bước đầu đánh giá đa dạng sinh học của loài gymnema sp ở việt nam thông qua chỉ thị hình thái và chỉ thị adn

VŨ THỊ THANH THÚY BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA LỒI GYMNEMA SP Ở VIỆT NAM THƠNG QUA CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ ADN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2013 VŨ THỊ THANH THÚY BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA LỒI GYMNEMA SP Ở VIỆT NAM THƠNG QUA CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ ADN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: TS Phùng Thanh Hương ThS Phạm Hà Thanh Tùng Nơi thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Di truyền nông nghiệp HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới: TS Phùng Thanh Hương ThS Phạm Hà Thanh Tùng Những người thầy tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn tới anh chị em Bộ môn Thực vật, Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô anh chị em đồng nghiệp Bộ mơn Hóa sinh ủng hộ, giúp đỡ gánh vác phần công việc chuyên môn suốt thời gian thực khóa luận để tơi có thời gian tập trung nghiên cứu Lời cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân ln giúp đỡ, động viên tơi suốt trình thực đề tài Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2013 Sinh viên Vũ Thị Thanh Thúy MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Gymnema 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Gymnema 1.1.3 Các loài thuộc chi Gymnema 1.1.4 Tác dụng hạ đường huyết loài thuộc chi Gymnema 1.1.5 Các tác dụng sinh học khác 1.1.6 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan nghiên cứu đa dạng sinh học 1.2.1 Các nghiên cứu đa dạng sinh học Việt Nam giới 1.2.2 Các nghiên cứu đa dạng sinh học chi Gymnema 1.3.Tổng quan vùng phiên mã nội ADN Ribosom (ITS – rADN) 1.3.1 Cấu trúc ITS-rADN 10 1.3.2 Vai trò, ứng dụng ADN Ribosom ITS nghiên cứu di truyền …………………………………………………………………… 11 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị, hóa chất dùng nghiên cứu 14 2.1.1 Nguyên liệu: 14 2.1.2 Trang thiết bị hóa chất 14 2.1.2.1 Nghiên cứu đa dạng hình thái…………………………… 14 2.1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền…………… ………………… 15 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu: 16 2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Nghiên cứu hình thái 17 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng trình tự ITS - rADN 18 2.2.2.1 Tách chiết ADN ………………………………………………18 2.2.2.2 Khuếch đại ADN PCR ……………………………… 19 2.2.2.3 Điện di ADN gel agarose ……………………………… 20 2.2.2.4 Phương pháp tinh ADN ……………………………… 20 2.2.2.5 Phương pháp giải trình tự ADN ribosom vùng ITS ………… 21 2.2.2.6 So sánh trình tự ADN 22 2.2.2.7 Xây dựng phân loại dựa trình tự ADN 22 Chương THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23 3.1 Phân loại mẫu nghiên cứu dựa đặc điểm hình thái 23 3.2 Trình tự ITS-rADN mẫu nghiên cứu 27 3.2.1 Tách chiết ADN 27 3.2.2 Kết PCR 28 3.2.3 Xác định trình tự ADN ribosom vùng ITS 29 3.2.4 So sánh trình tự ADN ribosom vùng ITS 32 3.2.5 Lập phân loại 35 Chương 4: BÀN LUẬN 36 4.1 Sự đa dạng hình thái mẫu Gymnema sp Việt Nam 36 4.2 Sự đa dạng trình tự ITS-rADN mẫu Gymnema sp Việt Nam 36 4.3 Về mối liên hệ hình thái trình tự ITS-rADN mẫu Gymnema sp 39 KẾT LUẬN 42 ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleic AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: Base pair C: Cytocine dNTP: Deoxyribonucleotid triphosphat ĐTĐ: Đái tháo đường EDTA: Ethylen diamin tetra acetic acid EtBr: Ethydium Bromid G: Guanine G.: Gymnema HDL: High density Lipoprotein ISSR: Inter-simple sequence repeat polymorphism ITS: Internal Transcribed Spacer LDL: Low density Lipoprotein Nu: Nucleotides PCR: Polymerase Chain Reaction rADN:Acid deoxyribo nucleotide ribosome RAPD: Random amplified polymorphic deoxyribonucleotide acid RFLP: Restriction fragment length polymorphism STZ: Streptozotocin TAE: Tris - Acetic acid - EDTA Taq: Themus aquaticus VLDL: Very low density Lipoprotein DANH MỤC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 2.1 Danh sách mẫu 14 Bảng 2.2 Cặp mồi dùng phản ứng PCR 16 Bảng 2.3 Các tiêu hình thái mô tả so sánh 17 Bảng 2.4 Các thành phần phản ứng PCR 19 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng để xác định trình tự 21 Bảng 3.1 Các đặc điểm hình thái so sánh mẫu 25 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền trình tự mẫu nghiên cứu Thành phần G+C độ dài trình tự đoạn ITS1, ITS2, 5.8S 33 34 DANH MỤC HÌNH Hình Nội dung Trang Hình 1.1 Cấu trúc vùng ADN ribosom ITS 10 Hình 2.1 Các bước nghiên cứu 17 Hình 3.1 Hình 3.2 Cây phân loại mẫu nghiên cứu dựa đặc điểm hình thái So sánh đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Gymnema latifolium 23 24 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN 28 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR 28 Trình tự vùng ITS – rADN mẫu nghiên cứu Hình 3.5 trình tự cơng bố ngân hàng gen 29 Hình 3.6 Đoạn nuleotide đặc trưng phân biệt hai lồi Gymnema 32 Hình 3.7 Cây phân loại lồi chi Gymnema R.Br 35 Hình 4.1 So sánh phân loại hình thái phân loại trình tự ITS-rADN mẫu nghiên cứu 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Gymnema chi thực vật phong phú với 49 loài phát tồn giới, bao gồm lồi ghi nhận Việt Nam Đây chi thực vật quan trọng điều trị đái tháo đường (ĐTĐ), loài chi Gymnema nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ đường huyết bao gồm: Gymnema sylvestre [8], [9], [22], [38], Gymnema inodorum [49], [50], Gymnema montanum [16], [17], [41], Gymnema yunnanense [58] , Gymnema latifolium [3] Ở Việt Nam, nghiên cứu chi thực năm 2007 [13], nghiên cứu nước chủ yếu tập trung vào tác dụng chữa ĐTĐ loài Gymnema sylvestre [8], [9] Gymnema latifolium [3] Xuất phát từ kết nghiên cứu trên, nhiều chế phẩm dược phẩm thực phẩm chức với thành phần dược liệu thuộc chi Gymnema lưu hành rộng rãi giới nói chung Việt Nam nói riêng nhằm hỗ trợ kiểm sốt đường huyết bệnh nhân ĐTĐ Điều dẫn đến nhu cầu cấp thiết việc bảo tồn nguồn gen nhằm hướng tới phát triển tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu làm thuốc từ chi Gymnema Nhằm đáp ứng nhu cầu đó, giới có nghiên cứu đa dạng sinh học đa dạng nguồn gen chi Gymnema dựa đặc điểm hình thái thị phân tử ADN chưa có nghiên cứu kết hợp thị để khám phá liên quan đa dạng hình thái đa dạng di truyền Xuất phát từ thực tế này, đề tài: “Bước đầu đánh giá đa dạng sinh học lồi Gymnema sp Viêt Nam thơng qua thị hình thái thị ADN" tiến hành với mục tiêu sau: - So sánh đặc điểm hình thái mẫu Gymnema sylvestre Gymnema latifolium thu hái vùng khác Việt Nam - Đánh giá đa dạng trình tự vùng phiên mã nội ADN ribosom (ITS-rADN) mẫu Gymnema sylvestre Gymnema latifolium thu hái vùng khác Việt Nam - Bước đầu tìm hiểu mối liên quan đặc điểm hình thái trình tự ITS-rADN thể mẫu Gymnema sylvestre Gymnema latifolium thu Thái Nguyên Độ dài đoạn 5.8 S có tương đồng tất mẫu nghiên cứu 163 bp Trong có khác biệt nhiều đoạn ITS1 từ 240 – 248 bp Còn đoạn ITS2 lại ổn định khoảng 237-239 bp Đoạn ITS1 Gymnema latifolium có kích thước 247 248 bp, Gymnema sylvestre từ 240-245 bp Đoạn ITS2 G.sylvestre từ 238-239 bp, G.latifolium 237-238 bp Về tỷ lệ G+C:Tỷ lệ tổng G+C mẫu Gymnema sylvestre dao động khoảng 64,3% (mẫu G.sylvestre thu hái Phú Yên) tới 70,5 % (mẫu G sylvestre thu hái Thái Nguyên) Thành phần G+C mẫu khác biệt đoạn khác vùng ITS, đoạn 5.8S từ 48,5 % - 56, đoạn ITS1 từ 61,6 %- 69,58 % ITS2 từ 59,366,41% Trong hai mẫu Gymnema latifolium lại tương đồng tỷ lệ % G+C đoạn vùng ITS, vùng ITS1 % GC M1 67,7% thấp so với M6 68%, ngược lại vùng ITS2 tỷ lệ G+C M1 (70,2%) lại cao so với M6 70%), cịn đoạn 5,8S tồn vùng ITS tỷ lệ G+C ổn định hai loài 56,4% 65,8% 3.2.5 Lập phân loại Từ trình tự nucleotid mẫu sau gióng hàng, phần mềm PAUP thiết lập mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu thông qua phân loại Kết thể hình 3.7 Hình 3.7: Cây phân loại mẫu Gymnema sp dựa trình tự ITS-rADN (Tỷ lệ % lặp lại từ 100 phép thử độc lập thể nhánh) Các mẫu nghiên cứu chia thành nhóm chính: Nhóm (I) gồm mẫu M1, M6 thuộc lồi Gymnema latifolium Nhóm (2) gồm mẫu M2, M3,M4, M5, M7, M8 thuộc lồi Gymnema sylvestre Trình tự tham khảo Gymnema sylvestre ngân hàng gen giới đoạn rADN-ITS thuộc nhóm lại nhánh khác so với mẫu Gymnema sylvestre Việt Nam Chương 4: BÀN LUẬN  Sự đa dạng hình thái mẫu Gymnema sp Việt Nam Phân loại dựa đặc điểm hình thái phương pháp sử dụng từ lâu, tỏ hiệu việc phân loại thực vật Bởi thuộc chi, họ, khác có đặc điểm khác ngược lại chi, họ, lại có số đặc điểm chung Đây sở giúp nhận biết, phân loại Tuy nhiên, áp dụng phương pháp vào việc phân loại loài loài chi bậc phân loại nhỏ gặp nhiều khó khăn mẫu thu hái không đầy đủ phận Để khắc phục nhược điểm trên, thu thập đầy đủ tất phận quan trọng việc phân loại bao gồm hoa, tiến hành so sánh 28 đặc điểm hình thái mẫu Do đó, việc đánh giá đa dạng phân loại mẫu nghiên cứu có độ tin cậy cao Dựa vào đặc điểm hình thái, mẫu nghiên cứu chia thành hai nhóm Gymnema sylvestre Gymnema latifolium Hai loài phân biệt tất phận: thân (ở bề mặt thân cây, màu sắc nhựa mủ mức độ lông thân), (độ dài cuống lá, hình dạng lá, kích thước lá, gốc lá), hoa (số lượng hoa cụm, mật độ lơng tràng hoa), (hình dạng kích thước quả) Kết tương đồng với kết công bố Phạm Hà Thanh Tùng loài chi Gymnema [12] Trong lồi Gymnema sylvestre lại chia thành hai nhóm nhỏ, phân biệt màu sắc hoa (vàng hay trắng), số gân lá, có hay khơng có lơng mặt Hai nhóm hai thứ khác lồi Gymnema sylvestre Có thể nói kết chúng tơi hồn tồn mới, từ trước đến Việt Nam giới chưa có cơng bố phân loại loài Gymnema sylvestre 4.2 Sự đa dạng trình tự ITS-rADN mẫu Gymnema sp Việt Nam Trình tự ITS - rADN mẫu M1-M8 xếp phần mềm ClustalX Bằng phần mềm Bio Edit, xác định vùng ITS với đoạn thành phần Trong đoạn trên, kích thước đoạn 5.8 S tương đối ổn định mẫu khác (163bp) Kết tương đồng với nghiên cứu nhiều lồi khác 5.8S coi vùng bảo thủ, có khác biệt loài [59] Độ dài vùng ITS Gymnema sylvestre dao động từ 641646bp, tương tự kích thước trình tự Gymnema sylvestre cơng bố genbank (640bp) Trong kích thước vùng ITS mẫu Gymnema latifolium lại lớn (647-649bp), khác biệt kích thước đoạn ITS1 Gymnema latifolium lớn mẫu Gymnema sylvestre nước Sự khác biệt chủ yếu đoạn ITS1, lồi Gymnema latifolium có thêm trình tự CGGCCCAA vị trí 55 - 62 đoạn lồi Gymnema sylvestre khoảng cách (gaps) Đây công bố đoạn trình tự đặc trưng vùng ITS1 chi Gymnema Trình tự sử dụng mã vạch ADN để nhận biết phân biệt loài G.sylvestre với G.latifolium Trong thực tế, có nhiều mã vạch ADN phát triển từ nghiên cứu đa dạng di truyền nhằm nhận biết dược liệu, phân biệt thật giả, tiêu chuẩn hóa dược liệu Tuy nhiên, để khẳng định hiệu phân biệt mã vạch ITS1 chi Gymnema, cần có thêm nghiên cứu với số lượng mẫu lớn hơn.Từ trước đến nay, nghiên cứu nhận diện lồi có mối quan hệ họ hàng gần thường chủ yếu dựa vào so sánh khác biệt vùng ITS2 vùng coi vùng siêu biến, có đa hình cao, biến đổi nhiều q trình tiến hóa [23] Nhưng kết lại khác biệt loài chi Gymnema lại chủ yếu nằm vùng ITS1 sử dụng vùng để phân biệt hai loài G.sylvestre G.latifolium chi Gymnema Kết phù hợp với số nghiên cứu lồi khác Ví dụ: muốn xác định mối quan hệ họ hàng loài thuộc chi Boerhavia B.diffusa, B.erecta, B.repanda, B.vertiallata thu hái từ vùng Western Ghats Coimbatore, Ấn Độ, nhà khoa học nghiên cứu đa hình đoạn vùng ITS Kết cho thấy vùng ITS1 tỷ lệ đa hình 30% vùng ITS2 16% [24] Ngoài ra, ITS1 sử dụng để chứng minh loài Amomum villosumand thuộc chi Alpinia [40] Hai loài Gymnema sylvestre Gymnema latifolium không khác độ dài đoạn ITS1 ITS2 mà khác vể %G+C vùng ITS đoạn vùng Trong %G+C loài G.latifolium đồng mẫu (đoạn ITS1 từ 67,7 - 68%, đoạn ITS2 từ 70 -70,2%, đoạn 5.8S vùng ITS giống tương ứng 56,4% 65,8%) lồi G.sylvestre lại chênh lệch rõ mẫu (tỷ lệ G+C toàn vùng ITS dao động từ 64,3 -70,5%, đoạn 5.8S từ 48,5 - 56 %, đoạn ITS1 từ 61,6 - 69,58 % ITS2 từ 59,3-66,41%) Khi so sánh mức độ tương đồng mẫu, tương đồng lồi lớn 90% Lồi Gymnema latifolium có độ tương đồng cao đạt 99% Còn tương đồng loài Gymnema sylvestre dao động từ 90% -100% Giữa hai loài G.sylvestre G.latifolium tương đồng từ 88% - 94% Có thể thấy mức độ tương đồng trình tự ITS-rADN dao động khác tùy thuộc mức độ gần gũi quan hệ tiến hóa lồi Trong loài phân bố vùng khác tương đồng cao so với loài chi Điều khẳng định so sánh trình tự ITS-rADN lồi Zanthoxylum Khi nghiên cứu Zanthoxylum piperitum thu hái từ vùng khác nhau, kết cho thấy tương đồng dao động khoảng 95-100% Cịn so sánh trình tự ITS-rADN hai loài Zanthoxylum piperitum Zanthoxylum schinifolium cho thấy mức độ tương đồng 92% [60] Khi so sánh mẫu nghiên cứu với mẫu công bố ngân hàng gen giới, tương đồng từ 89 - 94 % Sự khác biệt cho thấy có mức độ đa dạng cao mặt di truyền phạm vi loài Gymnema sylvestre, vùng Việt Nam giới Sự đa dạng phản ánh rõ phân loại hình 3.7, theo đó, có nhóm Gymnema sylvestre phân với độ tin cậy cao (bootstraps 100%) Sự đa dạng di truyền dẫn đến khác biệt đáng kể kiểu hình, hàm lượng hoạt chất tác dụng chữa đái tháo đường, đặc biệt với loài thảo dược làm thuốc quan trọng Gymnema sylvestre Sự đa dạng làm nảy sinh cần thiết phải có nghiên cứu nhằm phân loại cấp độ loài Gymnema sylvestre mặt khác nghiên cứu đánh giá, lựa chọn nguồn gen dược liệu có chất lượng cao nhiều nguồn gen đa dạng phong phú 4.3 Về mối liên hệ hình thái trình tự ITS-rADN mẫu Gymnema sp Một quy luật thường gặp nghiên cứu thuốc là: loài thuộc bậc phân loại (lồi, chi, họ) thường có đặc điểm chung hình thái, thành phần hóa học tác dụng sinh học Cơ sở khoa học quy luật tương đồng di truyền loài bậc phân loại (taxon), đặc điểm di truyền tương tự yếu tố quan trọng dẫn tới giống tính trạng biểu bên ngồi Mức độ tương đồng trình tự ADN cao, thể gần gũi mức độ tiến hóa có tương đồng hình thái, thành phần hóa học tác dụng sinh học Do vậy, thị phân tử sử dụng công cụ bổ sung hiệu cho đặc điểm hình thái để phân loại thực vật xác định mối quan hệ tiến hóa lồi Trong đó, với chi Gymnema, giới có nhiều nghiên cứu đánh giá đa dạng hình thái quần thể G sylvestre vùng địa lý khác Mặt khác, số nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền mẫu Gymnema sylvestre với thị RAPD-PCR, dựa so sánh băng điện di đa hình sản phẩm PCR với mồi ngẫu nhiên Tuy nhiên chưa có nghiên cứu tiến hành đồng thời việc so sánh thị ADN với tương đồng kiểu hình hình thái chi Gymnema để chứng minh có mối liên quan ADN với hình thái bên ngồi Do vậy, nghiên cứu chúng tôi, lần quan hệ mẫu thiết lập đồng thời với loại thị ADN hình thái (Hình 4.1) Hình 4.1 So sánh phân loại hình thái phân loại trình tự ITSrADN mẫu nghiên cứu Ghi chú: phân loại hình thái (trái); phân loại trình tự ITS-rADN (phải) Hình 4.1 cho thấy tương đồng hệ thống phân loại dựa hình thái hệ thống phân loại dựa trình tự ITS-rADN phạm vi mẫu nghiên cứu Sự tương đồng thị ITS-rADN với đặc điểm hình thái mở khả có tương đồng thị ITS-rADN với đặc điểm kiểu hình khác chi Gymnema hàm lượng hoạt chất, tác dụng dược lý Cần có thêm nghiên cứu tiếp tục làm rõ mối liên hệ Nếu liên hệ trình tự ITS-rADN với thành phần hóa học tác dụng sinh học chứng minh, chứng quan trọng cho thấy vai trị trình tự ITS-rADN việc làm thị để giúp lựa chọn nguồn gen dược liệu quý, góp phần bảo tồn gen tiêu chuẩn hóa dược liệu Một kết quan trọng nghiên cứu đặc điểm hình thái có phân chia cấp độ loài phạm vi mẫu Gymnema sylvestre mà thu Kết củng cố phân chia thành nhóm tương tự với thị ITS-rADN Như vậy, phát mẻ chưa công bố phân chia thành thứ (var.) loài Gymnema sylvestre Để xác nhận cơng bố kết này, cần tiếp tục có thêm đánh giá phân loại mẫu dựa vào số loại thị phân loại khác đặc điểm vi phẫu, thành phần hóa học, tác dụng sinh học… KẾT LUẬN Đã so sánh đặc điểm hình thái mẫu Gymnema sylvestre Gymnema latifolium thu hái vùng khác Việt Nam Kết hai lồi có điểm khác phận cây: thân, lá, hoa Một điểm đặc biệt mẫu Gymnema sylvestre có mẫu có hình thái khác mẫu lại màu sắc hoa, số gân lá, mật độ lông Sự khác biệt thứ khác lồi Gymnema sylvestre Đã xác định trình tự ADN ribosom ITS so sánh mức độ tương đồng trình tự mẫu Gymnema sylvestre Gymnema latifolium thu hái vùng khác Việt Nam so sánh với trình tự công bố ngân hành gen Kết cho thấy mức độ đa dạng cao mặt di truyền mẫu Gymnema sp Việt Nam, khác biệt thể chủ yếu đoạn ITS1 Khẳng định liên quan đặc điểm hình thái trình tự gen ITS-rADN phạm vi chi Gymnema Việt Nam Cả đặc điểm hình thái thị cho kết phân loại tương đương nhau, phân chia mẫu nghiên cứu thành hai loài Gymnema latifolium Gymnema sylvestre, loài Gymnema sylvestre lại có điểm khác biệtcó thể sở cho mức phân loại loài ĐỀ XUẤT Triển khai nghiên cứu so sánh thành phần hóa học tác dụng hạ đường huyết mẫu Gymnema sp nói Từ tìm mối liên hệ thành phần hóa học, tác dụng sinh học trình tự ITS-rADN Trên sở đó, sử dụng trình tự ITS-rADN làm marker nhằm giúp lựa chọn giống tốt bảo tồn nguồn gen cho chi thực vật với tác dụng chữa bệnh có giá trị Việt Nam Tiếp tục nghiên cứu với cỡ mẫu lớn để tìm thêm chứng xác nhận phân loại cấp độ loài Gymnema sylvestre TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt  Trần Thế Bách (2007), Nghiên cứu phân loại họ Thiên lý (Asclepiadaceae.R.Br) Việt Nam, Luận án tiến sỹ, viện khoa học Công nghệ Việt Nam – Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật  Nguyễn Hương Giang (2010), Nghiên cứu chiết xuất GS4 từ Dây thìa canh, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội  Phạm Văn Hải (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Dây thìa canh to Hịa Bình, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học Dược Hà Nội  Nguyễn Thị Thu Hằng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền định lượng Berberin số loài thuộc chi Berberis L.ở Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học Dược Hà Nội  Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (tập 2), NXB trẻ, trang 671-703  Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012), Đánh giá tương đồng trình tự ADN ribosom ITS lồi Bạc với lồi Hà thủ trắng sang lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư Bạc căn, Luận văn thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội  Nguyễn Thị Khanh (2012), Nghiên cứu tính đa dạng sinh học Ý dĩ miền Bắc Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội  Hà Thị Bích Ngọc (2012), Điều tra nghiên cứu số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hịa lượng đường máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2, Luận án tiến sỹ, khoa sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên  Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương (2010), Sàng lọc dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính, tác dụng hạ glucose huyết số dược liệu điển hình, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp bộ, Trường Đại học Dược Hà Nội  Nguyễn Thu Phương (2012), Nghiên cứu đa dạng sinh học phân tích thành phần alkaloid số lồi thuộc chi Mahonia nuttall miền Bắc Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội  Nguyễn Thanh Thuận, Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2010), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định số loài Sâm thuộc chi Panax”, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 14 (1), 129-133  Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật thành phần hóa học loài chi Gymnema R.Br Việt Nam, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội  Đỗ Anh Vũ (2007), Nghiên cứu đặc điểm thực vật tác dụng hạ đường huyết Dây thìa canh, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội Tiếng Anh  Alan W Meerow, David J Lehmiller, Jason R Clayton (2003), “Phylogeny and biogeography of Crinum L (Amaryllidaceae) inferred from nuclear and limited plastid non-coding DNA sequences”, Botanical Journal of the Linnean Society, 141, 349-363  Alvanrez I, Wendel J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29(3), 417-434  Ananthan R., Latha M., Pari L., Ramkumar K M., Baskar C G and Bai V N (2003), "Effect of Gymnema montanum on blood glucose, plasma insulin, and carbohydrate metabolic enzymes in alloxan-induced diabetic rats," J Med Food, 6, 43-49  Ananthan R., Latha M., Ramkumar K M., Pari L., Baskar C and Narmatha Bai V (2004), "Modulatory effects of Gymnema montanum leaf extract on alloxan-induced oxidative stress in Wistar rats," Nutrition, 20, 280-285  Ayako Yamada et all (2006), “Introduction of salyvary kallikreins by the diet containing a sweet-suppressive peptide, gurmarin, in the rat.”, Biochemical & Biophysical research communication, 346, 386-392  R Balamurali Krishna, Sujitha R Reddy Reddy M Vijayalaxmi, K.Anugna, N Divyavani and K Jagadeeswara reddy (2012), “ Molecular characterization of 17 accessions of Gymnema sylvestre R.Br using RAPD markers”, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 3(1), 0975-6299  Baldwin B.G., Sanderson M.J., Porter J.M., Wojciechowski M.F., Campbell C.S., Donoghue M.J., (1995), “ The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny”, Ann Missouri Bot Gard, 247-277  Bingtao Li M G.G.W D S and Tsiang Ying L P.-t (1995), Asclepiadaceae R Brown In Wu, Z Y & P H Raven, eds 1995 Flora of China Vol 16 (Gentianaceae through Boraginaceae) Science Press, Beijing and Missouri Botanical Garden Press, St Louis 479pp  Chattopadhyay et al (1999), “ A comparative evaluation of some blood sugar lowering agents of plant origin”, Journal of Ethnopharmacology, 67(3), 367-372  Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X.,Lin Y., Leon C (2010) “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for indentifying medicinal plant species”, Plos one, 5(1):e 8613  Dhivya Selvarai, Dhivya Shanmughanandhan, Rajeev Kumar Sama, Jijo C Joseph, Ramachandran V.Srinivasan, Sathishkumar Ramalingam (2012), "DNA Barcode ITS Effectively Distinguishes the Medicina Plant Boerhavia diffusa from ITS Adulterants," Genimics, Proteomics & Bioinformatics, Vol 10, issue 6, 364-367,  GaoT., Yao H., Song J., Liu C., Zhu Y., Ma X., Pang X., Xu H., Chen S (2010), “Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2”, J Ethnopharmacol., 130(1):116-121  Ghadaa Baraket, Olfaa Saddoud (2008), “Sequence nalysis of the internal transcribed spacers (ITSs) region of the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) in fig cultivars (Ficus carica L.)”, Scientia Horticulturae, 120(1), 34-40  Grover J K., Yadav S.and Vats V (2002), “Medicinal plants of India with antidiabetic potental”, Journal of ethnopharmacology,81, 81-100  G Hellekent et All (1995), “Taste in chimpanzee: I The summated response to sweeteness and the effect ò gymnemic acid”, Physiology & Behavior, vol 36, No 2, 469-479  Hideo Katsukawa, Toshiaki Imoto and Yuzo Ninomiya (1999), “Introduction of salvary Gurmarin-binding proteins in rats fed Gymnema-containing diets”, Chem Senses, 24, 387-392  Inoue K., Yamada H., Imoto T and Akasaka K (1998), "High pressure NMR study of a small protein, gurmarin," J Biomol NMR, 12, 535-541  Jin Qian, Yi Sun, Yong-Hong Duan (2009), “Internal Transcribed Spacers Region of rDNA in Common Wheat and Its Genome Origins”, Acta Agron Sin, 35(6), 10211029  Lee S.K (2006), DNA phylogenetic and chemical studies of phyllanthus spp and effects of various components on liver fibrosis model, PhD thesis, City university of HongKong  Lu F Y., Kao, M T., Huang, S F & Wang, J C (1998), Flora of Taiwan – Asclepiadaceae (2nd edition), Editorial Committee of the Flora of Taiwan, Taipei  Luo H., Kashiwagi A., Shibahara T and Yamada K (2007), “Decreased bodyweight without rebound and regulated lipoprotein metabolism by gymnemate in genetic multifactor syndrome animal”, Molecular and cellular biochemistry, 299, 93-98  S Najafi, S S Deokule (2011), “Studieson Gymnema sylvestre – a medicinally important plant of the family Asclepiadaceae” Trakia Journal of Sciences, Vol 9, No2, 26-32  Ninomiya Y., Imoto T and Sugimura T (1999), “Sweet taste responses of mouse chorda tympani neurons: existence of gurmarin-sensitive and insensitive receptor components”, Journal of neurophysiology, 81, 3087-3091  Ohmori R., Iwamoto T., Tago M., Takeo T., Unno T., Itakura H., et al (2005), “Antioxidant activity of various teas against free radcals and LDL oxidation”, Lipids, 40, 849-853  Okabayashi Y., Tani S., Fujisawa T., Koide M., Hasegawa H., Nakamura T., et al (1990), "Effect of Gymnema sylvestre, R.Br on glucose homeostasis in rats," Diabetes Res Clin Pract, 9, 143-148  Osman M A., Dhawan S S., Bahl J R., Darokar M P and Khanuja S P (2011), “AFLP marking and polymorphism among progenies of Gymnema sylvestre : an important plant of India”, Natural product communications, 6, 1679-1682  C.Qiao, Q.Han, Z.Zhao, Z.Wang, L.Xu, H.Xu (2009), “Sequence analysis based on ITS1 region of nuclear ribosomal DNA of Amomum villosumand ten species of Alpinia”, J Food Drug Anal, 17, 142–145  Ramkumar K M., Vanitha P., Uma C., Suganya N., Bhakkiyalakshmi E and Sujatha J (2011), “Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Gymnema montanum in streptozocin – induced diabetic rats”, Food and chemical toxicology: an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 49, 3390-3394  Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press & Cold Spring Harbor  Saneja A (2010), “ Gymnema sylvestre (Gurma): A review”, Der Pharmacia Lettre, 2, 275-284  Satdive R K., Abhilash P and Fulzele D P (2003) “Antimicrobial activity of Gymnema sylvestre leaf extract”, Fitoterapia, 74, 699-701  Shahnawaz M.(2012), “ Genetic diversity asessment of Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Sm Populationns from Western Ghats of Maharashtra, India”, Genetic Resources and Crop Evolution, 125-134  Shailendra Guvar et all (2007), “Pharmacognosy, phyto chemistry, pharmacology and clinical application of Gymnemic sylvestre”, Pharmacognosy reviews, vol.1, issue 2, 338-343  N Shigematsu et al (2001), “Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R Br leaves on lipid metabolism in rats”, Biol Pharm Bull 24(6), 713-717  Shigemura N., Nakao K., Yasuo T., Murata Y., Yasumatsu K., Nakashima A., et al (2008), "Gurmarin sensitivity of sweet taste responses is associated with co-expression patterns of T1r2, T1r3, and gustducin," Biochemical and biophysical research communications, 367, 356-363  Shimizu K., Ozeki M., lino A., Nakajyo S., Urakawa N and Atsuchi M (2001), "Structure-activity relationships of triterpenoid derivatives extracted from Gymnema inodorum leaves on glucose absorption", Japanese journal of pharmacology, 86, 223229  Shimizu K., Ozeki M., Tanaka K., Itoh K., Nakajyo S., Urakawa N., et al (1997), "Suppression of glucose absorption by extracts from the leaves of Gymnema inodorum," J Vet Med Sci, 59, 753-757  Singh Pragya, Faridi Uzma, Srivastava Suchita (2010), “ Design and Synthesis of CRing Lactone- and Lactam-Based Podophyllontoxin Analogues as Anticancer Agents”, Chem Pharm Bull, 58(2), 242-246  Smita Nair and R Keshavachandran (2006), “Genetic variability of chakkarakolli (Gymnema sylvestre R Br.) in Kerala assessedusing morphologycal and biochemical markers”, Journal of Tropical Agriculture, 44(1-2), 64-67  Smita Nair and R Keshavachandran (2006), “Molecular diversity in chakkarakolli (Gymnema sylvestre R Br.) assessed through isozyme and RAPD analysis”, Journal of Tropical Agriculture, 44, 31-36  Takhtajan A (2009), Flowering Plants, Springer Publication  The- Plant-List (2010), Version Published on the Internet, http://www.theplantlist.org/  Ulbricht C., Abrams T R., Basch E., Davies-Heerema T., Foppa I., Hammerness P., et al (2011), “An evidence-based systematic review of Gymnema (Gymnema sylvestre R Br) by the Natural Standard Research Collaboration”, Journal of dietary supplements, 8, 311-330  Vinay Kumar, Uma Bhandari, Chakra Dhar Tripathi, Geetika Khanna (2012), “Evaluation of antiobesity and cardioprotective effect of Gymnema sylvestre extract in murine model” Indian J Pharmacol, 44(5), 607–613  Xie JT, Wang A, Mehendale S, Wu J, Aung HH, Dey L, Qiu S, Yuan CS.(2003), “Anti-diabetic effects of Gymnema yunnanense extract”, Pharmacological research: The official journal of the Italian Pharmacological society, 47, 323-329  Xu H, Wang Z, Ding X, Zhou K, Xu L (2005), “ Differentiation of Dendrobium species used as “Huangcao Shihu” by rDAN ITS sequence analysis, Planta Med, 71: 1-3  Yan-Lin S, Wan-Geun P, Oh-Woung K, Soon-Kwan H (2010), “ The internal transcribed spacer rDNA specific markers for identification of Zanthoxylum piperitum”, African Journal of Biotechnology, Vol 9(37), 6027-6039  Zhang L, A.L Demain (2005), Natural products: Drug discovery and therapeutic medicine, Humana Press ...VŨ THỊ THANH THÚY BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA LỒI GYMNEMA SP Ở VIỆT NAM THƠNG QUA CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ ADN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người... khám phá liên quan đa dạng hình thái đa dạng di truyền Xuất phát từ thực tế này, đề tài: ? ?Bước đầu đánh giá đa dạng sinh học loài Gymnema sp Viêt Nam thơng qua thị hình thái thị ADN" tiến hành với... 36 4.1 Sự đa dạng hình thái mẫu Gymnema sp Việt Nam 36 4.2 Sự đa dạng trình tự ITS-rADN mẫu Gymnema sp Việt Nam 36 4.3 Về mối liên hệ hình thái trình tự ITS-rADN mẫu Gymnema sp