ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY CỎ SƯỚT TRỒNG TẠI HÓC MÔN BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG ………..o0o……….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC MÃ : 772021 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIỀN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG HỌ VÀ TÊN: MSSV: LỚP: Cần Thơ, 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG ………..o0o……….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC MÃ : 772021 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIỀN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG HỌ VÀ TÊN: MSSV: LỚP: Cần Thơ, 2021 LỜI CẢM ƠN Sự thành đạt của mỗi con người đều có sự giúp đỡ của biết bao nhiêu người thân quen và đáng trân trọng. Để hoàn thành đề cương nghiên cứu khoa học như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến quý thầy, cô của trường Đại học Tây Đô. Đặc biệt em cảm ơn thầy TS. Thiều Văn Đường, người đã nhiệt tình hướng dẫn em hoàn thành bài đề cương nghiên cứu khoa học. Cùng với kiến thức học được trên lớp, việc tiếp cận công việc nghiên cứu là hết sức cần thiết đối với sinh viên ngành Dược.Tuy nhiên với thời gian ngắn, khả năng nghiên cứu và kinh nghiệm thực tế còn hạn hẹp, nhưng em cũng được mở rộng thêm những kiến thức và có thêm kinh nghiệm làm đề tài Tiểu luận, giúp vốn kiến thức của em ngày càng phong phú trong quá trình chăm sóc sức khỏe nhân dân và đó cũng là hành trang quý báo cho công việc của em sau này. Trong quá trình làm, do còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tế nên không tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nhất định. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình, đóng góp ý kiến quý báu của quý thầy cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, phục vụ tốt hơn trong công việc sau này. Một lần nữa em xin chúc quý thầy cô Trường Đại Tây Đô và thầy Thiều Văn Đường dồi dào sức khỏe và luôn thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực hiện Hoàng Đức Hiền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề cương “Xác định tên khoa học của cây cỏ sướt bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA” là của chúng tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của Ts. Thiều Văn Đường với các nội dung và phương pháp nghiên cứu hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và chịu mọi hình thức kỷ luật theo quy định cho lời cam đoan của mình. Sinh viên thực hiện Hoàng Đức Hiền TÓM TẮT TÍNH CẤP THIẾT Cây cỏ xước không đắt tiền, không quý hiếm, không khó tìm như sâm, nhung hay quy nhưng thảo dược này lại mang lại công dụng tuyệt vời cho sức khỏe chẳng kém gì các loại dược liệu quý hiếm đắt tiền. Toàn bộ phần từ thân, lá, hoa cho đến rễ của cây đều có thể được tận dụng làm thuốc. Thông thường người ta sẽ thu hoạch cây vào mùa hè, sau đó mang về rửa sạch rồi dùng làm thuốc. Theo Đông Y, cây cỏ xước có tính mát, vị chua, đắng. Vì vậy loại này rất có hiệu quả trong việc điều trị một số trứng bệnh về xương khớp, tăng huyết áp, xơ vữa động mạch. Ngoài ra còn bổ gan, mạnh gân cốt. Vì vậy, việc “Xác định tên khoa học của cây cỏ sướt bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA” là rất cần thiết nên chúng tôi thực hiện đề cương này để xác định chính xác tên khoa học cây cỏ sướt bằng chi thị hình thái, chỉ thị phân tử cũng như nêu ra một số vai trò của cây lá lốt trong chữa trị bệnh cho con người. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nghiên cứu lý thiết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu. Phương pháp phân loại thực vật để tìm hiểu cây lá lốt theo chỉ thị hình thái. Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng của cây cỏ sướt. Xác định những công bố về tác dụng của cây cỏ sướt đối với việc chữa trị một số bệnh và vai trò của cây với sức khỏe con người. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đề tài đã tổng hợp và trình bày tương đối đầy đủ tên khoa học của cây Cỏ Sướt đặc điểm hình thái, vai trò của cây cỏ sướt chữa trị một số bệnh thường gặp và vai trò dinh dưỡng của cây cỏ sướt trên đất nước Việt Nam. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ MỤC LỤC CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 3 1.1.1 Trên thế giới 3 1.1.2 Ở Việt Nam 3 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY CỎ SƯỚC. 3 1.2.1 Khái niệm về chỉ thị 4 1.2.2 Phân loại 5 1.2.3 Đặc điểm hình thái 5 1.2.4 Đặc điểm vi phẫu 7 1.2.5 Đặc điểm sinh thái 11 1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 12 1.3.1 Khái niệm 12 1.3.2 Chiết xuất và tin sạch DNA 12 1.3.3 Phương pháp PCR 13 1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) 13 1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY CỎ SƯỚT VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 13 1.4.1 Dược liệu 13 1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 14 1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay 16 1.4.4 Một số lưu ý khi sử dụng cây cỏ sướt 16 1.4.5 Một số chế phẩm sử dụng hôm nay 17 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 18 2.1.2 Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị 18 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái 18 2.2.2 Phương pháp chỉ thị phân tử 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 24 2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết 24 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tài liệu 24 2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 24 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 25 3.1.1 Thân. 25 3.1.2 Lá 25 3.1.3 Rễ 25 3.1.4 Hoa 25 3.1.5 Quả 25 3.1.6 Hạt 25 3.2 HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 25 3.2.1 Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 25 3.2.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 25 3.2.3 Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR 25 3.3 KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY CỎ SƯỚT 25 3.3.1 Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 25 3.3.2 Kết quả giải trình tự gen DNA 25 3.3.3 Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 25 3.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY CỎ SƯỚT 26 3.4.1 26 3.4.2 26 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 27 4.1 KẾT LUẬN. 27 4.1.1 Mẫu cây ……. được thu thập tại ………... ở vị trí: 27 4.1.2 Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây …… 27 4.1.3 Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây ….. và trình tự gen của cây này. 27 4.2 KIẾN NGHỊ 27 DANH MỤC HÌNH ẢNH HÌNH 1 1Hình ảnh cây cỏ sướt 4 HÌNH 1 2Cây cỏ sướt 5 HÌNH 1 3Lạ cây cỏ sướt 6 HÌNH 1 4 Hoa cây cỏ sướt 6 HÌNH 1 5Quả cây cỏ sướt 7 HÌNH 1 6 Vi phẩu thân cỏ sướt 9 HÌNH 1 7 Vi phẩu lá cây cỏ sướt 10 HÌNH 1 8 Vi phẩu rễ 11 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.2 1Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất 20 Bảng 2.2 2Thành phần và thứ tự phản ứng PCR 22 Bảng 2.2 3Chương trình cài đặt các bước 23 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT KÍ HIỆU VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ 1 DNA Deoxyribonucleic Acid 2 SEM Scanning Electron Microscope 3 PCR Polemerase Chain Reaction 4 SDS Sodium Monododecyl Sulfate 5 TE Dung Dịch Đệm Te Chứa Tris 6 EB Dung Dịch Thu Hồi DNA Elution Bufer 7 ITS Internal Transcribed Spacer 8 EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid MỞ ĐẦU Thế giới của thế kỷ XXI, hầu như các loài thực vật – đặc biệt các cây làm dược liệu – đã được nghiên cứu tương đối hoàn chỉnh. Xong sự khác biệt và tiến hóa của nguồn dược liệu này (trãi qua quá trình hình thành, sinh trưởng, phát triển hàng trăm năm) đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và xác định lại theo chỉ thị phân tử. Bên cạnh đó, một số loại cây được phát hiện khá sớm ở thời điểm khoa học chưa tiên tiến hay ở những địa điểm mà trình độ kỹ thuật không cao. Điều này rất dễ dẫn đến việc sai sót trong đánh giá tiềm năng chữa bệnh của một số cây. Một số cây khi phát hiện chỉ được nghiên cứu sơ bộ về mặt hình thái hay thậm chí là những mô tả mơ hồ về hình dáng bên ngoài cây. Chính điều này khiến một số cây đáng ra có thể có tiềm năng trở thành một vị thuốc quý, một dược liệu, lại chỉ được con người xem như một loài cỏ mọc hoang. Điển hình như cây Cỏ Sước (Achyranthes aspera) Về mặt dược liệu và tác dụng của Cỏ Sước: phá huyết, tiêu ứ. Cỏ sước sao khô có tác dụng mạnh gân xương, bổ can thận, thường dùng để chửa phong thấp, tê mỏi, ngã sưng đau và các chứng bệnh liên quan đến xương khớp. Nói đến cây Cỏ sước, sự hiểu biết và mô tả theo chỉ thị hình thái đã được trình bày từ xa xưa. Đến nay nghiên cứu DNA các cây dược liệu trở thành xu hướng chung trong nghiên cứu dược liệu. Mục đích việc xác định chính xác loài dược liệu là vô cùng cần thiết, vì khi xác định chính xác mới tìm kiếm và sử dụng tốt các sản phẩm của dược liệu. Cây Cỏ Sước dùng làm dược liệu từ xa xưa, nhưng để tránh nhầm lẫn và giả mạo khi trở thành dược liệu là việc làm hết sức quan trọng đối với ngành Dược. Để mô tả xác định chính xác ở góc độ khoa học thì nghiên cứu DNA là một công cụ đắc lực và trở thành xu hướng nên việc chiết xuất DNA cây Cỏ Sước hay giải trình tự gen đặc trưng làm chỉ thị phân tử hầu như chưa bắt gặp. Khó khăn này do nhiều nguồn khác nhau: thứ nhất là nguồn tài chính; thứ hai là nhu cầu; thứ ba và tầm nhìn của nhà nghiên cứu. Cả ba cản trở này phần nào đã tác động đến việc nghiên cứu chỉ thị phân tử của cây Cỏ Sước. Đến nay, việc tìm hiểu đầy đủ về cây Cỏ Sước để đưa loại cây này thành thuốc và thực phẩm chức năng trở thành yêu cầu tất yếu với các nhà Dược học. Sự phát triển vượt bậc của công nghệ DNA và giải trình tự gen từ cuối thế kỷ XX cho tới nay, trở thành công cụ chính xác và kịp thời đã giúp xác định các loài cây cũng như cây làm dược liệu không còn khó khăn. Chỉ thị phân tử trở thành công cụ chính xác tuyệt đối trong phân loại thực vật, động vật. Nhiệm vụ của chúng tôi dựa trên các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định chính xác cây Cỏ Sước. Đưa chỉ thị này trở thành chỉ thị chính xác định ngay mà không còn phải chờ đợi thời gian. Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định tên khoa học của cây Cỏ Sước trồng tại Hóc Môn bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA”. Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tử làm công cụ xác định tiềm năng trở thành dược liệu của cây Cỏ Sước. Để hoàn thành mục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây: Khái quát được những hiểu biết về cây Phước lộc thọ cho đến hiện nay. Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Cỏ Sước. Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Cỏ Sước. Giải trình được trình tự gen ITS của cây Cỏ Sước làm chỉ thị phân tử. TỔNG QUAN TÀI LIỆU LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN Trên thế giới A. aspera đã được sử dụng trong y học dân gian ở các nước bao gồm Úc, Ấn Độ, và Kenya. Cuốn sách The Useful Native Plants of Australia năm 1889 ghi lại rằng loài cây này được tìm thấy ở tất cả các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới cũ. Loại thảo mộc này được sử dụng ở Ấn Độ trong các trường hợp cổ chướng . Hạt được cho trong bệnh kỵ nước, và ở trường hợp bị rắn cắn, cũng như bệnh mắt và ngoài da, hoa hòe, xát với ít đường, làm thành thuốc, đắp cho người bị chó điên cắn. Lá, lấy tươi, giã nhỏ. , được coi là một phương thuốc tốt khi bôi bên ngoài lên vết cắn của bọ cạp . Tro của cây mang lại một lượng kali đáng kể, được sử dụng để giặt quần áo. Ở Ấn Độ, cành hoa nổi tiếng là một biện pháp bảo vệ chống lại bọ cạp, loài được cho là có thể làm tê liệt. (Drury.) Trong Uttar Pradesh , nhà máy được sử dụng như một loại thuốc thảo dược , đặc biệt là trong sản khoa và phụ khoa , với ý định điều trị phá thai , khởi phát chuyển dạ , và chảy máu sau sinh . Người Maasai của Kenya sử dụng cây thuốc để làm dịu các triệu chứng của bệnh sốt rét . Ở Việt Nam Ở Việt Nam, cỏ xước mọc hoang nhiều ở ven sông, sườn đồi, các vùng đất bỏ hoang, hai bên đường. Đặc biệt là các vùng có khí hậu thuận lợi như Điện Biên, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu hay các tỉnh ở vùng Đồng Bằng Bắc Bộ. Theo thời gian, ngày càng nhiều tác dụng của loại thảo dược được khám phá. Vì vậy, nhiều địa phương đã quy hoạch để trồng thành khu vực nhất định và sản xuất thành dược liệu, sử dụng trong các bài thuốc nam. Thông thường, cây cỏ xước sẽ được thu hoạch vào mùa hè. Khi thu hoạch, thầy thuốc thường phân loại cành lá riêng, rễ riêng để tiện trong công việc bốc thuốc chữa bệnh. TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY CỎ SƯỚC. HÌNH 1 1Hình ảnh cây cỏ sướt Khái niệm về chỉ thị Để phân biệt các cá thể khác nhau của cùng một loài, người ta thường dùng chỉ thị di truyền. Chỉ thị đi truyền là một tính trạng hay một thuộc tính có thể đo đếm được và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Theo Paterson và cộng sự (Paterson và cs, 1991b ), một tính trạng được coi là chỉ thị đi truyền nhất thiết phải bảo đảm hai tiêu chuẩn Phải phản ánh được sự đa hình giữa bố và mẹ. Phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau. Các chỉ thị di truyền có vai trò như thế nào đối với các nghiên cứu di truyền và chọn giống? Chỉ thị di truyền rất hữu ích trong việc nghiên cứu sự thừa kế những dấu hiệu di truyền và sự biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là những chỉ thị liên quan đến tính trạng sinh học có lợi cho con người. Những chỉ thị này từ l u đã là những công cụ có ích trong chương trình chọn giống ( etter và ctv, 1993). Dựa vào 2 tiêu chuẩn của chỉ thị di truyền, người ta ph n loại chỉ thị di truyền thành chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tử DNA. Chỉ thị hình thái (morphological marker) Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị mang tính chất mô tả, có thể nhìn thấy hoặc đo đếm được, nhưng khả năng ứng dụng hạn chế. Mỗi chỉ thị hình thái thường được kiểm soát bởi một gen đơn lẻ (single gene), ví dụ như gen qui định màu vỏ hạt, hình dạng hạt... Chỉ thị hình thái thường d nhận biết và ở dạng trộilặn. Chúng thường được sử dụng trong quá trình chọn lọc. Tuy nhiên, chúng có số lượng tương đối ít và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của cá thể. Người ta đã sử dụng chỉ thị hình thái trong mô tả và đánh giá tài nguyên lúa từ những năm đầu của thế kỷ . Kato và ctv (1928) đã đề nghị ph n chia lúa O. saiva thành hai loài phụ Japomica và Indica nhờ các đặc điểm hình thái. Các tác giả còn ph n biệt thêm loài phụ nữa là Javanica. Chỉ thị sinh hóa (biochemical marker) Chỉ thị sinh hóa là loại chỉ thị có bản chất protein, hầu hết các trường hợp là đa hình protein, bao gồm chỉ thị isozym và các loại protein dự trữ (storage proteins). Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đăng điện khác nhau. Chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường một chiều hay hai chiều, tạo ra những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện băng bằng phương pháp nhuộm. Do cơ chế phức tạp của sự đóng mở gen ở những giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển cá thể đã qui định sự thể hiện của các chỉ thị sinh hóa. Bất k một protein nào có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai đoạn nào của sự phát triển cá thể, đều là sản phẩm của gen. Cơ chế này cũng được điều khiển bởi vật chất di truyền là DNA, thông qua dòng thông tin dị truyền từ DNA —>RNA => Protein. Chỉ thị protein và isozym thuộc loại đồng trội, có độ tin cậy cao. Đồng thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein. Tuy nhiên, do có số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, không phản ánh chính xác bản chất đi truyền của một tính trạng, nên các chỉ thị protein và isozym được ứng dụng tương đối hạn chế. Phân loại Theo như mô tả của Ts Trương Thị Đẹp, cây Cỏ Sước thuộc họ Dền (Amaranthaceae) chi Ngưu tất (Achyranthes) loài A. aspera (TS Trương Thị Đẹp, 2007) Đặc điểm hình thái Thân Thân thảo nhưng hóa gỗ ở dưới, mọc thẳng, phân nhánh, hình trụ, rắn chắc, có góc cạnh, có lông, có vân dọc, các đốt và lóng nổi rõ, ở các đốt có màu xanh lục nhưng tím hoặc hồng. HÌNH 1 2Cây cỏ sướt Lá Ramal và cauline, đơn giản, exstipulate, decussate đối diện, nhỏ lá, hình trứng hoặc hình trứng, toàn bộ, cấp tính hoặc nhiều lông, toàn bộ lông, lưới đơn. HÌNH 1 3Lạ cây cỏ sướt Rễ cây Mặt cắt ngang hình tròn, vùng vỏ chiếm 15 diện tích vi phẫu, vùng trung trụ 45. Hoa Lá bắc, lá bắc con, lá bắc con hai, ngắn hơn bao hoa, khô, có màng và dai, không cuống, hoàn, lưỡng tính, đơn tính, ngũ hoa, lưỡng tính, nhỏ, có gai, màu xanh lục. HÌNH 1 4 Hoa cây cỏ sướt Quả Khô, được bao bởi đài còn lại, quả hộp. HÌNH 1 5Quả cây cỏ sướt Hạt Hạt thường dẹp và bóng, mầm cong hình móng ngựa bao quanh nội nhũ bột. Nội nhũ có phôi cong, dài 2 mm, hình thuôn dài màu đen. Hoa thức. Đặc điểm vi phẫu Thân Mặt cắt ngang thân non và thân trưởng thành có hình vuông, có nhiều góc lồi, rõ ở thân non, ít rõ ở thân trưởng thành, vùng vỏ chiếm 110 diện tích vi phẫu, vùng trung trụ chiếm 910. Mặt cắt ngang thân già gần như tròn. Vùng vỏ: Biểu bì 1 lớp tế bào to, hình chữ nhật, hình vuông hay hình đa giác; lớp cutin dày. Lông che chở đa bào xếp trên một hàng dọc, kéo dài từ 13 tế bào biểu bì, nhiều ở thân non, ít dần khi thân già, có 2 dạng: (1) dạng lông dài nhiều, thẳng, đầu nhọn, có 2 phần: chân lông thường phình to, cấu tạo bởi 12 tế bào to, vách dày, mặt ngoài nhẵn; thân lông gồm 24 tế bào, không đều, 12 tế bào dưới vách mỏng, mặt ngoài thường nhẵn ít khi có vài mụn nhỏ rải rác, 12 tế bào trên cùng dài đến rất dài, vách dày, mặt ngoài phủ đầy mụn cóc; (2) lông ngắn ít hơn, thường cong quẹo, đầu tù, gồm 47 tế bào không đều, vách mỏng, mặt ngoài nhẵn. Mô dày 710 lớp tế bào hình đa giác, vách dày nhiều ở góc, sắp xếp lộn xộn, tạo thành vòng không liên tục, thường tập trung ở những góc lồi của thân. Mô mềm vỏ có 2 loại: (1) phần mô mềm xen giữa những cụm mô dày gồm 45 lớp tế bào nhỏ, hình tròn, chứa nhiều lục lạp, xếp chừa những khuyết nhỏ; (2) vùng mô mềm còn lại dưới mô dày 24 lớp tế bào to, hình bầu dục dẹt, xếp chừa những đạo. Tinh thể calci oxalat kết dính thành hình cầu gai hay rời rạc thành một khối vụn trong nhiều tế bào mô mềm, thường tập trung ở vùng ngay dưới mô dày. Vùng trung trụ: Cụm sợi mô cứng to nhỏ không đều, xếp rải rác trên một vòng, tế bào hình đa giác, không đều, vách dày đến rất dày. Vòng mô dẫn có cấu tạo thay đổi ở thân non và thân trưởng thành. Ở thân non vòng mô dẫn không liên tục, libe và gỗ họp thành từng bó rời, kích thước không đều, dưới những góc lồi của thân, xen kẽ với những khoảng mô mềm (khoảng gian bó); cụm sợi mô cứng ngay trên đầu mỗi bó libe gỗ. Bó libe gỗ gồm: libe thành từng cụm trên đầu bó gỗ; libe cấp 1 ở trên; libe cấp 2 ở dưới, vài lớp tế bào gần tầng sinh libe gỗ có hình chữ nhật rõ, xếp thành dãy xuyên tâm; tầng sinh libe gỗ là một vòng liên tục ở giữa libe cấp 2 và gỗ cấp 2; gỗ cấp 2 với những mạch gỗ không đều, xếp không thứ tự, mô mềm gỗ cấp 2 tế bào hình chữ nhật hay đa giác, vách hóa gỗ dày hay mỏng, xếp khít nhau; gỗ cấp 1 gồm các mạch gỗ rời nhau, không đều, phân hóa ly tâm, mô mềm gỗ tế bào hình đa giác, vách cellulose. Khoảng gian bó nhiều dãy tế bào hình chữ nhật xếp thành dãy xuyên tâm, phía trên tầng sinh libe gỗ là vùng mô mềm tế bào có vách cellulose, phía dưới là vùng mô mềm tế bào có vách hóa gỗ. Tia tủy hẹp, 12 dãy tế bào. Ở thân trưởng thành vòng mô dẫn có cấu tạo bất thường do sự xuất hiện, tuần tự từ trong ra ngoài, các tầng sinh libe gỗ phụ phía ngoài vòng libe gỗ chính. Gỗ thặng dư lúc đầu là từng bó không đều, rời, nhưng khi thân già là một vòng liên tục; mạch gỗ kích thước không đều, thường xếp thành từng dãy 25 mạch; mô mềm gỗ tế bào hình đa giác, vách tẩm chất gỗ dày hay mỏng, xếp khít nhau thành dãy xuyên tâm. Libe thặng dư bao phía ngoài vòng gỗ, lúc đầu là từng cụm nhỏ, tiếp sau là từng đoạn dài ngắn khác nhau xếp thành vòng uốn lượn ở trong vòng gỗ, cuối cùng là vòng liên tục ở thân già. Mô mềm tủy tế bào hình tròn hay hình đa giác, xếp chừa những đạo. Bó vết lá 2, ở giữa mô mềm tủy, xếp đối diện nhau, cấu tạo cấp 2 ít phát triển, có nhiều dạng: 2 bó có thể rời, mỗi bó gồm libe ở ngoài gỗ ở trong hay gỗ bao libe; 2 bó cũng có thể dính ở libe thành một. Tinh thể calci oxalat kết dính thành hình cầu gai hay rời rạc thành một khối vụn trong nhiều tế bào mô mềm tủy. HÌNH 1 6 Vi phẩu thân cỏ sướt Lá Gân giữa: mặt trên lồi thành hình chữ nhật, hơi lõm ở giữa, mặt dưới lồi tròn. Biểu bì tế bào hình bầu dục, biểu bì trên thẳng, biểu bì dưới uốn lượn tạo thành những góc lồi nhỏ; lớp cutin dày. Lông che chở nhiều, cấu tạo tương tự ở thân. Mô dày trên là cung liên tục, 46 lớp tế bào hình đa giác, vách dày rõ ở góc. Mô mềm có 2 loại: (1) phần mô mềm xen giữa những cụm mô dày gồm 34 lớp tế bào nhỏ, hình tròn, chứa nhiều lục lạp, xếp chừa những khuyết nhỏ; (2) vùng mô mềm còn lại tế bào hình tròn hay hình đa giác, xếp lộn xộn và chừa những đạo. Bó libe gỗ ở giữa, 47 bó kích thước không đều xếp thành vòng; những bó hướng xuống biểu bì dưới to, libe bao ở dưới, gỗ ở trên, có thể có cụm mô dày bao dưới libe; những bó hướng lên biểu bì trên nhỏ hơn, libe bao ở trên, gỗ ở dưới, cũng có thể có cụm mô dày bao trên libe; libe tế bào nhỏ, hình đa giác, thường méo mó, xếp không thứ tự; gỗ với nhiều mạch gỗ hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn, mô mềm gỗ tế bào hình bầu dục hay đa giác, vách cellulose, xếp thành dãy. Mô dày dưới 35 lớp tế bào hình đa giác, vách dày rõ ở góc, tạo thành cung liên tục hay gián đoạn ở những chỗ lõm của biểu bì. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai hay rời rạc thành khối vụn trong tế bào mô mềm. Phiến lá: Biểu bì tế bào hình chữ nhật hay hình vuông, không đều; biểu bì trên tế bào to, vách dày; biểu bì dưới tế bào nhỏ hơn, có khi méo mó hay dẹt lại, vách mỏng, nhiều lỗ khí; lớp cutin mỏng ở cả hai lớp biểu bì. Lông che chở tương tự ở thân. Mô mềm giậu 34 lớp tế bào hình chữ nhật ngắn, các lớp dưới tế bào có thể hình gần tròn, xếp khít nhau hay có những đạo ở góc. Mô mềm khuyết tế bào to, không đều, hình gần tròn, xếp chừa khuyết nhỏ. Bó libe gỗ của gân phụ rải rác, được bao quanh bởi một vòng tế bào mô mềm, gồm vài mạch gỗ nhỏ ở trên, libe ở dưới. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai thường trong lớp tế bào ranh giới giữa mô mềm giậu và mô mềm khuyết. Cuống lá: mặt trên lõm sâu như hình chữ U, mặt dưới lồi thành 3 góc nhọn. Biểu bì tế bào hình vuông, biểu bì trên thẳng, biểu bì dưới uốn lượn tạo thành những góc lồi nhỏ; lớp cutin dày. Lông che chở nhiều, cấu tạo tương tự ở thân. Mô dày thường là vòng liên tục, ít khi gián đoạn một vài nơi, 24 lớp tế bào hình đa giác, vách dày rõ ở góc. Mô mềm tế bào hình tròn hay hình đa giác, xếp lộn xộn và chừa những đạo. Bó libe gỗ 57 bó kích thước không đều xếp thành hình cung, cấu tạo tương tự như các bó ở gân giữa. Tinh thể calci oxalat kết dính thành hình cầu gai hay rời rạc thành một khối vụn trong nhiều tế bào mô mềm. HÌNH 1 7 Vi phẩu lá cây cỏ sướt Rễ Mặt cắt ngang hình tròn, vùng vỏ chiếm 15 diện tích vi phẫu, vùng trung trụ 45. Vùng vỏ: Bần thường 24 lớp tế bào hình chữ nhật dẹt, vách mỏng, xếp thành dãy xuyên tâm; lớp ngoài thường bị bong rách. Nhu bì 12 lớp tế bào hình chữ nhật rất dẹt, vách cellulose. Mô mềm vỏ 68 lớp tế bào hình bầu dục dẹt, xếp lộn xộn, chừa những đạo hay khuyết nhỏ. Vùng trung trụ: Thường 34 vòng libe gỗ. Vòng libe gỗ chính ở vùng tâm vi phẫu, bị tia tủy chia thành 23 nhánh hình quạt, ít khi nhiều hơn; mỗi nhánh gồm libe ở trên, gỗ ở dưới; libe cấp 1 thành những cụm nhỏ, tế bào nhỏ, hình đa giác méo mó; libe cấp 2 nhiều lớp tế bào hình chữ nhật dẹt, xếp thành dãy xuyên tâm; tầng sinh libe gỗ ở giữa libe cấp 2 và gỗ cấp 2; gỗ cấp 2 gồm nhiều mạch to, kích thước không đều, sắp xếp lộn xộn, mô mềm gỗ tế bào hình chữ nhật hay hình đa giác, vách tẩm chất gỗ mỏng hay dày, xếp thành dãy xuyên tâm; gỗ cấp 1 gồm 23 bó ngay tâm vi phẫu, dưới chân tia tủy, mỗi bó gồm 34 mạch nhỏ, không đều, phân hóa hướng tâm; tia tủy từ tâm vi phẫu, xuyên qua vùng gỗ và loe rộng ở vùng libe, tế bào hình chữ nhật hay đa giác kéo dài, vách cellulose, xếp thành dãy xuyên tâm, thường chừa những đạo nhỏ ở góc các tế bào. Vòng libe gỗ thặng dư xuất hiện phía ngoài vòng libe gỗ chính, tuần tự từ trong ra ngoài, số vòng tăng dần theo độ già của rễ, là một vòng đều đặn hay uốn lượn không đều; libe gỗ thặng dư họp thành bó, kích thước không đều. Tinh thể calci oxalat hình khối nhỏ trong tế bào mô mềm. HÌNH 1 8 Vi phẩu rễ Đặc điểm sinh thái Cỏ xước là một loài liên nhiệt đới, phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam. Ở nước ta cũng gặp khá phổ biến. Cây mọc trên bãi cỏ, nương rẫy cũ, quanh làng bản, ven đường đi, bờ bụi, nơi có ánh sáng và đất tốt, tới độ cao 1500 m. Cây ra hoa vào mùa hè và mùa thu. CHỈ THỊ PHÂN TỬ Khái niệm Nói chung thì chỉ thị (marker) là một dấu hiệu, một đặc trưng có thể nhận biết được giúp chúng ta phân biệt thứ này với thứ khác. Ví dụ, khi muốn phân biệt giữa lúa tẻ và lúa nếp chúng ta có thể quan sát hình thái của hạt; hạt lúa nếp thường tròn hơn hạt lúa tẻ. Khi đó, hình dạng hạt là một loại chỉ thị, gọi là chỉ thị hình thái (morphological marker). Tương tự, chỉ thị phân tử (molecular marker) hay chỉ thị di truyền (genetic marker) cũng là các dấu hiệu, hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể. Điểm khác biệt là những chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài mà là dựa trên sự khác biệt về trình tự gene của mỗi sinh vật. Chỉ thị phân tử thường là các đoạn DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể, và đoạn DNA này liên kết chặt với tính trạng đang khảo sát. Liên kết chặt có nghĩa là trong quá trình sinh sản, chỉ thị phân tử đó luôn được di truyền kèm với tính trạng đang khảo sát cho thế hệ con. Ví dụ: Giả sử ta cần chọn giống lúa kháng bệnh XYZ. Hiện tại, ta đã thu thập được 2 dòng lúa thuần L1 và L2 phục vụ cho việc lai tạo. Dòng L1 có năng suất cao, chất lượng gạo ngon nhưng lại dễ nhiễm bệnh. Dòng L2, có năng suất khá, chất lượng trung bình nhưng có khả năng kháng bệnh XYZ. Hi vọng là bằng cách lai tạo giữa L1 và L2 ta có thể thu được dòng F1 có năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh tốt. Nếu việc này được thực hiện bằng phương pháp chọn giống truyền thống thì sẽ mất rất nhiều thời gian. Đó là do sau mỗi lần lai tạo ta lại phải trồng con lai, đợi chúng trưởng thành và sau đó đánh giá từng tính trạng một. Như trong trường hợp này là phải đánh giá khả năng kháng bệnh, năng suất và chất lượng gạo. Nếu bằng cách nào đó chúng ta phát hiện được các chỉ thị phân tử (đoạn DNA) luôn xuất hiện kèm với (1) đặc điểm năng suất cao, (2) chất lượng tốt, và (3) kháng bệnh thì ta có thể sàng lọc bố mẹ hoặc con lai mong muốn ngay từ rất sớm dựa trên việc xác định những đoạn DNA này. Chỉ cần tách chiết DNA tổng số và tiến hành thêm vài bước phân tích nữa là được. Chiết xuất và tin sạch DNA Toàn bộ ADN của tế bào, bao gồm tất cả gen và những vùng liên gen được gọi là bộ gen. Bộ gen người chứa khoảng 80.000 gen, nhưng những vùng mã hóa của gen này chiếm khoảng 3% của toàn bộ gen. Bộ gen của nấm chứa khoảng 6.000 gen. Bộ gen của một vài thực vật có nhiều trình tự lặp lại. Bộ gen của prokaryote rất nhỏ được chứa trong nhiễm sắc thể có dạng vòng, prokaryote cũng có thể có những gen nằm trong plasmid. Bộ gen của prokaryote không có intron và những trình tự lặp lại. Muốn nghiên cứu về bộ gen, kỹ thuật tinh chiết ADN là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử đầu tiên vô cùng quan trọng góp phần cho sự thành công của những bước quan trọng tiếp theo. Hiện nay có nhiều phương pháp từ phức tạp, đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, đến các phương pháp đơn giản hơn, thời gian làm việc rút ngắn tùy theo mục đích sử dụng ADN, hay loại mô, đối tượng nào cần chiết suất ADN. Phương pháp PCR Phương pháp PCR phản ứng dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNApolymerase do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn. Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật. Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993. Giải trình tự gen (DNA) Giải trình tự gen được thực hiện để xác định trình tự nucleotide của một gen cụ thể. Nếu cả một hệ gen được giải trình tự, nó sẽ được gọi là Giải trình tự hệ gen. Ban đầu, giải trình tự gen được tiến hành bằng các phương pháp hóa học sử dụng các hóa chất độc hại như Pyridine; kỹ thuật này đã sớm bị ngưng lại vì bản chất độc hại của thí nghiệm. Hiện tại, giải trình tự gen hầu như được thực hiện bởi phương pháp giải trình tự Sanger — tận dụng cách phân tách trình tự bằng axit deoxyribonucleit. Phản ứng được tiến hành trong 4 ống nghiệm riêng biệt, trong mỗi ống nghiệm, đoạn mồi (đoạn DNA hoặc RNA ngắn có giá trị khởi đầu cho quá trình nhân đóng vai trò tối hậu nhằm xác định trình tự của một đoạn cắt cụ thể. Kỹ thuật giải trình tự Sanger tự động sử dụng thiết bị dò tìm để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang và truyền tải kết quả. VAI TRÒ CỦA CÂY CỎ SƯỚT VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI Dược liệu Cách thu hái Cây cỏ xước được thu hoạch quanh năm. Cả cây được đem về rửa sạch, cắt riêng phần rễ, thân , lá, thái mỏng rồi đem phơi hoặc sấy khô. Trường hợp chỉ thu hoạch rễ, vụ thu hoạch chủ yếu là vào mùa đông. Lúc này thân và lá đang héo khô và rễ đã phình to. Rễ cây được đào lên, cắt bỏ rễ nhỏ. Phơi rễ cho đến khi vỏ ngoài nhăn lại rồi hun khói vài lần với lưu huỳnh. Cuối cùng, cắt bỏ phần đầu nhọn của rễ, thái lát mỏng, phơi khô. Cách bảo quản Dược liệu khô cần được để nơi khô ráo. Tránh để gần nguồn nước sinh hoạt trong nhà hoặc ở môi trường ẩm ướt. Chế biến Rửa sạch, để ráo nước. Sau đó cắt ngắn khoảng 2cm phơi trong râm cho khô hoàn toàn. Một số bài thuốc cổ truyền Theo Đông y Chữa bầm máu, máu ứ bên trong do té ngã, nhức mỏi tay chân khi đi xa về Lấy 100g cỏ xước ngâm chung với 30g sâm đại hành, 50g dứa dại và rượu trắng cao độ. Để trong ít nhất 30 ngày. Mỗi lần uống 15ml x 2 lần trong ngày. Điều trị bệnh viêm gan, nhiễm trùng thận Dùng 30g cây cỏ xước kết hợp với các vị rễ cỏ tranh, xa tiền, mộc thông, phất dũ, lá móng tay, trọng đài mỗi vị 15g. Sắc uống 1 thang trong ngày khi còn ấm. Mỗi thang chia làm 3 lần uống Điều trị bệnh rối loạn tiền đình, đau đầu, chóng mặt, huyết áp tăng cao, trong người bốc hỏa, táo bón Chuẩn bị hạt muồng 20g và cỏ xước 30g. Hạt muồng đem sao vàng rồi sắc chung với ngưu tất uống mỗi ngày 1 thang. Chữa máu nhiễm mỡ gây tăng huyết áp, xơ vữa động mạch Chuẩn bị thang thuốc bao gồm các vị: Cỏ xước và đương quy mỗi thứ 16g, hạt lạc giời (sao vàng), xuyên khung, cỏ cứt lợn mỗi thứ 12g, nấm mèo 10g, hạn liên thảo 20g. Trộn đều các nguyên liệu rồi đem sắc chung. Mỗi thang sắc chia 3 lần uống trong ngày. Kiên trì uống liên tục 20 – 30 ngày để thấy được hiệu quả. Chữa tăng cholesterole và triglycerid trong máu Lấy 12g cỏ xước, thái mỏng, cho vào ấm hãm như hãm trà hoặc sắc uống Điều trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp Rễ cỏ xước 20g ( sao với rượu), tầm gửi cây dâu 16g, độc hoạt, sâm nam, vân quy, tần giao quế chi, bạch thược, phòng đảng sâm mỗi vị 12g, tế tân 6g. Tất cả hợp thành một thang, sắc uống liên tục 7 ngày trong tuần sẽ thấy các triệu chứng của bệnh viêm đa khớp dạng thấp thuyên giảm rõ rệt. Trị đau lưng, mỏi gối, làm mạnh gân cốt, tăng khả năng cường dương, chữa bệnh phong thấp Chuẩn bị cỏ xước, đỗ trọng, đương quy, sinh địa, tiên linh tỳ, tỳ giải, ý dĩ nhân mỗi vị 30g; Đan sâm, kim anh, phụ tử, phòng phong, sơn thù, thạch hộc mỗi vị 15g; Hồ cốt 45g. Giã nát tất cả các vị thuốc trên, bọc trong túi vải rồi cho vào bình thủy tinh ngâm chung với 3 lít rượu. Để khoảng 7 – 9 ngày. Mỗi ngày uống 2 ly nhỏ khi bụng đang đói. Điều trị bệnh gout Đây là một trong những công dụng của cây cỏ xước được nhiều người biết tới. Người bệnh dùng cây cỏ xước phối hợp với lá tất bát, rễ cây cẩu trùng vĩ và rễ bưởi bung mỗi vị 15g. Thái mỏng thuốc rồi cho vào chảo sai vàng. Sắc thuốc với 4 bát nước lấy 2 bát thuốc đặc, uống làm 3 lần trong ngày cho hết. Liệu trình dùng thuốc tối thiểu 7 ngày, tối đa là 10 ngày. Sau đó nếu bệnh tình chưa bớt thì nên đi tái khám lại. Chữa tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, xơ vữa thành mạch, nhồi máu cơ tim Lấy 6g rễ cỏ xước khô cho vào ấm sắc cùng với 10 cây thành ngạch. Đổ 3 bát nước nấu cạn còn 1 bát. Uống thuốc sau khi ăn khoảng 30 phút liên tục trong 2 tháng liền. Nếu bệnh chưa dứt thì nghỉ 3 ngày rồi tiếp tục dùng liệu trình mới. Điều trị rối loạn kinh nguyệt, bệnh huyết hư ở phụ nữ Lấy 20g rễ cỏ xước, củ gấu, nghệ xanh, xác điến mỗi vị 16g, rễ gai 30g. Sắc thuốc ngày 1 thang chia uống vào buổi sáng, trưa, tối. Dùng liên tục 10 ngày. Phụ nữ mang thai tránh dùng. Điều trị thận suy, vàng da, tứ chi phù thũng Cây cúc bách nhật, xa tiền, cỏ mực, cỏ xước ( sao ) mỗi vị 30g. Uống ngày 1 thang theo dạng thuốc sắc. Chữa tắc kinh hoặc bế kinh ở phụ nữ Dùng 1 thang thuốc gồm 10g cỏ xước, 10g cây sung úy. Mỗi thang sắc uống làm 3 lần trong ngày. Điều trị sổ mũi trong các trường hợp bị viêm mũi dị ứng Dùng quỷ trâm thảo, lá diễn mỗi loại 20g, rễ cỏ xước 30g. Sắc thuốc với 400ml nước cho cạn còn 100ml. Chia 2 lần uống hết trong ngày khi thuốc còn ấm. Uống liền khoảng 5 ngày rồi ngưng. Trong Tây y Theo các nghiên cứu thì trong loại thực vật này có chứa thành phần gồm: Thân cây: 81,9% nước; 9,2% glucid; 3,7% protid; 2% vitamin C; 2,6% caroten; 2,9% chất xơ và 2,3% tro. Rễ cây: 4% sapogenin. Hạt: hentriacontane và saponin; acid oleanolic. Hỗ trợ tăng cường khả năng tổng hợp protein cho cơ thể. Lợi tiểu, kích thích hoạt động của thận, bổ thận. Giảm lượng đường và cholesterol trong máu, bổ gan. Kháng viêm, giảm đau, giảm sưng tốt cho bệnh xương khớp. Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay Vai trò đối với sức khỏe con người. Trị mụn, đẹp da Lợi ích cho các bệnh nhân có vấn đề về sương khớp, mạnh gân cốt, chửa phong thấp, đau lưng mỏi gối Tăng cường khả năng cường dương Lợi ích cho các bệnh nhân tăng huyết áp, xơ vữa động mạch Cải thiện tình trạng tăng cholesterole và triglycerid trong máu Một số lưu ý khi sử dụng cây cỏ sướt Hiện chưa có công trình nghiên cứu khoa học nào chứng minh về tác hại của cây cỏ xước. Tuy nhiên một số đối tượng có thể bị dị ứng với thành phần của dược liệu gây ra những tác dụng phụ như nổi mẩn, ngứa da, tức ngực, khó thở, buồn nôn, choáng váng, trong người bứt rứt khó chịu… Ngưng sử dụng cỏ xước ngay nếu bạn nhận thấy bất kì dấu hiệu xấu nào xảy ra sau khi dùng thuốc. Một số chế phẩm sử dụng hôm nay ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Dược liệu Cây Cỏ Sước trồng tại Hóc Môn được thu thập để chiết xuất. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn mẫu Thu cây cỏ sước nguyên vẹn (đầy đủ thân, lá, rễ, hoa, quả,…). Cây còn tươi, không bị héo, vàng, không bị sâu, bệnh. Cây không non cũng không già. Tiêu chuẩn loại trừ Cây bị sâu, bệnh và héo, vàng. Cây bị khiếm khuyết hay bị hư hại một phần. Cây non quá hay già quá. Cách bảo quản mẫu Sau khi thu mẫu theo tiêu chuẩn, để mẫu vào túi ni lông có nước hay thu cây có cẩ đất để giữ ẩm, không để cây bị héo. Khi xử lý mẫu xong, chúng ta trồng lại để tiến hành nghiên cứu các chỉ tiêu chưa đạt. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị Nguyên liệu: Mẫu lá của cây Cỏ Sướt, thu 5 đến 6 lá nguyên vẹn, không bị sâu, bệnh để chiết xuất và phân tích DNA giải trình tự gen.. Hóa chất PCR và điện di: PCRMix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Laddeer 1 kb phí (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh sạch (nước cất 2 lầnvà đã qua thanh trùng ở 121ºC trong 20 phút). Thiết bị Điện di ATTO CORPORATION AE 7344, máy điện di gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGETwin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystem – Malaysia), máy đọc gel bằng tia UV (BioBlockScientific, Pháp). Công cụ và máy xử lý Giải trình tự DNA và xác định gen ITS. Thời gian nghiên cứu . Thời gian bắt đầu: 12092021 Thời gian kết thúc: 07102021 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp chỉ thị hình thái Đặc điểm hình thái Quan sát và mô tả hình thái bên ngoài và vi phẫu cây Cỏ Sướt. Dựa vào các phương pháp nghiên cứu thực vật của PGS.TS Trương Thị Đẹp (2010) có cải tiến, các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá, rễ, hoa, quả , hạt. Mỗi đặc điểm thực hiện 10 mẫu Thân: Đo hết phần thân trên trên mặt đất, từ mặt đất đến cuối chồi ngọn.. Lá: Đo hai chỉ số: Chiều dài lá từ cuống lá đến chót lá; chiều rộng phần phiến lá lớn nhất.. Rễ: Đo từ phần dưới mặt đất (miền trưởng thành) đến chóp rễ. Hoa: Đếm số tràng hoa, nhị và nhụy. Mô tả màu săc và hình dạng tràng hoa. Quả: Đo kích thước quả, mô tả màu săc và hình dạng quả. Hạt: Mô tả màu săc và hình dạng hạt, số lượng hạt trong một quả. Cách đo: Đặt thước có chia đơn vị đo cm và mm. Đặt thước song song với mẫu và vuông góc với mặt đất hoặc vuông góc giữa hai thước. Sau khi đo đủ mỗi chỉ số 10 mẫu ta lấy kích thước trung bình. Phương pháp chỉ thị phân tử Tách chiết tổng số và tinh sạch DNA Thu thập mẫu Thu thập mẫu lá tươi, tốt nhất khi lá còn non. Đông khô mẫu lá tươi dùng lâu dài. Tách chiết DNA Sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo CTAB cải tiến (protocol của Phòng Thí nghiệm Di truyền học Trường Đại học Tổng hợp Ghent, Vương Quốc Bỉ). 1. Thu 25 gam lá, Tốt nhất là lá non, lá non sẽ cho ta lượng DNA nhiều nhất. Lá không bị nấm, vi khuẩn, virus. Dùng tươi hoặc đông khô. 2. Cắt lá thành từng đoạn 3mm – 5mm vào ống eppendoft 2ml, lượng lá khoảng 23 ống. Mỗi ống cho vào 1 viên bi sắt chuyên dụng, đậy nắp lại. 3. Cho eppendoft chứa lá vào nitơ lỏng ( sau khi đã ngâm dụng cụ đựng eppendoft vào nitơ lỏng), khi đủ độ lạnh lấy dụng cụ và eppendoft chứa mẫu ra. Lắp vào máy nghiền 2 phút, nếu chưa mịn ta cho thêm 1 chu kỳ 2 phút nữa. 4. Cho thêm vào mỗi eppendoft 1ml Extraction buffer (EB) đã được đun cách thủy 650C trước đó 20 phút, trộn đều, cắm trong nước đá. Thêm vào mỗi eppendoft 50 µl S.D.S 10% (lượng S.D.S cho vào theo tỉ lệ 50µlml Wv). Ủ trong máy lắc nước thời gian 30 phút ở nhiệt độ 650C. Chú ý: trước khi cho dịch EB vào eppendoft ta cho thêm β Mecaptoethanol 0,2% theo tỷ lệ 7µl BME10ml EB, trộn đều. Trong quá trình ủ ở 650C, cứ 5 phút ta lại đảo bằng tay một lần. 5. Ly tâm bằng máy ly tâm lạnh 40C, tốc độ 13.500 vòngphút trong 20 phút. 6. Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang 1 ống eppendoft 2ml khác mới (ghi lại số của mẫu). Thêm 1ml isopropanol (đã giữ ở tủ lạnh – 200C), đảo bằng tay một cách nhẹ nhàng trong 5 phút. Rồi để vào tủ lạnh 40C trong 30 phút hoặc qua đêm. 7. Ly tâm lạnh 40C tốc độ 13.500 vòngphút trong 15 phút. 8. Đổ hết dịch nổi phía trên chỉ giữ lại tủa ở dưới đáy eppendoft để khô tự nhiên, thêm vào 400µl TE 8.0 (10:0.1). Cho vào ủ ở 650C trong 5 phút. Lấy ra búng cho tan tủa hoặc dùng pipetteman 200 hoặc 20 để hòa tan tủa (có thể để tan tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ 40C) 9. Cho 3µl RNase (10mg1ml) vào mỗi ống, trộn đều eppendoft bằng tay. Ly tâm cho lắng xuống khi tốc độ đạt 2000 vòng thì dừng lại. Ủ ở 370C trong 6 giờ, sau đó cho vào giữ ở 40C (có thể ủ qua đêm) cho tới khi làm tiếp bước 10. 10. Thêm vào mỗi eppendoft 400µl đệm CTAB và ủ trong bình cách thủy 650C, trong 15 phút. Thỉnh thoảng đảo trộn đều bằng tay. 11. Cho vào tủ hood, cho thêm 800µl Choloroform: isomylalcohol (24:1) vào mỗi eppendoft, lắc trộn bằng tay từ 57 phút. 12. Ly tâm ở 13.500 vòngphút trong 10 phút. 13. Dùng pipetteman hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang ống eppendoft mới (ghi lại số ống). 14. Lặp lại bước 11. 15. Lặp lại bước 12. 16. Lặp lại bước 13. 17. Thêm 1400 µl ethanol 96% (đã làm lạnh) và giữ trong tủ lạnh – 200C qua đêm. 18. Ly tâm 13.500 vòngphút ở 40C trong 30 phút, loại bỏ cồn giữ lại kết tủa ở dưới đáy ống. 19. Rửa tiếp bằng 400 µlethanol 70% (đã làm lạnh) ly tâm 13.500 vòngphút trong 5 phút ở 40C. Sau đó đổ ethanol giữ tủa lại. 20. (Lặp lại bước 19). 21. Đổ ethanol giữ tủa lại để khô tự nhiên hoặc cho vào máy ly tâm khô chân không khoảng 10 phút để làm khô DNA. 22. Cho thêm vào mỗi eppendoft 50µl TE (10:0,1) để hòa tan DNA. 23. Giữ DNA trong tủ lạnh – 200C, dùng dần. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất. Bảng 2.2 1Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất Đệm CTAB (EB) 500ml + CTAB 2% 10 gam CTAB + EDTA(pH:8) 0,5M 50ml + NACL 2M 200ml 5M + Tris. Cl (pH = 7.5) 0,2M 100ml 1M(pH = 7,5) isopropanol (2Propanol) SDS 10% βMercaptoethanol : 0,2% TE pH 8 (10:0,1) + 600µl Tris.HCL 1M pH = 8 + 12µl EDTA 0,5M pH = 8 + Thêm dH2O cho đủ V = 60ml. RNase – 10mg RNase10ml H2O đun sôi 1015 phút, giữ trong 200C. Hỗn hợp Chloroform: isoamylalcohol (24:1). Ethanol tuyệt đối và ethanol 70% giữ ở 200C. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA Độ tinh sạch DNA của lá cỏ sướt được kiểm tra bằng cách xác định O.D ở 260nm và O.D ở 280nm trên máy quang phổ kế. Tỷ lệ O.D260O.D280 trong khoảng từ 1,61,8 là DNA đủ độ tinh sạch. Tỷ lệ O.D260O.D280 nhỏ hơn giới hạn trên thì DNA không tinh sạch mẫu còn lẫn protein hay tạp chất nào đó. Nồng độDNA được tính theo công thức: DNA = (µl)⁄ml=(O.D260x50x5)1000 50 là độ pha loãng, khi mỗi cuvet mẫu đo ta chỉ cho 2µl mẫu. Kỹ thuật phân tích DNA bằng chỉ thị vi vệ tinh (SSR) Chuẩn bị gel agarose Cân 1g agarose, đun sôi trong 100ml 1xTAE cho đến khi agarose tan hết. Để nguội xuống còn 500600C, cho thêm 4µl EtBr, lắc đều, Đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài lược sẵn, để nguội, rút lược ra. Đặt khay gel vào bể điện di và cho 1xTAE ngập gel từ 23mm. Tra mẫu điện di: lần lượt tra mẫu vào các giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu). Mẫu là DNA trộn với thuốc nhuộm Bromophenol blue 0,25% và nước cho đủ 10µl (2:2:6) (vvv). Cường độ dòng điện và thời gian chạy điện di phụ thuộc vào mẫu điện di và mục đích sử dụng. Thường để thuốc nhuộm qua giếng 2mm. Kiểm tra mẫu điện di trên máy soi DNA (tia UV) Hóa chất: 1xTAE được pha từ dịch gốc 20xTAE 20xTAE: + 96,8g Tris base + 22,84 ml glacial acetic acid + 40 ml EDTA 0.5M Chỉnh pH = 8 bằng Acetic acid Thêm H2O khử trùng đủ 1 lít Thuốc nhuộm Bromophenol Blue 0,25% Bromophenol Blue 0,05g 40% Saccharose trong nước 8g H2O khử trùng Thêm H2O cho đủ 20ml Kỹ thuật này được thực hiện theo phương pháp của Phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Khoa thực vật và Thổ nhưỡng, thuộc trường ĐH Công nghệ Texas, ở Hòa Kỳ. Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR Bảng 2.2 2Thành phần và thứ tự phản ứng PCR Thành phần Thứ tự Thêm vào Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng Nước cất 2 lần đã khử ion, khử trùng 1 X 5xPCR Buffer (với dNTP, mỗi loại 10µl + 10µl BSA +450 µl dH2O) 2 4 1x(dNTP= 200µl) MgCl2 3 0,64 15mM Mồi thuận (10µM) 4 y 0,2µM Mồi nghịch (10µM) 5 0,2µM TaqDNA polymerase (5unitsµl) 6 0,3 1.5 Units ADN khuôn (30ngµl) 7 3 90ng20µl Tổng thể tích 20µl Để làm phản ứng, Pha DNA khuôn (template) của các mẫu đồng nhất 30nglµl. Kiểm tra mồi để làm phản ứng, với các mồi còn tốt chỉ dùng 0,32µl (10µMµl) cho một phản ứng (tổng số 20µl) Trình tự primer ITS ITS 1 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’ ITS 4 5’TCCTCCGCTTATTG ATATGC Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: Sau khi làm xong phản ứng ta ly tâm 2000vphút, cho mẫu lắng xuống bằng máy ly tâm cân bằng. Khi tốc độ đạt 2000vphút ta lấy ra. Tiến hành phản ứng PCR. Mỗi phản ứng PCR chúng tôi thường chạy 30 chu kỳ. Chường trình chạy phụ thuộc nhiệt độ ủ (annealing) của mồi . Thường nhiệt độ ủ là 550, ta có chương trình cài đặt như sau: Bảng 2.2 3Chương trình cài đặt các bước Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ I 940 5’ 1 II 950 1:30’’ 30 550 1:30’’ 720 1:30’’ III 720 5’ 1 IV 40 Cho đến khi lấy ra (Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011) Trường hợp nhiệt độ ủ là 600C hay 630C ta chỉ thay đổi nhiệt độ ủ 550C ở bước II thành 600C hay 630C. Phương pháp xử lí số liệu. Phân tích phân ly di truyền Các số liệu phân tích phân ly di truyền tính trạng kháng rầy được xử lý thống kê (Gomez and Gomez, 1984) theo phép thử “x2”. Như vậy ở đây, khi có 2 lớp phân ly (m=2), ta có: X2=〖(|Q_1L_1 |0,5)〗2L_1 + 〖(|Q_(2) L_2 |0,5)〗2L_2 Còn trong trường hợp có trên 2 lớp phân ly (m>2), ta có: X2=∑_(i=1)m▒(Q_iL_i )2L_i Trong đó: i= 1, 2, …., m m là số lớp phân ly Qi là tần số quan sát thực tế của lớp i Li là tần số xuất hiện lý thuyết của lớp i Từ giá trị « X2 tìm được , tra bảng thống kê để tìm giá trị P tương ứng. Nếu P>0,05 thì tỉ lệ phân ly thực nghiệm được coi là phù hợp với lý thuyết. Tương dồng di truyền và khoảng cách di truyền Phân tích mức tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo chương trình PopGene, theo công thức của Nei (1972) 146 : I=q_12√(Q_1 Q_2 ) và D = ln (I) Trong đó : I – mức tương đồng di truyền D – khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu q12 – số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu Q1 và Q2 tổng số các alen của mẫu 1 và mẫu 2. Phân tích liên kết Phân tích liên kết các chỉ thị phân tử với locut gen kháng rầy nâu và định vị các locut gen kháng rầy nâu trên nhiễm sắc thể của lúa được tiến hành theo chương trình máy tính MapMarker. Giải trình tự DNA và xác định gen ITS Kỹ thuật nàydựa trên phương pháp Sanger (Sanger er al.,1977). Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy các oligonucleotid cuùng chấm dứt tại một dideoxxynucleotid sẽ có cùng một màu. DNA được giải trình tự bởi công ty DNA Sequencing ServicesGeneral Order Information, Hàn Quốc trên máy đọc trình tự tự động. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT Nghiên cứu lý thuyết Phương pháp thu thập thông tin, phân tích, so sánh, tổng hợp. Phân loại thông tin nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu tài liệu Nội dung cần thu thập trong quá trình nghiên cứu tài liệu. Nguồn tài liệu: các Bài báo, Hội thảo khoa học, Giáo trình Hóa sinh, các Luận văn và Luận án khoa học liên quan đến cây Cỏ Sướt, các trang Web liên quan Phân tích tài liệu Tổng hợp tài liệu. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Các thông tin được thu thập phải đảm bảo chính xác, có độ tin cậy cao nhất.. Kết quả của nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến hoạt động kinh doanh và sản xuất của các cơ quan nghiên cứu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI Mẫu cây ….. được thu thập tại ……. ở vị trí: Kinh độ: …. Vĩ độ: …… Passifloraedulis Loài (species): … Chi (genus): … Họ (familia): …. Bộ (ordo): Lớp: Giới (regnum): Tên khác: Thân. Lá Rễ Hoa Quả Hạt HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: . Tiến hành phản ứng PCR. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY CỎ SƯỚT Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA Kết quả giải trình tự gen DNA Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY CỎ SƯỚT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. KẾT LUẬN. Quá trình nghiên cứu, tổng hợp tài liệu qua các báo cáo khoa học của đã khẳng định. Mẫu cây ……. được thu thập tại ………... ở vị trí: Kinh độ: Vĩ độ: Tên khoa học: Loài (species): Chi (genus): Họ (familia): Lớp: Giới (regnum): Plantae. Tên khác: .Đặc điểm chỉ thị hình thái thu được phù hợp với cây ……..mô tả trong đề tài. Thân Lá Rễ Hoa Quả Hạt Kết luận: Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây …… Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây ….. và trình tự gen của cây này. KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bách khoa tri thức : Kinh tế,Khoa học,Y Dược CapaPham. 2. Bộ Y Tế, 2006. Giáo trình Dược cổ truyền. Nhà xuất bản Y học. 3. Bộ Y Tế, 2017. Dược điển Việt Nam V. Nhà xuất bản Y học. 4. Chuyên mục Cây Thuốc Dân Gian trên Sntv.vn. 5. Cổng Thông Tin Điện tử Bộ Y tế (MOH) . 6. Dược Điển Việt Nam IV. 2009. Tr 606607608. 7. Dược Thư Quốc Gia. 20022009. Tr 30813087. 8. Đỗ Huy Bích và cs, 2006. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuât bản Khoa học và kỹ thuật. Tập I. 9. Đỗ Tất Lợi, 2006. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 10. Đỗ Tất Lợi (2014),Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam .Nxb Y học . Hà Nội 11. Ganapathy M., AlaguLakshmanan and Selvarasuvasuki M., 2015. Refined method of pure genomic DNA isolation from Plectranthus forskohlii(Willd) Briq An Endangered medicinal plant. Life Science Archieves. Vol 1. P. 208216. 12. L.Y Bùi Hồng Minh, nguyên Chủ tịch Hội Đông y Ba Đình, Hà Nội , Những bài thuốc trị bệnh trong Đông y. 13. Manikandan S., Ansarali S. , and Alagu Lakshmanan G. M., 2017. Optimizing the pure genomic DNA isolation procedure for Plectranthus amboinicus. Journal of Applied and Advanced Research. Vol 2. p. 249–255 14. Nguyễn Đăng Tôn, Nông Văn Hải,Viện Nghiên cứu hệ gen.Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) số 8551:2010 15. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006. Các phương pháp nghiên cứu thực vật. NXB Giáo Dục. Website http:uphcm.edu.vncaythuocindex.php?q=node365 https:vi.wikipedia.orgwikiC%E1%BB%8F_x%C6%B0%E1%BB%9BcTh%E1%BB%A9gi%E1%BB%91ng https:en.wikipedia.orgwikiAchyranthes_aspera https:www.feedipedia.orgnode194 https:tamminhduong.comduoclieucaycoxuoc.html https:soyte.namdinh.gov.vnhomehoatdongnganhgiaoducsuckhoedieutribenhthoaihoakhopbangcaycoxuoc630 https:www.thuocdantoc.orgduoclieucoxuoc http:www.botanyvn.comcnt.asp?param=edirv=Achyranthes%20asperalist=species https:species.wikimedia.orgwikiAchyranthes_aspera PHỤ LỤC Phụ lục A Phụ lục B Phụ lục 3. Quy trình ly trích DNA Tách chiết DNA: Nghiền 200l mẫu trong túp eppendorf bằng máy nghiền. Thêm 1ml dung dịch trích (EB) và 50l SDS (10%). Ủ 65 trong 30’ (5’ đảo nhẹ) Li tâm 13.000rpm trong 10’. Chuyển phần trong (800l) vào túp mới và thêm một lượng tương đương Isopropanol, ủ 2 giờ ở 20oC. Li tâm 13.000rpm trong 10’, hoà tan DNA trong 400 l TE. Thêm 10l Rnase (10mgml) ủ ở 37 trong 15’. Thêm 400l CTAB buffer và ủ ở 65 trong 15’, thỉnh thoảng đảo ngược ống túp để trộn đều. Thêm 800l ChloroformIsoamylalcohol (24:1) và trộn đều.Litâm 13.000rpm trong 5’. Chuyển phần dung dịch trong qua túp 2.2 ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15’. Li tâm 13.000rpm trong 10’, đổ bỏ phần trong và rửa phần cặn với ethanol 70% b