Dịnh danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. phân lập tại việt nam

Dịnh danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. phân lập tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHÓM NẤM

Trichoderma spp PHÂN LẬP

TẠI VIỆT NAM

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

“Không gì có thể so sánh được tình yêu tôi dành cho mẹ, ba, chị và em tôi, những người nắm giữ trái tim tôi trọn đời

Tôi luôn cảm thấy ấm áp bởi sự quan tâm và tình thương chân thành của những người thân tộc dành cho tôi

Không bao giờ quên sự quan tâm, chia sẻ và những lời dạy dỗ của Thầy TS Lê Đình Đôn, một người thầy lớn

Tôi luôn tự hào vì đã được học tập và rèn luyện ở trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nói chung và bộ môn Công nghệ sinh học nói riêng

Gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Nguyễn Văn Lẫm, chị Trần Thị Vân, Nguyễn Thị Thùy Dương, Phạm Thị Minh Kiều, Trịnh Thị Phương Vy và các Anh, Chị ở viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Luôn nhớ đến các bạn cùng lớp DH03SH với tôi và các bạn khoa Nông học cùng làm chung ở phòng 105, bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, những người thật đáng mến

Có những giai đoạn thật khó khăn trong cuộc sống và tôi thật may mắn có được người bạn đã chịu đựng và luôn làm tôi cảm thấy ấm áp Cảm ơn mày nhiều lắm Tuyền”

Nguyễn Thị Khả Tú

TÓM TẮT

Đề tài: “Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp phân lập tại Việt

Nam” do Nguyễn Thị Khả Tú thực hiện từ 19/3/2007 đến ngày 19/8/2007 tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phòng Công nghệ sinh học thực vật, viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Mục đích

Định danh tên loài 11 dòng nấm Trichoderma spp phân lập ở Việt Nam Phân nhóm và xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma spp Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma spp (Trichoderma) với

dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới

So sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng

Trichoderma bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm

TreeView 1.6.6

Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma

được so sánh với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6

Kết quả đạt được

Khẳng định tên loài chính xác 10 dòng Trichoderma

Thiết lập và thể hiện rõ được mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma 11 dòng Trichoderma Việt Nam thuộc 5 loài T longibrachiatum, T asperellum,

T atroviride, T harzianum, T virens (trừ dòng T asperellum (T6)) có quan hệ di

truyền khá xa so với các dòng trên thế giới 10 dòng có nguồn gốc bản địa và dòng

T asperellum (T6) là dòng ngoại lai du nhập vào nước ta Mối quan hệ di truyền

giữa 5 loài này là bền vững và phù hợp với mối quan hệ về hình thái

Kết luận

Với kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp trình tự vùng ITS – rDNA và

một phần vùng tef1 có thể định danh chính xác tên loài và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các loài cũng như các dòng trong cùng loài của Trichoderma

Sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA và nhất là trình tự một phần vùng tef1 có thể phân biệt giữa dòng Trichoderma bản địa với các dòng ngoại lai Mở ra triển vọng

cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo của phương pháp định danh trong đề tài

ABSTRACT

“Identifying and grouping of Trichoderma spp collected in Viet Nam”, thesis is

carried out by Nguyen Thi Kha Tu, from 19 Mar, 2007 to 19 Aug, 2007 at Plant Protection Pepartment, Argonomy Faculty, Nong Lam University and Phytobiotechnology Laboratory, Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University

This thesis was based on molds identified results then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA (Internal Transcribed Space –

rDNA) stable and apart of tef1 (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha)

funtional regions with their data on NCBI to identifying species and grouping of 11

Trichoderma genus Finally, ITS – rDNA and apart of tef1 regions of 11 Trichoderma genus were compared with their data at different ecological,

geographic areas on over the world to clear the genetic relationship

The results show that confirming exactly the species of 10 Trichoderma genus, T68 genus was identified T atroviride Establishing and clearing the genetic relationship among 11 Trichoderma genus In which, 11 Trichoderma genus in Viet Nam of 5 species T longibrachiatum, T asperellum, T atroviride, T harzianum ,

T virens (except T asperellum genus (T6)) have a rather far genetic relationship

from others in the world 10 genus orginated from locality and

T asperellum (T6) is the one migrated in our country Genetic relationship among 5

species is stable and suitable with morphological characteristics

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma 2

2.1.1 Phân loại 2

2.1.2 Nguồn gốc 2

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3

2.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học 4

2.1.5 Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng 4

2.2 Cấu tạo tế bào Trichoderma 6

2.3 Các phương pháp định danh tên loài nấm Trichoderma 7

2.4 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA 9

2.5 Giới thiệu về vùng tef1 10

2.6 Phương pháp định lượng nồng độ DNA bằng phân tử Mass 10

2.7 Các nghiên cứu có liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA 11

2.8 Các nghiên cứu có liên quan đến định danh và phân nhóm Trichoderma 13

Chương 3 15

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

3.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 15

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 15

3.10 Định danh tên loài các dòng Trichoderma 22

3.11 Phân nhóm tạo phổ hệ di truyền 24

3.12 Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới 24

Chương 4 25

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả ly trích DNA 25

4.2 Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 26

4.3 Kết quả định danh tên loài 27

4.4 Kết quả phân nhóm tạo phổ hệ di truyền 35

4.4.1 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 35

4.4.2 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA 37

4.5 So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI 39

4.6 Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới 41

Chương 5 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid

EDTA: Ethylene diamin tetracetic acid PCR: Polymerase chain reaction

RAPD: Random amplified polymorphism DNA RNA: Ribonucleic acid

SDS: sodium dodecyl sulfate

Taq: Thermus aquaticus

TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid TE: Tris ethylene diamine tetra acetate

Tm: Melting Tempereture (nhiệt độ nóng chảy) U: Đơn vị hoạt tính

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài 15

Bảng 3 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng 20

Bảng 3 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lượng dùng cho một phản ứng 21

Bảng 3 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 21

Bảng 3 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI 22

Bảng 3 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI 23

Bảng 4 1 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI 28

Bảng 4 2 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI 28

Bảng 4 3 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI 29

Bảng 4 4 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI 29

Bảng 4 5 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T33 với các loài trên NCBI 30

Bảng 4 6 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T2 với các loài trên NCBI 30

Bảng 4 7 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T14 với các loài trên NCBI 31

Bảng 4 8 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T85 với các loài trên NCBI 31

Bảng 4 9 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T88 với các loài trên NCBI 32

Bảng 4 10 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T6 với các loài trên NCBI 32

Bảng 4 11 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T68 với các loài trên NCBI 33

Bảng 4 12 Kết quả định danh tên loài các dòng Trichoderma của đề tài 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2 1 Khuẩn ty T harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường PDA

sau 2 – 3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) 3Hình 2 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI 9 Hình 3 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị

trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 20

Hình 3 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh

dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F 20

Hình 4 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích được, trên gel agarose

1 % ở 110V, 400A trong 20 phút 26

Hình 4 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích được sau khi pha

loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút 26Hình 4 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút, sản

phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thước 600 bp 27Hình 4 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản

phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F, có kích thước 320bp 27Hình 4 5 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA (A) và một phần vùng

tef1 (B) 36

Hình 4 6 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1– rDNA (A) và ITS2– rDNA (B) 38Hình 4 7 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS1(A) và ITS2– rDNA (B) với dữ liệu

của chúng trên thế giới 40

Hình 4 8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng Trichoderma

Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới 43

Hình 4 9 Kết quả so sánh trình tự một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma

Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới 42

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nấm Trichoderma là một loại nấm mốc có phổ đối kháng rộng đối với các loại

nấm gây bệnh hại cây trồng và có khả năng kích thích sự phát triển của bộ rễ cây

Việc khai thác tiềm năng của Trichoderma dưới dạng chế phẩm sinh học như một

tác nhân sinh học phòng trừ nhiều bệnh hại cây trồng, giúp cho cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn đã và đang được các nước trên thế giới trong đó có nước ta rất quan tâm nhằm tạo sản phẩm nông nghiệp không có dư lượng thuốc hóa học là một yêu cầu bắt buộc vì sức khỏe cộng đồng, xuất khẩu và cân bằng môi trường sinh thái, hướng đến một nền nông nghiệp bền vững Vì thế, việc định danh chính xác tên loài và xác định mối quan hệ di truyền của chúng trở nên thật cần thiết Nhưng

do hệ thống định danh và phân loại của Trichoderma vẫn chưa hoàn chỉnh nên việc

chỉ dựa đơn lẻ vào hình thái, trình tự vùng bảo tồn hoặc trình tự các vùng chức năng thì không thể định danh chính xác tên loài của chúng (Gary J Samuels, 2004)

Khóa luận tốt nghiệp này nhằm mục đích định danh tên loài với độ chính xác cao, bằng cách kết hợp kết quả định danh dựa vào hình thái với trình tự vùng bảo

tồn ITS – rDNA và một phần vùng chức năng tef1 (4th

large intron) mà phương

pháp định danh chỉ bằng hình thái không hoàn toàn chính xác Đồng thời, phân nhóm tạo phổ hệ di truyền để thành lập dữ liệu chi tiết về quần thể nấm

Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên lãnh thổ nước ta

1.2 Mục đích

Định danh tên loài và phân nhóm xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dòng

Trichoderma phân lập ở Việt Nam

Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở

các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới

1.3 Yêu cầu

Phục hồi 11 dòng Trichoderma từ những ống nghiệm lưu trữ nguồn nấm

Nuôi cấy và nhân sinh khối Trichoderma

Ly trích DNA từ sinh khối Trichoderma với độ tinh khiết cao

Thiết lập được quy trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer

ITS4 và ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Xác định được tên loài 11 dòng Trichoderma trên cơ sở kết quả định danh dựa

vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh mức độ tương đồng của trình tự vùng ITS

– rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) bằng phần mềm ClustalX 1.83

Phân nhóm và xác định được mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma thông qua việc so sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 bằng phần

mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6

Đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng ITS – rDNA và một

phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh

thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và phần mềm TreeView 1.6.6.

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma 2.1.1 Phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc

định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chưa được biết đầy đủ Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc trương hình thái; đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh

sản bào tử vô tính Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (trích dẫn của Clipson, N và cs, 2001) Đã có hơn 50 loài

Trichoderma khác nhau đã được tìm thấy Trichoderma được phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum

Trong đó, nhóm Saturnisporum không tìm thấy giai đoạn teleomorph (giai đoạn

sinh sản hữu tính, đây là một dạng biến dị từ sự tái tổ hợp do lai chéo ngoại huyết

như trong chu kì cận giới tính) và nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp có giai đoạn này độc lập, chỉ có 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph nên được gọi là Hypocrea, thường không được dùng với mục đích

kiểm soát sinh học (Gary J Samuels, 2004)

2.1.2 Nguồn gốc

Trichoderma được tìm thấy khắp mọi nơi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực

Bắc Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu

rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác

(Gary J Samuels, 2004) Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật Mỗi dòng nấm Trichoderme khác nhau có yêu cầu

nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E Harman, 2000)

2.1.3 Đặc điểm hình thái (Gary J Samuels, 2004)

Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh,

trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng

Hình 2 1 Khuẩn ty T harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường PDA sau 2 – 3 ngày

nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh)

Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định Cuống bào tử là

một nhóm sợi nấm bện vào nhau Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn

lạc (T koningii), có kích thước từ 1-7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như

bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm

Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống

sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy Đặc điểm nổi bật

của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như

T virens), vàng hay xanh xám Chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặc hình oval (với tỉ lệ

dài : rộng từ 1 – 1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1.4 µm), đa số các bào tử trơn láng Kích thước không quá 5 m

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà

T harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh

dưỡng Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của

Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên

chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học

2.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2.5 đến 9.5 Phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là

25 – 30 0C Một vài dòng phát triển tốt ở 35 0C Một số ít phát triển được ở 40 0C (Gary J Samuels, 2004) Theo Prasun K M và Kanthadai R (1997) hình thái

khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau Ở

35 0C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 37 0C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối

kháng với Trichoderma Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy

mầm Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary J Samuels, 2004)

Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng đột

biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa

dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma Vì thế, sẽ

tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E Harman, 2000)

2.1.5 Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng (Gary J Samuels, 2004)

Nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp., Fusarium spp và Crinipellis spp gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt,

sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như tiêu, bông, nho, bắp, đậu nành,

mận, táo, cà rốt, hành, rau diếp do có tính đối kháng với các nấm hại này bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, kí sinh với nấm hại hoặc tiết kháng sinh, enzyme (chitinase, β-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào nấm gây bệnh cây trồng

Tiết kháng sinh: T virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự

phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium spp Isonitriles được sản xuất bởi T hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh Ở một vài loài T atroviride và T viride tiết 6-pentyl alpha-pyrone

(α – pyrones) có hương dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự

nảy mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea Peptaibols do T polysporum, harzianum, koningii sản xuất

giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển

của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh T virens, koningii,

viride sản xuất sesquiterpenes và polyketides được T harzianum sản xuất Steroids

(viridin) là một độc tố thực vật có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế

sự nảy mầm của bào tử, được sản xuất bởi T virens

Ký sinh: Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hướng hoá

chất, nó ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa chất) Ngoài ra, vật kí sinh và vật đối kháng được

Trichoderma nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa

học (qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng)

Đồng thời, Trichoderma kí sinh vào và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình

thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase,

protease những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những

loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của

Trichoderma Không những thế, Trichoderma còn có khả năng tiết các enzyme

phân giải như chitinase, glucanase, protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi kí sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối kháng với nó Khi kí sinh vào cây

T asperellum tiết cellulase, cho phép nó tấn công những nấm như Phytophthora

spp và Pythium spp khi chúng bám vào cây trồng

Cạnh tranh: Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng,

làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động và dai dẳng

bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores) Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp và Sclerotina spp gây bệnh cho cây

(xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó

xâm nhập vào những mô khoẻ) Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp và Sclerotina spp Không những thế,

Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Phytium spp do dịch tiết của

cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Phytium spp (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Phytium spp bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium spp không thể nảy mầm Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách

chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh

Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng cải tạo đất trồng, làm tăng độ phì nhiêu

cho đất vì thế làm tăng năng suất cây trồng nhờ khả năng phân giải phospho khó tan có rất nhiều trong đất mà cây không hấp thụ đượcvà khả năngtiết các enzyme phân hủy chất hữu cơ như cellulase, glucanase thành các dạng dễ hấp thu Bên cạnh đó,

Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại bỏ mầm bệnh, làm tăng

sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động

đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzyme bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh

2.2 Cấu tạo tế bào Trichoderma

Nấm mốc nói chung (trong đó có Trichoderma) có thành tế bào cấu tạo chủ yếu

là chitin (là polymer của n – acetylglucosamine) và chitosan (chitin bị deacetyl hóa) và các thành phần khác gồm β – glucan, α – glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore, 2001), chất màu, lipid (8 – 33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999) Màng

tế bào dầy khoảng 7 µm thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%) Nhân phân hóa, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 – 3 µm Ty thể hình elip, luôn di động để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Lâm Thanh

Hiền, 1999) Những hiểu biết cơ bản về cấu tạo tế bào Trichoderma chính là cơ sở

để chúng tôi lựa chọn và cải tiến các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp với nghiên cứu của đề tài

2.3 Các phương pháp định danh tên loài của Trichoderma

Đến thập niên 1990, việc định danh và phân nhóm Trichoderma chỉ dựa vào đặc

điểm hình thái và đặc điểm sinh lý (đánh giá các isoenzyme) Năm 1969, Rifai đưa

ra các đặc điểm hình thái của tất cả các loài Trichoderma Sau đó, Bisett (1984,

1991a, 1991b, 1991c, 1992, 1998 (Gams và Bissett)) bổ sung các đặc điểm hình thái

của Hypocrea và Gliocladium, là teleomorphs của Trichoderma Phương pháp định

danh chỉ dựa vào hình thái không hoàn toàn chính xác do một vài loài Trichoderma

có đặc điểm hình thái rất giống nhau, chỉ khác nhau ở một vài đặc điểm rất khó nhận thấy và xác định như

Không có mùi dừa

Bào tử có hình tròn hoặc bán cầu

Bào tử hình oval

Không làm môi trường PGA có màu

Bào tử hình chữ nhật hoặc hình ellip Làm môi trường PGA có màu vàng

Cành bào tử mọc không vuông góc (nhỏ hơn 900)

Cành bào tử mọc vuông góc với trục chính

Phương pháp định danh và phân loại Trichoderma sau này được tăng cường

bằng phương pháp phân tử Kết hợp các maker phân tử (ITS1, ITS2, RAPD) với phân tích đă ̣c điểm sinh lý và kết quả phân nhóm dựa vào hình thái để phân tích các

teleomorphs của Trichoderma (Kuhls và cs (1996, 1997), Samuels (1996), Samuels

và cs (1998), Turner và cs (1997)) Năm 2004, Druzhinina Irina và cs đã bổ sung hệ

thống phân loại và phổ hệ di truyền của Trichoderma/ Hypocrea bằng cách kết hợp

hình thái với phân tích sinh lý và phân tử Hiện nay, vùng ITS – rDNA được xem là

cơ sở đáng tin cậy để phân nhóm và định danh Trichoderma Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA và đặc điểm hình thái thì rất khó phân biệt được T viride với

T koningii và T atroviride nhưng nếu phân tích thêm vùng tef1 (large intron) thì

hoàn toàn có thể phân biệt giữa chúng Phương pháp định danh GCPSR (Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition) là phương pháp dựa

vào mức độ tương đồng và vị trí phù hợp của dòng Trichoderma phân tích với các

dòng trong phổ hệ di truyền Phương pháp này cho kết quả định danh đáng tin cậy

và tiết kiệm được chi phí, thời gian hơn phương pháp định danh chỉ dựa vào hình

thái Năm 2002, Kullnig-Gradinger và cs sử dụng 4 vùng ITS– rDNA, mitssuDNA,

tef1 (short intron thứ 5) và ech42 (large exon) để đánh giá phổ hệ di truyền của các

loài Trichoderma và cho kết quả rất đáng tin cậy Tuy nhiên, trong định danh bằng phân tử đòi hỏi dữ liệu Trichoderma trên GenBank phải nhiều và đầy đủ các loài

Nhưng ngay cả khi đòi hỏi này được đáp ứng thì vẫn xảy ra trường hợp trình tự vùng ITS – rDNA của dòng cần định danh khi sử du ̣ng công cu ̣ Blast trên NCBI thì có độ tương đồng cao với quá nhiều loài Do đó, hình thái vẫn luôn là nền tảng để

định danh, phân nhóm Trichoderma và phương pháp phân tử chỉ để xác nhận hoặc

phân biệt những loài mới (Kubicek C.P và cs, 2003)

Hình 2 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có

mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI

2.4 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA

rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và không mã hoá cho bất kỳ protein nào Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hoá, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế

trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường không chính xác và cần khoảng thời gian dài (Guarro và cs, 1999)

rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S và IGS (Intergenic Spacer, là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA) Vùng 5.8S – rDNA có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi (Szymanski và cộng sự, 2001) Vùng ITS – rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các biệt hoá trong cùng loài để lập phổ hệ di truyền (Guarro và cs, 1999)

Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật cùng giới nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh, tạo phổ hệ di truyền Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và ctv, 1996) Các primer chúng tôi sử dụng trong đề tài này cũng được thiết kế theo hai dạng trên Vùng ITS, các primer được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn 18S, 5.8S và 28S Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế, sàng lọc dựa trên

vùng 5.8S – rDNA của N crassa, Schizosaccharomyces pombe và S cerevisiae,

Vicia faba chuột Vùng 28S – rDNA của S prombe, S cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4 Primer ITS5 có trình tự dựa vào vùng 18S –

rDNA của N crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White và cs, 1989)

2.5 Giới thiệu về vùng tef1

Là vùng gen có chức năng mã hóa tạo protein elongation factor – 1α, protein này là nhân tố tham gia vào việc kéo dài chuỗi peptide Đây là vùng mang tính bảo thủ cao với số bản sao thấp, có chức năng chuyên biệt và đặc trưng cho từng loài

Trichoderma Do đó, nó được dùng để định danh chính xác tên loài và phân biệt

giữa các nhóm với nhau hay giữa các loài cùng nhóm Trichoderma (Gary J

Samuels, 2005)

2.6 Phương pháp định lượng nồng độ DNA bằng phân tử Mass

Phương pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lượng so với band của

phân tử Mass Mẫu định lượng cần phải được pha loãng một , hai , ba , …, n lần Sau đó, các mẫu pha loãng được kiểm tra bằng điện di và được so sánh với phân tử Mass, cho đến khi đạt được sự tương đương về kích thước và độ sáng giữa band của mẫu pha loãng với band của Mass Từ đó, xác định được nồng độ của mẫu pha loãng và tính được nồng độ của mẫu gốc do có hệ số pha loãng

Bảng 2.1 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng)

2.7 Các nghiên cứu có liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA

Palmer và cs (1990) đã so sánh trình tự SSU – rDNA (Small Subunit – rDNA) của nhân, ty thể và lục lạp của thực vật hạt kín Kết quả cho thấy trình tự 18S – rDNA của nhân là có nhiều biến đổi nhất Đến năm 1991 và 1992, Bruns và cs đưa ra liên tiếp các nghiên cứu trên vùng rDNA để phân nhóm, nhận biết tính đa

Hình 2 3 Thang chuẩn về nồng độ của

phân tử Mass (Bio- Rad)

2,5 µl mẫu chuẩn được pha loãng với 10 µl loading buffer và TE được bơm vào gel agarose 1,8 % Gel này được đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X Gel được ngâm trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg/ ml EtBr) trong 15 phút và được giữ trong nước 30 phút

dạng và mối quan hệ di truyền của những loài nấm sợi khi so sánh sự thay đổi trình tự của vùng SSU – rDNA (18S) Dựa trên trình tự vùng 18S, 5.8S và ITS – rDNA,

Berbee và cs (1995) đã chứng minh Penicillium spp., Aspergillus spp và

Paecilomyces spp thuộc lớp Trichocomaceae Năm 1991, Bruns và cs phân tích

trên vùng SSU – rDNA và chia giới nấm thành 4 lớp Acrasiomycota, Myxomycota,

Oomycota, và Fungi Cũng dựa vào phân tích trên vùng này, người ta cũng đã

chứng minh Schizosaccharomycetales có nguồn gốc từ lớp Myxomycota (Guarro và

cs, 1999) Khi phân tích trên vùng LSU – rDNA (Large Subunit – rDNA, 24S),

Wakefield và cs (1992) cho rằng P carinii thuộc lớp nấm men Basidiomycete trong

khi trước đó người ta thường lầm tưởng loài này thuộc nhóm động vật nguyên sinh Năm 1994, Leclerc M.C và cs kết hợp so sánh trình tự vùng LSU – rDNA và

SSU – rDNA đã chứng minh S apiospermumand S prolificans có quan hệ về di

truyền Muthumeenakshivà cs (1994) đã chứng minh có sự đa hình trên các dòng T

harzianum khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS – rDNA

Dùng nấm Trichoderma chống bệnh cho cây bông, khoai tây và một số cây trồng khác, do Trichoderma có sự cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh: thối rễ cây

hoà thảo, thối đen rễ cây bắp cải, dưa leo, cà chua, bầu bí, bệnh chết ẻo trên cây họ đậu, bệnh chết rạp trên cây thuốc lá, bệnh héo cây ở cây bông, dưa hấu, cây ăn trái và hàng loạt các bệnh do nấm gây ra (Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương

Giang 1997) Năm 1998, Nguyễn Thị Thuần đã chứng minh nấm Trichoderma có

hiệu quả trong phòng trừ bệnh cây trồng do các nấm hại cây trồng Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997) và Nguyễn Thị Thuần (1999) đã đề xuất

những loại môi trường và điều kiện nhân sinh khối nấm Trichoderma với giá thành

thấp từ những vật liệu rẻ tiền để tạo chế phẩm sinh học

Gary E Harman (2000), nghiên cứu cơ chế tạo các enzyme phân huỷ lớp

cellulose hay chitin như cellulase, chitinase, β – 1,3 glucanase của Trichoderma để

xác định gene mã hóa cho các enzyme này, đáp ứng cho nghiên cứu tạo dòng, loại bỏ hoặc gia tăng số lượng bản sao của gene vì thế tăng lượng enzyme sản sinh ra hoặc biến nạp vào trong cây làm gia tăng khả năng kháng bệnh cho cây Đồng thời,

khi cây được bón vào rễ T harzianum (T-22) thì giảm 40% lượng phân đạm cần bón cho một vụ bắp Ngoài ra, Trichoderma còn làm tăng sự nảy mầm và phát triển

của cây, giúp cho bộ rễ phát triển mạnh hơn và giúp bắp, cải trở nên kháng tốt với khô hạn và có hiệu lực cao trong sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào trong đó cellulase dùng trong xử lý phân cắt polysaccharide (là chất được sử dụng nhiều trong chế biến lương thực, thực phẩm và trong công nghiệp sợi) để làm tăng độ mềm và độ trắng của vải bông trong công nghiệp sợi Enzyme này cũng được sử dụng trong thức ăn gia cầm để tăng sự tiêu hoá hemicellulose của lúa mạch hay từ những loại tinh bột khác

Trichoderma còn được sử dụng để phân giải rác sinh hoạt và các phế thải nông

nghiệp nhờ khả năng tiết ra cellulase, enzyme này bền nhiệt hơn vi khuẩn (Nguyễn

Xuân Thành, 2003) Ở viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam, Hoàng Hưng Tiến

(2005) [49], đang tiến hành nghiên cứu “gây tạo và chọn lọc đột biến Trichoderma chống chịu thuốc trừ nấm hóa học tồn lưu trong đất canh tác bằng tia cực tím” [38]

Lê Đình Đôn và cs (2006) đã đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm bệnh hại cây

trồng trong điều kiện đồng ruộng của T virens, T harzianum và T asperellum (có

nguồn gốc trong nước) Thiết lập hoàn chỉnh quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học của ba loại nấm này và đã đăng ký thương mại ba chế phẩm

“Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh” và “BIO – TRI”

với bản quyền thuộc trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, góp phần tạo sản phẩm nông nghiệp an toàn trong sử dụng

2.8 Các nghiên cứu có liên quan đến định danh và phân nhóm Trichoderma

Năm 2002, Christian P Kubicek và cs giải mã trình tự vùng ITS – rDNA và một

phần vùng tef1 (5th

large intron, khuếch đại bằng cặp primer tef1fw và tef1rev) trên 96 dòng nấm được phân lập từ những địa điểm khác nhau ở Đài Loan, Indonesia,

Campuchia, Thái Lan, Burma, Malaysia và Singapore Kết luận 37 dòng là T

harzianum, 16 dòng T virens, 8 dòng là T spirale, T asperellum có 4 dòng, T koningii có 3 dòng, T atroviride có 3 dòng, 1 dòng là T hamatum, 1 dòng là T ghanense và 2 dòng là Hypocrea jecorina (anamorph là T reesei) Và xác định sự

tương quan, mối quan hệ di truyền của chúng, trong 4 loài T harzianum, T virens,

T asperellum và T atroviride thì T harzianum có quan hệ di truyền gần với T virens nhất và T asperellum với T atroviride có mối quan hệ di truyền gần nhau

nhất Đồng thời, xác nhận phổ hệ di truyền từ đặc điểm hình thái tương đồng với

phổ hệ di truyền phân tử vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron).Cũng vào năm này, Christopher R Thornton và cs cũng sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA để xác định mối quan hệ di truyền của các loài phân lập được Trong 5

loài T longibrachiatum, T harzianum, T virens, T asperellum và T atroviride thì

T harzianum cũng có quan hệ di truyền gần với T virens nhất và T asperellum với T atroviride cũng có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất, đồng thời T longibrachianum có mối quan hệ di truyền khá xa với các loài còn lại

Khi nghiên cứu trên 83 dòng nấm, Gary J Samuels (2005) dựa vào hình thái

nhận diện 72 dòng là Trichoderma và 19 dòng chưa xác định chính xác có phải đó là Hypocrea hay không Khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2, đọc trình tự và so

sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định tên loài Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA sẽ ko hoàn toàn chính xác vì các loài vẫn có sự tương đồng lớn về trình tự vùng này do đây là vùng bảo tồn Do đó, việc xác định vùng gen chuyên biệt hơn

như vùng gene mã hoá actin (act1), calmodulin (cal1), endochitinase 42 (ech42) và vùng tef1 sẽ giúp việc định danh chính xác hơn, phân biệt được giữa các nhóm với

nhau hay giữa loài cùng nhóm Lại Hà Tố Hoa (2006), khuyếch đại vùng

ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với 2 cặp primer ITS4 – ITS5 và ElongR – ElongF của dòng Trichoderma T4 (được TS Lê Đình Đôn và cs phân lập và định

danh bằng hình thái tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ mẫu đất tại huyện Củ Chi, Tp HCM), giải

trình tự và so sánh với những dòng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và khẳng định tên loài của dòng T4 là Trichoderma asperellum Có mức độ tương đồng của vùng ITS – rDNA và vùng tef1fw – tef2rev cùng là 98%

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Là 11 dòng Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau ở Việt

Nam, đã được định danh bằng hình thái và xác định tính đối kháng với các nấm gây bệnh hại cây trồng bởi TS Lê Đình Đôn và cs, tại bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, dựa theo khóa phân

loại Trichoderma của Gary J Samuels (2004) và tiêu bản chuẩn

Bảng 3 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài Ký

hiệu

Tên loài định danh dựa vào

hình thái

Địa điểm phân lập (Quận-Huyện, Tỉnh-Thành phố (đối tượng

lấy mẫu))

Tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng

Tp.HCM (đất)

Sclerotium rolfsii (+++)* Pythium spp (+++) Phytophthora spp (+)*

Đồng (sầu riêng)

Rhizoctonia solani (+++) Pythium spp (+++)

Pythium spp (+) Phytophthora spp (++)*

Pythium spp (++) Phytophthora spp (++)

Sclerotium rolfsii (++)

T37 T sinensis Đồng Nai (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++)

Fusarium spp (+++) Phytophthora spp (+++)

Sclerotium rolfsii (+++)

T68 T atroviride Bình Phước (đất rừng)

Sclerotium rolfsii (+++) Rhizoctonia solani (+++)

Fusarium spp (+)

(*): (+++) đối kháng mạnh, (++) đối kháng trung bình, (+) đối kháng yếu

3.2 Hoá chất

Môi trường CAM để lưu trữ nguồn Trichoderma: thành phần gồm bột bắp (30

g), đường dextrose (20 g), agar (15 – 20 g) và nước cất vừa đủ 1 lít

Môi trường PGA (Potato Glusose Agar) để phục hồi Trichoderma: thành phần

gồm khoai tây (200 g), glucose (20 g), agar (15 – 20 g) và nước cất vừa đủ 1 lít

Môi trường nhân sinh khối Trichoderma: thành phần gồm yeast extract (5 g),

KH2PO4 (0.5 g), K2HPO4 (0.5 g), MgSO4 (0.5 g), glucose (20 g), CaCl2 (rất ít) và nước cất vừa đủ 1 lít

Ly trích DNA tổng số Trichoderma: nitơ lỏng, lysis buffer, phenol/ chloroform/

isoamyl alcohol (25: 24: 1), chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), isopropanol, ethanol 70 %, dung dịch TE 1X

Hoá chất cho điện di: gel agarose (gồm glucose và agar), đệm TAE 0.5X (dùng

để pha gel và làm buffer chạy điện di), ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích) và blue loading dye 6X (Promega)

Hoá chất cho phản ứng PCR (Promega): Taq DNA polymerase, 10X PCR

buffer, dNTP, MgCl2, forward primer và reverse primer

3.3 Dụng cụ và thiết bị

Bình tam giác (250 ml, 500 ml (Đức)), giấy nhôm, nồi nấp khử trùng Tommy (Mỹ), máy lắc định ôn, máy vortex (IKA Works), ống nghiệm dung tích 15 ml (Đức), bộ cối chày nghiền mẫu (Đức), micropipette (10 l, 100 l, 1000 l (Đức)), tủ lạnh (-70 0

C, -20 0C, - 4 0C (Sanyo – Nhật)), máy cất nước 2 lần, máy chụp gel (Biorad – Mỹ), cối sứ và chày giã (Đức), eppendorf (0.2 ml, 05 ml, 1.5 ml (Mỹ), cân phân tích 4 số (Ohaus – Mỹ), máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc), pipet các loại (Nichiryo – Nhật), máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức), bồn ủ nhiệt (Memmert), máy điện di (Cosmo Bio Co – Nhật) và lò viba (Electrolux – Thụy Điển)

3.4 Phục hồi các dòng Trichoderma: từ những ống nghiệm lưu trữ nguồn

Cách pha 1 lít môi trường PGA: 200 g khoai tây được gọt vỏ cắt nhỏ và đun sôi,

lọc qua vải để chỉ lấy phần dịch nước Thêm vào đó lượng glucose, agarose như trên và lượng nước cho vừa đủ 1 lít Đun hỗn hợp trên cho đến khi agarose và glucose tan ra đều Môi trường PGA được cho vào bình tam giác và hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút bằng autoclave Để môi trường nguội bớt rồi đổ khoảng 15 ml môi trường vào đĩa petri sạch (90 mm), để nguội môi trường sẽ đông cứng lại

Dùng que cấy lấy những bào tử từ ống lưu trữ nguồn Trichoderma, đặt lên giữa mặt thạch PGA trong đĩa petri Sau 2 – 3 ngày các khuẩn ty Trichoderma sẽ mọc

bên trên bề mặt đĩa

3.5 Nhân và thu sinh khối Trichoderma

Nhân sinh khối Trichoderma: trong môi trường nhân sinh khối nấm lỏng lắc

Chuẩn bị môi trường: Tất cả các thành phần môi trường được cho vào một với lượng nước cất vừa đủ dung lượng cần thiết, khuấy đều Cho vào mỗi bình tam giác 100 ml môi trường Hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 0C Để nguội

Cắt 2 khoảng nhỏ thạch chứa sợi nấm mọc trên môi trường PGA cho vào

những bình tam giác trên Rồi đem lắc với cường độ 150 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng, để sợi nấm tiếp xúc tối đa với môi trường vì thế sợi nấm luôn ở trạng thái sinh trưởng mạnh nên không mọc bào tử Lắc liên tục cho đến khi sợi nấm mọc nhiều và đều khắp môi trường (khoảng 2 – 3 ngày), dừng lại và thu lấy sợi nấm

Cách thu lấy sợi nấm: Dùng vải và phễu lọc đã hấp khử trùng và sấy khô để

lọc thu lấy phần sợi nấm, vắt kiệt nước rồi bỏ vào giấy bạc, cán mỏng để khi nghiền trong nitơ lỏng được dễ dàng, bảo quản ở -70 0

C

3.6 Ly trích DNA tổng số Trichoderma

Tham khảo tài liệu của Sambrook và cs (1989), chúng tôi ly trích DNA nấm

Trichoderma theo phương pháp Lysis buffer có cải tiến cho phù hợp điều kiện

nghiên cứu Lượng mẫu cần ly trích chiếm 1/ 3 thể tích mỗi ống nghiệm

Bước 1: Nghiền sinh khối Trichoderma trong nitơ lỏng đến khi mịn, cho vào các

ống nghiệm (thể tích 15 ml)

Bước 2: Thêm vào 3 ml lysis buffer Trộn đều, ủ ấm ở 65 0C trong vòng 1 – 2 giờ Bước 3: Tiếp tục thêm vào 1 ml phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1) Nhẹ nhàn lắc đều Ly tâm 10 phút với tốc độ 4000 vòng/ phút ở 10 0C Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác

Bước 4: Thêm vào 1 ml chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) Trộn đều, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút trong 10 phút ở 10 0C Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác

Bước 5: Thêm vào một lượng isopropanol tỉ lệ khoảng 0.6 tổng thể tích của ống nghiệm Đảo đều, nhẹ, để qua đêm ở -20 0C (hoặc để nhiệt độ phòng 5 – 10 phút) Bước 6: Dùng que thu DNA tủa thành cụm ở đáy ống

Bước 7: Rửa tủa DNA trong ethanol 70 %, lập lại 3 – 4 lần

Bước 8: Phơi tủa DNA thật khô (trong 2 – 3 giờ) Pha loãng bằng 1 ml TE 1X

3.7 Kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA

Để kiểm tra kết quả ly trích có thu được DNA tổng số hay không và DNA pha loãng có nồng độ thích hợp để thực hiện phản ứng PCR hay chưa, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm ly trích và pha loãng trên gel agarose 1%

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1 %, cân 0.25 g agarose cho vào 25 ml TAE 0.5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650 W trong 2 phút Để chai nguội lại khoảng 50 – 60 0C, đổ vào khuôn thật bằng phẳng có gắn lược 12 – 18 giếng Chờ gel đông (khoảng 15 phút), lấy lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu

Bước 2: Nạp mẫu, xác định các thông số điện di và đọc kết quả

Đối với DNA tổng số: Dùng micropipette hút lấy 2 l mẫu, trộn đều với 2 l

blue loading dye buffer 6X, hút tổng lượng thể tích là 4 l bơm vào 1 giếng trên gel agarose 1 % Làm tương tự với các mẫu khác Tiến hành điện di bảng gel đó trong dung dịch đệm TAE 0.5 X, hiệu điện thế 110 V, cường độ dòng điện 400 A trong 20 phút Sau đó, bảng gel được chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng tia tử ngoại (UV) của máy Gel doc 2000 (Biorad) và kết quả được đọc bằng phần mềm Quality One

Nếu sản phẩm ly trích có DNA tổng số thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng dưới dạng vạch Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA Từ đó, kết hợp với những hiểu biết về phương pháp định lượng nồng độ DNA bằng phân tử Mass (mục 2.8.3, phần 2 tổng quan tài liệu), chúng tôi có thể ước lượng nồng độ DNA ly trích được và dự đoán được độ pha loãng

Đối với DNA pha loãng: Mỗi mẫu lấy 4 l trộn với 2 l loading buffer 6X,

thao tác tiến hành tương tự như trên Kết quả thu được cho phép ta xác định được nồng độ cần thiết để chọn lấy và thực hiện phản ứng PCR

3.8 Phản ứng PCR

DNA làm khuôn: thu nhận qua quá trình ly trích DNA bộ gen của nấm

Trichoderma, sau đó pha loãng đến nồng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR

khoảng 15 – 20 ng/ µl

Primer: PCR khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 với primer ITS4 và ITS5

(White và cs, 1990) và dựa vào sơ đồ, cấu trúc primer trên toàn vùng tef1 do

Chaverri, P và cs thiết lập năm 2003, chúng tôi chọn cặp primer EF1 – 728F và

EF1 – 986R (Carbone và Kohn, 1999) để khuếch đại một phần của vùng tef1

Bảng 3 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng

Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’

Hình 3 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch

đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5

Hình 3 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip)

với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R

Các thành phần phản ứng PCR được phối trộn theo thứ tự được liệt kê ở bảng

bên dưới để đảm bảo hiệu quả cho phản ứng do Taq DNA polymerase khi trộn vào

hỗn hợp phản ứng PCR sẽ hoạt động ngay

Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: tham khảo, kết hợp và cải tiến quy trình của

Wang C Z (2002), White và cs (1990), Carbone và Kohn (1999) và VBI – CLF (2002) cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm

một cặp primer, trên band điện di không thể phân biệt được sự khác nhau giữa các dòng này, do đó cần phải giải trình tự sản phẩm PCR để phân tích

3.10 Định danh tên loài 11 dòng Trichoderma

Sản phẩm PCR của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng nấm

Trichoderma khảo sát được giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc Trình tự

vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát được

so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI Dựa vào độ tương đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng

Trichoderma khảo sát Dữ liệu trên NCBI được chúng tôi so sánh với nhau (bằng

phần mềm Clustal X 1.83) trong phạm vi từng loài để chọn ra trình tự ổn định nhất (không có đột biến) và 1 – 2 trình tự đột biến phổ biến (không có đột biến điểm đơn lẻ) Việc làm này nhằm loại bỏ hiện tượng trình tự dòng khảo sát có tỉ lệ tương đồng cao với trình tự đột biến của loài khác, sẽ làm nhiễu kết quả so sánh trình tự Các loài được sử dụng cho so sánh dựa theo tiêu chí

Loài được định danh dựa vào hình thái

Loài có đặc điểm gần giống về hình thái với loài định danh dựa vào hình thái

Bảng 3 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI Tên loài Mã số

truy cập

Địa điểm phân lập

AF362101 Hàn Quốc 19-03-2001 Park,D.S và cs

T koningii DQ313146 Canada 01-12-2005 Samuels,G.J và cs

T virens

T atroviride AF348112 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J và cs

T harzianum

T koningii DQ288997 Ecuador 14-11-2005 Samuels,G.J và cs

T tomentosum AY750882 Canada 14-09-2004 Samuels,G.J

3.11 Phân nhóm xá c đi ̣nh mối quan hê ̣ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma

Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng

Trichoderma Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm

Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6 từ đó phân nhóm xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng

3.12 Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ

liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới

Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma

phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả

bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả ly trích DNA tổng số Trichoderma

Ly trích DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này Đối với

Trichoderma, việc ly trích gặp nhiều khó khăn do thành tế bào rất mỏng và mềm vì

được cấu tạo chủ yếu bằng chitin thay vì cellulose như ở thực vật do đó rất dễ vỡ trong quá trình nghiền, bên trong tế bào chất lại chứa hàm lượng lớn polysaccharide, protein và lipid.

Qui trình ly trích DNA của chúng tôi đơn giản nhưng vẫn thu được DNA có độ tinh khiết cao Do ở qui trình này, mẫu được nghiền trong nitơ lỏng (giúp bảo vệ thành tế bào) đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra, tạo điều kiện thuận lợi cho lysis buffer tác dụng phá thành tế bào Mặt khác, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1), sau đó thêm bước sử dụng chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) giúp DNA tách ra khỏi protein và loại hết loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA có trong mẫu và phenol còn sót lại Đồng thời, chúng tôi ly tâm tốc độ thấp (4000 vòng/ phút) kết hợp với kéo dài thời gian vừa phải (10 phút) ở nhiệt độ thấp (10 0C) giúp giảm sự gãy của DNA nhưng vẫn đảm bảo sự phân lớp và tác dụng của các hóa chất

Ngoài ra, việc tủa DNA bằng isopropanol (lạnh) để qua đêm và bước dùng que thu tủa DNA mà không cần ly tâm giúp DNA bớt gãy vụng và thu được DNA tinh hơn Do đó, DNA ly trích được với độ tinh khiết cao, đảm bảo cho phản ứng PCR được xảy ra Dựa vào những hiểu biết về phương pháp “định lượng DNA bằng phân tử Mass” (mục 2.8.3), chúng tôi định lượng DNA ly trích được khoảng 150 ng/ µl

Hình 4 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích được,

trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút

Dựa vào band DNA thu nhận được từ kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma

ly trích được, tiến hành pha loãng DNA tổng số đến nồng độ thích hợp thực hiện phản ứng PCR Nồng độ DNA sau khi pha loãng khoảng 15 ng/ µl

Hình 4 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích được sau khi pha loãng 10 lần,

trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút

4.2 Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1

Dựa vào thang ladder cho thấy qui trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với

cặp primer ITS4/ ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F/ EF1 –

986R cho kết quả thể hiện bằng điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, có kích thước lần lượt là 600 bp và 320 bp Tất cả các mẫu đều xuất hiện band mong muốn và hoàn toàn không có band phụ, chỉ có 1 trong tổng số 11 mẫu với cặp

primer ITS4 và ITS5 cho band mờ (mẫu T88), mẫu này khi thực hiện PCR lại chúng tôi tăng lượng DNA khuôn lên gần gấp đôi (2.5 ml) thì kết quả PCR cho band sáng rõ, không có band phụ

Hình 4 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch

đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thước 600 bp

Hình 4 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch

đại một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R, có kích thước 320 bp

4.3 Kết quả định danh tên loài

Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát được so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI Dựa vào độ tương đồng di

truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài

của 11 dòng Trichoderma khảo sát

Dòng T37: được định danh dựa vào hình thái là T sinensis, kết hợp với kết quả

tính độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các

loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T37 là

Trichoderma longibrachiatum