẩm, mỹ phẩm từ cây Nha đam (Lô Hội) Aloe vera Barbadensis, sản phẩm của Công ty TNHH Sức Khỏe Vàng, năm 2006. – Tác giả Nguyễn Phú Kiều cũng nghiên cứu ứng dụng dược tính của Lô Hội trong y học: Vegakiss dùng để điều trị HIVAIDS từ cây Trà hoa Dormoy và cây Lô Hội, năm 2006. – Dương Thị Bích (2019) đã nghiên cứu lên men gel Nha đam dùng làm chế phẩm chăm sóc da (Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactic có khả năng kháng vi sinh vật gây bội nhiễm mụn trứng cá do sử dụng sản phẩm chứa corticoid. Luận án Tiến sỹ. ĐH Cần Thơ). Với lợi thế về địa lý và khí hậu ở nước ta, chúng ta có thể phát triển vườn cây Lô Hội theo hướng công nghiệp, mặt khác cũng cần hỗ trợ các nhà khoa học trong các nghiên cứu tạo ra các máy móc thiết bị, các quy trình công nghệ để chiết xuất các chất có ích cho chế biến sản phẩm và xuất khẩu (http:cesti.gov.vn). 1.1.3. Nguồn gốc và phân bố Có nguồn gốc từ châu Phi. Theo truyền thuyết Ai Cập thì nữ hoàng Cleopatra đã sử dụng nha đam để tạo ra một làn da mịn màng, tươi tắn. Còn đại đế Hy Lạp Alexandros đã dùng nha đam để chữa vết thương cho binh lính của mình trong những cuộc viễn chinh. Những dòng chữ tượng hình và những hình vẽ còn lưu lại trên những bức tường ở những đền đài Ai Cập cho thấy cây nha đam đã được biết đến và sử dụng cách đây hơn 3000 năm. Cho đến tận ngày hôm nay con người đã chứng minh và khẳng định được vai trò của cây nha đam trong cuộc sống con người. Cụ thể hơn là trong lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm (https:voer.edu.vn; https:zicxa.com). Nhưng sau đó đã được đưa sang trồng tại châu Mỹ, nhất là vùng WestIndies và dọc bờ biển Venezuela. Trong thế kỷ 19, đa số Aloe xuất cảng sang châu Âu đều từ các đồn điền tại WestIndies thuộc địa của Hà Lan (tại các đảo Aruba và Barbados), qua hải cảng Curacao, nên được gọi là Curacao Aloe, Barbados Aloe… Các Aloe của châu Phi như Cape Aloe, Uganda Aloe, Natal Aloe… được gọi chung dưới tên thương mãi Zanzibar Aloe. Vào cuối thế kỷ 13 một du khách người Italia tên là Marco Polo (12541323) đã thực hiện một chuyến đi thám hiểm toàn châu Á. Đến Trung Quốc, Polo đã giới thiệu cho người dân bản xứ một dược thảo mà sau này người ta gọi là nha đam hay lô hội. Trong những năm gần đây, khi tái phát minh những dược tính quý giá của Nha đam thì Hoa Kỳ đã trồng khá nhiều Aloe vera tại Florida, Texas và Arizona do ở nhu cầu chất gel Aloe để làm mỹ phẩm tăng cao. Khoảng 10 năm trở lại đây thì phong trào trồng Nha đam để xuất khẩu lớn mạnh tại hai tỉnh mà cây phát triển tốt nhất nêu trên. Từ Trung Hoa cây nha đam được di chuyển sang Việt Nam. Trong khoảng 180 loài thì chỉ có 4 loài được sử dụng để làm thuốc. Hai loài được chú ý nhiều nhất là Aloe ferox Mill., 1768 và Aloe vera L., 1753 (đồng nghĩa Aloe barbadensis Mill., 1768). Việt Nam, đầu thế kỷ 20, người Pháp cũng đã đem Nha đam vào trồng ở nước ta, nhất là tại Phan Rang, Phan Thiết, Phan Rí thuộc các tỉnh Bình Thuận, Ninh Thuận. Chúng chịu hạn hán và khô nóng rất giỏi.Vì thế chúng được trồng rải rác khắp Việt Nam để làm thuốc hoặc làm cây cảnh. Trước hết người ta trồng để lấy nhựa Aloe xuất sang châu Âu. Cho đến sau thế giới chiến tranh lần thứ hai thì không xuất được nữa nên Aloe vera trở thành cây hoang dại tại Ninh Thuận và Bình Thuận. Khi tái phát minh những dược tính quý giá của Nha đam thì ngoài các vùng Ninh Thuận và Bình Thuận mà còn trồng khắp nơi (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn). 1.2. MỘT SỐ KHÁI NIỆM LIÊN QUAN 1.2.1. Khái niệm chỉ thị Để phân biệt các cá thể khác nhau của cùng một loài, người ta thường dùng chỉ thị di truyền. Chỉ thị đi truyền là một tính trạng hay một thuộc tính có thể đo đếm được và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Theo Paterson và cộng sự (Paterson và ctv, 1991b ), một tính trạng được coi là chỉ thị đi truyền nhất thiết phải bảo đảm hai tiêu chuẩn: Phải phản ánh được sự đa hình giữa bố và mẹ. Phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau. Các chỉ thị dị truyền có vai trò như thế nào đối với các nghiên cứu di truyền và chọn giống. Chỉ thị di truyền rất hữu ích trong việc nghiên cứu sự thừa kẻ những dấu hiệu đi truyền và sự biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là những chỉ thị liền quan đến tính trạng nông sinh học có lợi cho con người. Những chỉ thị này từ lâu đã là những công cụ có ích trong chương trình chọn giống (Retter và ctv, 1993). Dựa vào 2 tiêu chuẩn của chỉ thị di truyền, người ta phân loại chỉ thị di truyền thành: chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tư DNA. 1.2.2. Chỉ thị hình thái (morphological marker). Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị mang tính chất mô tả, có thể nhìn thấy hoặc đo đếm được, nhưng khả năng ứng dụng hạn chế. Mỗi chỉ thị hình thái thường được kiểm soát bởi một gen đơn lẻ (single gene), ví dụ như gen qui định màu vỏ hạt, hình dạng hạt... Chỉ thị hình thái thường dễ nhận biết và ở dạng trội lặn. Chúng thường được sử dụng trong quá trình chọn lọc. Tuy nhiên, chúng có số lượng tương đối ít và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của cá thể. Người ta đã sử dụng chỉ thị hình thái trong mô tả và đánh giá tài nguyên lúa từ những năm đầu của thế kỷ XX. Kato và ctv (1928) đã đề nghị phân chia lúa O. saiva thành hai loài phụ Japomica và Indica nhờ các đặc điểm hình thái. Các tác giả còn phân biệt thêm loài phụ nữa là Javanica. 1.2.3. Chỉ thị sinh hóa (biochemical marker). Chỉ thị sinh hóa là loại chỉ thị có bản chất protein, hầu hết các trường hợp là đa hình protein, bao gồm chỉ thị isozym và các loại protein dự trữ (storage proteins). Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đăng điện khác nhau. Chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường một chiều hay hai chiều, tạo ra những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện băng bằng phương pháp nhuộm. Do cơ chế phức tạp của sự đóng mở gen ở những giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển cá thể đã qui định sự thể hiện của các chỉ thị sinh hóa. Bất kỳ một protein nào có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai đoạn nào của sự phát triển cá thể, đều là sản phẩm của gen. Cơ chế này cũng được điều khiển bởi vật chất di truyền là DNA, thông qua dòng thông tin dị truyền từ DNA —> RNA => Protein. Chỉ thị protein và isozym thuộc loại đồng trội, có độ tin cậy cao. Đồng thời có thể phát hiện ra các biên dạng khác nhau của protein. Tuy nhiên, do có số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, không phản ánh chính xác bản chất di truyền của một tính trạng, nên các chỉ thị protein và isozym được ứng dụng tương đối hạn chế. 1.2.4. Các chỉ thị phân tử DNA (DNA markers). Chỉ thị phân tử DNA là những chỉ thị có bản chất đa hình DNA. Nó có thể là những dòng gen có sẵn hay dưới dạng những thông tin về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong các tệp dữ liệu của máy tính. Dựa vào đó người ta chia chi thị phân tử làm ba loại chính: Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA (chỉ thị RFLP); Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội DNA bằng PCR (RAPD.AFLP...); Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại (tiểu vệ tinh, vi vệ tinh...). 1.3. TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY LÔ HỘI ( NHA ĐAM ) 1.3.1. Chỉ thị hình thái cây Lô hội và phân loại Chỉ thị hình thái cây Lô hội Từ khái niệm chỉ thị hình thái, ta hiểu mỗi chỉ thị hình thái thường được kiểm soát bởi một gen đơn lẻ (single gene), ví dụ như gen qui định màu vỏ hạt, hình dạng hạt... Chỉ thị hình thái thường dễ nhận biết và ở dạng trội lặn. Chúng thường được sử dụng trong quá trình chọn lọc. Tuy nhiên, chúng có số lượng tương đối ít và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của cá thể. Tìm hiểu đặc điểm hình thái họ Lô hội qua các đại diện có ở Việt Nam. Phân tích so sánh các chi, căn cứ vào những đặc điểm như dạng sống, lá bắc, lá bắc con, vị trí cụm hoa, hoa, màu hoa, bộ nhị, bộ nhụy, quả… để chọn ra những đặc điểm dễ nhận dạng ngoài thiên nhiên. Phương pháp được sử dụng là phương pháp hình thái so sánh. Trong phương pháp này, người ta căn cứ chủ yếu vào các đặc điểm như dạng sống, vị trí cụm hoa, màu sắc, mùi vị. Đây là những đặc điểm ổn định ít phụ thuộc vào sự thay đổi của điều kiện sinh thái và dễ nhận biết ngoài thiên nhiên. Phân loại Tên khoa học: Aloe vera L Giới (regnum): Plantae Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae) Lớp: Thực vật một lá mầm (Monocots) Bộ (ordo): Asparagales Họ (familia): Asphodelaceae Chi (genus): Aloe Loài (species): A.vera Tên khác: Lưu hội, Nha đam, Lưỡi hổ, Hổ Thiệt, Long tu, Chân Lô hội, Dương Lô hội, Lô khoái, Nội hội, Nột hội, Quỷ Đan, Tượng hội, Tượng Đởm. Tuy nhiên, trong danh mục cây thuốc của Tổ chức y tế thế giới (WHO), Aloe được xem là tên chung của khá nhiều loài khác nhau như Aloe chinensis, A. elongata, A. indica… Ngoài ra, một loài Aloe khác, Aloe ferox cũng được chấp nhận là một cây cung cấp nhựa Aloe. Mỹ gọi cây Aloe vera dưới tên “Curacao Aloes”, còn Aloe ferox dưới tên “Cape Aloes”. Người Pháp gọi dưới những tên: Aloe de Curacao, Aloe du Cap. Đông y gọi là Lô hội. WHO cũng liệt kê tên gọi của Lô hội tại các nước với 78 danh xưng khác nhau… Tại nước ta, Aloe vera được gọi là Lô hội hoặc Nha đam, Lưỡi hổ. (http:www.khoahocphothong.com.vn). 1.3.2. Đặc điểm hình thái Đặc điểm thực vật Cây sống nhiều năm, thân có thể hóa gỗ, phần trên mang lá tập trung thành hình hoa thị. Lá hình mũi mác dày, mọng nước, có nhiều chất nhầy nên giữ nhiều nước làm cho cây thích ứng được nơi khô hạn. Khi ra hoa thì trục hoa nhô lên ở giữa bó lá, mang chùm hoa màu vàng hoặc đỏ. Aloe ferox Mill. có thân cao từ 2 – 5 m, lá mọc thành hoa thị dày, dài 15 50 cm, rộng 10 cm ở gốc, có gai ở mặt dưới lá và ở mép lá. Hoa màu đỏ. Loài này là loài chủ yếu có ở nam Phi, cho “lô hội xứ” Aloe vera L. (= vulgaris Lam.) Có thân ngắn: 30 – 50 cm. Lá chỉ có gai ở 2 mép. Hoa màu vàng. Cây nguồn gốc ở bắc Phi, di nhập vào Antille nhưng hiện nay chỉ trồng ở các đảo Aruba và Bonaire cho “Lô hội Barbade”. Ngoài hai loài trên ra người ta còn dùng A.perryi Bakercho “lô hội Socotrin”, A.candelabrum Bergercho “lô hội Natal” (Ngô Văn Thu và Trần Hùng, 2011; http:duoclieutot.blogspot.com). (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn) Cây Thuộc loại cây nhỏ, có khi không có thân, có khi gốc thân cao lên hóa thành gỗ, ngắn, to. Chiều cao trung bình từ 30 cm – 1 m (loài Aloe ferox Mill. cao từ 2 – 5 m), những cây lâu năm mới hiện rõ thân, cây nha đam không phân nhánh. Phần trên mang lá tập trung thành hình hoa thị (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn). Lá Lá dạng bẹ, không có cuống, đầu nhọn sắc. Lá mọc vòng rất sát nhau, màu từ lục nhạt đến lục đậm. Lá thường chia theo từng lớp phân bố từ gốc lên đến ngọn, tập trung thành hình hoa thị phía trên thân. Phiến lá dày bên trong có thịt màu xanh trơn nhớt. Lá hình mũi mác dày, mọng nước, hai mép lá có gai hình răng cưa thô như gai nhọn, cứng tùy theo loại.Mặt trên lõm có nhiều đốm trắng không đều. Lá dài tùy loài từ 30 60 cm, rộng 10 cm ở gốc, dày 1 – 1,5 cm. Tiết diện lá có hình ba cạnh, có nhiều chất nhầy nên giữ nhiều nước làm cho cây thích ứng được nơi khô hạn (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn). Hoa Khi ra hoa thì trục hoa nhô lên ở giữa bó lá, mang chùm cây Nha đam phát hoa ở nách, cuống hoa có thể dài đến 1m mang bên trên rất nhiều hoa mọc rũ xuống. Hoa nha đam gồm 6 cánh hoa mọc rũ xuống và 6 nhụy hoa thò ra ngoài. Có nhiều màu khác nhau như đỏ ,vàng... quả nha đam thuộc loại quả nang và có rất nhiều hạt (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn). Quả Quả nha đam thuộc loại quả nang hình trứng thuôn, lúc đầu màu xanh sau nâu và dai, có 3 ô, mỗi ô chứa rất nhiều hạt (Phạm Thiệp và cs, 2000). Hình 1. 7 Quả cây Lô hội (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn) Rễ Rễ cây Lô hội thuộc họ rễ chùm bao quanh bởi các tua rễ bám sâu vào đất (https:tuyensinh.vanlanguni.edu.vn). 1.3.3. Đặc điểm sinh thái Sống nơi có nhiều ánh sáng và sinh sản cây con rất nhanh. Cây sống nhiều năm, thân có thể hóa gỗ, phần trên mang lá tập trung thành hình hoa thị. Khi ra hoa thì trục hoa nhô lên ở giữa bó lá, mang chùm hoa màu vàng hoặc đỏ. Cây Nha đam rất dễ trồng nơi ráo nước, nhiều nắng nhưng cần tưới 2 3 ngày 1 lần. Trồng bằng chồi non phát xuất từ gốc. Có thể trồng trong chậu kiểng. Cây tuy thích ánh sáng mặt trời nhưng cũng chịu được bóng râm 50% và đất cằn cỗi. Aloe vera không phát triển được ở nơi có mùa đông dưới 60oC (https:zicxa.com). 1.4. CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1.4.1. Chiết xuất tinh sạch DNA Toàn bộ ADN của tế bào, bao gồm tất cả gen và những vùng liên gen được gọi là bộ gen. Bộ gen người chứa khoảng 80.000 gen, nhưng những vùng mã hóa của gen này chiếm khoảng 3% của toàn bộ gen. Bộ gen của nấm chứa khoảng 6.000 gen. Bộ gen của một vài thực vật có nhiều trình tự lặp lại. Bộ gen của prokaryote rất nhỏ được chứa trong nhiễm sắc thể có dạng vòng, prokaryote cũng có thể có những gen nằm trong plasmid. Bộ gen của prokaryote không có intron và những trình tự lặp lại. Muốn nghiên cứu về bộ gen, kỹ thuật tinh chiết ADN là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử đầu tiên vô cùng quan trọng góp phần cho sự thành công của những bước quan trọng tiếp theo. Hiện nay có nhiều phương pháp từ phức tạp, đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, đến các phương pháp đơn giản hơn, thời gian làm việc rút ngắn tùy theo mục đích sử dụng DNA, hay loại mô, đối tượng nào cần chiết suất DNA. 1.4.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: chủ thị RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphism đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) Chỉ thị này lần đầu tiên được biết đến khi Botstein sử dụng nó để lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và ctv, 1980). Từ những điểm cắt bởi enzym giới hạn trong DNA hệ gen, các đa hình RFLP được sinh ra. Nó gây ra sự khác nhau giữa các loại DNA. Điều đó là do những đột biến tự nhiên gây ra: đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể (lặp đoạn, mất đoạn,đảo đoạn, chuyển đoạn) hoặc đột biến gen (mất cặp, thêm cặp, thay cặp, đảo cặp nucleotid), tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. DNA của mỗi loài sinh vật đều chứa một hệ gen đặc trưng trong cấu trúc. Nguyên lý của kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cát giới hạn RFLP là sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử DNA của hệ gen. Từ đó người ta có thể nhận biết được những đoạn DNA có chiều dài khác nhau bảng kỹ thuật lai DNA với những mầu đồ (probe). Ở thực vật, RFLP lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu gen chịu trách nhiệm tổng hợp RNA ribosom trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì (Appels và Dvorak, 1982). Từ đó, việc sử dụng chỉ thị RFLP để lập bản đồ di truyền đã được ứng dụng đối với nhiều loại cây trồng khác như: Cà chua (Bernatzky và Tanksley, 1986), rau diếp (Landry và ctv, 1987), ngô (HelentJaris và ctv, 1986), cải bắp (Figdore và ctv, 1986), khoai tây (Gebhardt và ctv, 1989). Chỉ thị RELP được sử dụng trong lập bản đồ gen kháng đạo ôn (Hittalmani và ctv, 1994, gen kháng rầy nâu (Murata và ctv, 1998), và bản đồ QTLs cho tính trạng chất lượng và năng suất lúa (Lin và ctv, 1996). Để phân biệt được các cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể di hợp tử (Aa) người ta có thể sử dụng chỉ thị RELP (vì đây là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một lôcut gen). Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị RELP. Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm.Đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn DNA, nhưng số lượng đa hình thu được rất ít, thậm chí ở một số trường hợp khó nhận được đa hình. Mặc dù vậy, chỉ thị RFLP vẫn được sử dụng trong những trường hợp đặc trưng khi không có kỹ thuật nào khác thay thế được. Đặc biệt, nó thường được sử dụng trong các trường hợp cần kiểm chứng độ tin cậy của các chỉ thị khác. 1.4.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội DNA (Amplificationbased markers hoặc PCRbased markers) Phương pháp PCR phản ứng dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNApolymerase do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn. Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật. Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993. Ba chu kỳ đầu tiên của phản ứng được mô tả như hình vẽ. Từ hai sợi đơn DNA biến tính, sau 3 chu kỳ thu được 16 sợi đơn, trong đó, 8 sợi có kích thước đúng bằng khoảng cách giữa hai mồi oligo. Sau một số chu kỳ, số lượng DNA có kích thước duy nhất chiếm ưu thế tuyệt đối trong phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) là chuỗi phản ứng tổng hợp trong đó một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở một vùng bấy kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng đoạn đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA trong ống nghiệm nhờ enzyme DNA polymerase. Đặt biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA làm khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10‒3µg). Mỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ phản ứng có ba bước. Đầu tiên, AND khuôn được xử lý nhiệt độ để tách thành hai sợi đơn. Bước tiếp theo, nhiệt độ giảm xuống cho phép các mồi (số lượng rất lớn) liên kết tạo cặp bổ sung với hai sợi đơn DNA khuôn (do số lượng mồi lớn nên liên kết giữa mồi và DNA khuôn xảy ra chiếm ưu thế so với liên kết phục hồi giữa hai sợi đơn). Trong bước thứ ba, hỗn hợp DNA và mồi được ủ với enzyme Taq polymerase và bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Khi các chu kỳ được lặp lại, các đoạn DNA vừa được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thành khuôn mẫu cho chu kỳ sau. Số lượng phân tử DNA tạo ra tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Chỉ sau vài chu kỳ đầu, sản phẩm tạo ra chủ yếu là các đoạn DNA có kích thước không quá 60 và mỗi chu kỳ thường kéo dài khoảng 5 phút. 1.4.4. Giải trình tự gen (DNA) Giải trình tự gen được thực hiện để xác định trình tự nucleotide của một gen cụ thể. Nếu cả một hệ gen được giải trình tự, nó sẽ được gọi là Giải trình tự hệ gen. Ban đầu, giải trình tự gen được tiến hành bằng các phương pháp hóa học sử dụng các hóa chất độc hại như Pyridine; kỹ thuật này đã sớm bị ngưng lại vì bản chất độc hại của thí nghiệm. Hiện tại, giải trình tự gen hầu như được thực hiện bởi phương pháp giải trình tự Sanger — tận dụng cách phân tách trình tự bằng axit deoxyribonucleit. Phản ứng được tiến hành trong 4 ống nghiệm riêng biệt, trong mỗi ống nghiệm, đoạn mồi (đoạn DNA hoặc RNA ngắn có giá trị khởi đầu cho quá trình nhân đóng vai trò tối hậu nhằm xác định trình tự của một đoạn cắt cụ thể). Kỹ thuật giải trình tự Sanger tự động sử dụng thiết bị dò tìm để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang và truyền tải kết quả. 1.4.5. Những chuối lặp lại (Repeatitive sequences) Chuỗi lặp lại tuần tự (tandemly repeated sequences) được phân loại dựa theo số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi: gọi là DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh. Một số chuỗi lặp lại có thể được sử dụng như loại chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội DNA (ví dụ: vi vệ tinh). Tuy nhiên, do chúng là những chuỗi lặp lại có trật tự đầu đuôi trong một hệ gen, có cùng bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chúng vào một nhóm riêng. Chuỗi ADN vệ tinh (Satellite DNA Sequence) Sự lặp lại có trật tự với tần số cao, đó là những chuỗi DNA vệ tinh. Ở cơ thể sinh vật bậc cao, chúng được phân bố ở những vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thế, tạo nên những đám rối khoảng 100 megabase (Mb). Đơn vị lặp lại thay đổi từ vài cập nucleotid đến 100 cặp. Tâm động của nhiễm sắc thể người cấu tạo chủ yếu là từ hai dạng DNA vệ tinh: ADN vệ tinh α (α satellite) có cấu trúc lặp lại của 171 bp (Moyzis và ctv, 1989) và DNA vệ tinh β (β satellite) (Waye và Williard, 1989; Wiliard, 1990). Chuỗi DNA vệ tinh thường nằm trong những vùng dị nhiễm sắc, rất ít sử dụng trong lập bản đồ di truyền. Nhờ sự phát triển của phương pháp điện di trong điện trường xung (pulsed field gel electrophoresis = PFGE) mà DNA vệ tính đã được sử dụng thành công trong lập bản đồ những vùng khó tính như đầu mút nhiễm sắc thể của Khoai tây, lúa, lúa mì (Gana và ctv, 1992). Điểm mút NST (Telomere) Khi phân tích đầu mút của nhiễm sắc thể (Telomere) ở các cơ thể sinh vật bậc cao, ta thấy phần lớn chúng có cấu trúc bởi những chuỗi ngắn, giàu Guanine lặp lại. Chuỗi lập lại đầu mút có thể được sử dụng như những chỉ thị trong phân tích để lập bản đồ đầu mút trực tiếp (ở những loài có hệ gen nhỏ như ở nấm), (Farman và Leong, 1995). Khi sử dụng chuỗi lặp lại đầu mút như những mẫu dò, đòi hỏi kèm theo phương pháp điện di trường xung điện. Trong trường đó, có thể phân tích những mảnh DNA dài tới vài megabase (Roder và ctv, 1993). Những chuỗi liên quan đến đầu mút này (telomereassociated sequences: TAS) được sử dụng như là các mẫu dò trong phân tích RFLP khi lập bản đồ những đầu mút NST lúa mì (Kilian và Kleinhofs, 1992). Để việc lập bản đồ di truyền đầu mút được dễ dàng hơn, cần chú ý những thông tin về chuỗi đầu mút được ứng dụng để tách dòng những chuỗi phụ đầu mút liên quan đến đặc trưng vật lý của chuỗi đầu mút. Tiểu vệ tinh (Minisatellite) Những chuỗi lặp lại nhiều lần có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotid trở lên (thường vào khoảng 15bp) là loại tiểu vệ tinh, bao phủ một vùng từ 0,5 đến 30 kb. Tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng đồng nhiễm sắc (euchromatin region) của hệ gen và thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour và Jefferys, 1992). Để phát hiện đồng thời nhiều alen, có thể sử dụng những chuỗi lặp lại này như những mẫu dò. Cho nên, chúng cũng được gọi là những đoạn lặp lại có trật tự và có số lượng có thể thay đổi (Nakamura và ctv, 1987). Chúng là những chỉ thị tốt được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa hình DNA cũng như lập bản đồ di truyền (Jecffreys và cv, 1991; Pena và Charkraburty, 1994). Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Snmple Sequence Repeates = SSR) Chỉ thị vi vệ tinh là những đoạn DNA lập lại gồm những đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 nucleotid, theo kiểu lặp lại ngắn một cách có trật tự. Chỉ thị này đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga, 1982; Weber và ctv 1989). Hiện nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của rất nhiều sinh vật bậc cao khác như một số loài cây một lá mầm và hai lá mầm (Morgante và ctv, 1993; Wang và ctv, 1994): một số gia cầm, động vật có vú (Cheng và ctv, 1994; Love và ctv, 1990; Moran và ctv, 1993; Serikawa và ctv, 1992); cá (Estuop và ctv, 1993). Sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại, có thể sinh ra đa hình SSR. Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, đễ dàng phát hiện bằng PCR. Các chỉ thị SSR đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật (Bell và Ecker, 1994; Tautz và Renz, 1984). Ở người, SSR được xem là thẻ hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên các cây rừng nhiệt đới (Condit và Hubell, 1991), bắp cải (Lagercrantz và ctv, 1993), lúa mì (Roder và ctv, 1995), và 34 giống cây trồng khác (Morgante và Olivieri, 1993). Những kết quả nghiền cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật thì SSR mang trình tự lặp lại (AT)n, nhiều hơn, còn ở động vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n, hơn. Những nghiên cứu trên lúa (Wu và Tanksley, 1993), ngô (Senio và Heun, 1993) và Arabidopsis (Bell và Ecker, 1994) cũng cho kết quả tương tự. Trong các nghiên cứu thư viện hệ lúa, sau khi sàng lọc (screening) cho thấy có khoảng 5.70010.000 vi vệ tinh ở lúa (McCouch và ctv, 1997). Hạn chế lớn nhất của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém, đồng thời mỗi một lôcut riêng biệt chỉ đặc trưng bởi một loại mới. 1.5. DƯỢC CHẤT VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 1.5.1. Thành phần hóa học Các dẫn chất anthranoid Đây là thành phần có tác dụng của lô hội gồm: Chất nhựa trong suốt trong lá nha đam còn được gọi là Lô hội. Chất nhựa của nha đam khi cô đặc lại sẽ có màu đen (còn gọi là Aloès). Phân tích thành phần nhựa lấy từ lá nha đam, các nhà nghiên cứu tìm thấy các chất sau: Acid amin (gồm tối thiểu 23 loại), vitamin (B1, B2, B5, B6, B12, acid folic, C, A, E), khoáng tố vi lượng (Na, K, Ca, P, Cu, Fe, Zn, Mg, Mn, Cr). Aloe emodin, chất này không có trong dịch Lô hội tươi. Trong nhựa Lô hội aloe emodin chiếm khoảng 0,05 – 0,50%. Chất này tan trong ether, chlorofom, benzen và kết tinh hình kim vàng cam. Barbaloin, chiếm 15 – 30% là thành phần chính của nhựa lô hội, công thức được nghiên cứu và sửa đổi nhiều lần. Hiện nay công thức được xác định là 1,8dihydroxy3hydroxymethyl10bDglucopyranosyl anthron. Phần aglycon là anthron tương ứng của aloe emodin, phần đường là glucose nối với carbon số 10 theo dây nối C glycosid. Nó là bột kết tinh hình kim màu vàng chanh đến vàng xẫm, vị đắng, đen dần ngoài không khí và ánh sáng. Tan trong nước, cồn, aceton, ammoniac, hydroxyd kiềm, rất ít tan trong benzen, chloroform, ether. Barbaloin cũng như những loại C – glycosid khác, rất khó bị thủy phân bằng acid. Muốn thủy phân có hiệu suất cao thì phải thủy phân có kèm theo chất oxy hóa (như natri periodat hoặc sắt III chlorid). Barbaloin là một hỗn hợp 2 đồng phân S và R (do carbon bất đối ở C10). Aloin A là đồng phân 10S có năng suất quay cực phải. Aloin B là đồng phân 10R có năng suất quay cực trái. Bên cạnh hai chất trên còn có aloinosid B (= aloin 1” – O – a – L – rhamnopyranosid), cấu hình ở C 10 chưa xác định. Ngoài ra còn có một số anthranoid khác. Trong lô hội còn có aloenin, aloenin B là các dẫn chất phenyl pyran 2 on; aloesin, aloesol là các dẫn chất benzo pyran 4 on. Các Monosaccharid, Polysaccharid Cellulose, glucose, rhamnose, aldopentose, galactose, xylose, mannose, arabinose và acemannan, chính chất này có tác dụng kháng virút và giúp tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể. Prostaglandin và các acid béo chưa bão hoà Acíd gama linolenic. Nhóm chất này có tác dụng tiêu sưng, giải dị ứng và làm lành vết thương, mau lên da non. Các Enzym Là các men tiêu hoá giúp ăn ngon và làm thuốc bổ: oxydaza, Lipaza, Amilaza, Catalaza, Allnilaza v.v Nhóm anthraglycoside Anthraquinon Có khả năng chống oxy hoá tế bào, nhuận trường, giải độc, chống táo bón gồm Aloe Emodin (chất này không có trong dịch tươi nha đam). Trong nhựa khô, Aloe Emodin chiếm 0,05%0,5% chất này tan trong ete, cloroform, benzen. Barbaloin: Chiếm 1530% thành phần nhựa của nha đam. Chất này sẽ tan dần khi để ngoài không khí và ánh sáng. Tan trong nước, cồn, axeton, rất ít trong benzen và chloroform (https:www.phytopharma.vn; https:duoclieu.edu.vn). 1.5.2 Dược liệu Dược liệu: Khối nhựa có kích thước không đồng đều, màu nâu đen bóng, dễ vỡ vụn, chỗ vỡ óng ánh như thuỷ tinh. Mùi hơi khó chịu, vị đắng nồng (Dược điển Việt Nam V, 2018). Aloe vera là nguồn cung cấp hai dược liệu khác hẳn nhau. Dược liệu thứ nhất là một chất nhựa Aloe, ở ngay dưới lớp biểu bì hay “da” mỏng của lá có những tế bào đặc biệt gọi là tế bào trụ bì (là những tế bào gân màu lục ở mặt ngoài miếng gel khi ta gọt bỏ lớp vỏ màu lục phía ngoài), chứa một chất nước cốt màu vàng lục, sau khi chảy ra, tự cô đặc lại ở nhiệt độ bình thường, có màu vàng nâu, óng ánh và rất đắng, đông y cũng gọi là Nha đam (nhựa khô). Chất nước cốt tự khô này chứa các hoạt chất hydroanthron: gồm các chuyển hóa chất hydroanthracen, mà những chất quan trọng nhất là aloin A và B (từ 25 đến 40%). Hỗn hợp aloin A và B còn được gọi là Barbaloin; hydroxyaloin A và B (từ 3 đến 4%); một ít aloeemodin và chrysophanol. Các chuyển hóa chất Chromon gồm 8Cglycosyl chromon, còn gọi aloeisin (khoảng 30%) và các aloeresin A và B. Dược liệu thứ hai là một chất nhày gọi là gel Aloe. Chất gel này có thể lấy bằng cách gọt bỏ vỏ lá Nha đam màu lục rồi nghiền nát miếng gel trong suốt trong lá. Chất gel này chứa một loại polysaccharid gồm: pectin, hemicellulose, gluco mannan, acemannan và các chuyển hóa chất mannose. Trong Nha đam còn có thêm những chất khác như: enzym: bradykinase, các acid amin, lipid, sterol (lupeol, campesterol, betasitosterol), tanin, hợp chất hữu cơ loại magnesium lactat, một chất kháng – prostaglandin (http: www.khoahocphothong.com.vn) 1.5.3 Tác dụng dược lý Tác dụng đối với Vị trường: Aloin là chất tẩy xổ mạnh và mạnh hơn so với Đại hoàng. Aloin tác động trên kết trường. Lô hội dùng thụt Đại trường có tác dụng cũng như uống Tác dụng tẩy xổ: Aloin là chất tẩy xổ mạnh, tác dụng kích thích đại trường gây sốt thường kèm theo đau bụng, hố chậu sung huyết. Nghiêm trọng có thể gây viêm Thận. Tác dụng đối với tim mạch: Nước sắc Lô hội có tác dụng ức chế tim cô lập của ếch Nư

Định dạng
Số trang	82
Dung lượng	18,24 MB