Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt

Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000***

TRẦN VĂN KỲ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thưc hiện:

KS HOÀNG XUÂN QUANG

Thành phố Hồ Chí Minh

-2006-

NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

***000***

ISOLATING AND IDENTIFYING AGENT CAUSED Brassica

chinensis L LEAF SPOT DISEASE IN HO CHI MINH CITY

USING POLYMERASE CHAIN REACTION AND SEQUENCING 16S – 23S rDNA REGION

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

i

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:

 Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô

đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi

 TS Lê Đình Đôn và KS Hoàng Xuân Quang đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

 TS Bùi Minh Trí, Trưởng Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

 Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, anh chị đã sinh thành, dạy dỗ và ủng hộ tinh thần cũng như vật chất cho tôi

 Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

 Các bạn sinh viên thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh, trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 28 đã chia sẻ

cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

ii

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phương pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA” được thực hiện từ ngày 6 tháng 2 năm 2005 đến ngày 30 tháng 7 năm 2006 tại trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam

Đề tài do sinh viên Trần Văn Kỳ thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Lê Đình Đôn và KS Hoàng Xuân Quang

Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris gây

bệnh đốm lá trên cây cải ngọt Hiện nay, tại các vùng trồng rau ở Huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm lá đang gây thiệt hại rất lớn cho nông dân trồng rau cải ngọt Triệu chứng điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm nhỏ có kích thước 1 – 2 mm trên lá rau Khi bệnh phát triển, các đốm bệnh lớn dần, có thể lên kết lại dẫn đến lá rau bị vàng và chết Bệnh làm giảm năng suất cũng như chất lượng cây rau cải ngọt

Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự gen nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh sau này

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Phân lập tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu được từ các vùng trồng rau ở huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh

2 Dùng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen nhằm định danh tác nhân gây bệnh Kết quả thu được như sau:

1 Phân lập được 8 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá tại các vùng trồng rau thuộc huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, Tp HCM

2 Sử dụng kỹ thuật PCR đã khuyếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS làm vật liệu

giải trình tự và gen hrpF đặc trưng của vi khuẩn gây bệnh

3 Do hạn chế phương pháp giải trình tự gen không mang lại kết quả Tuy nhiên,

kết quả PCR cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas campestris pv campestris

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan nghiên cứu ngoài nước 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố 4

2.1.2 Tác nhân và triệu chứng bệnh 5

2.1.3 Tác động kinh tế của bệnh 6

2.1.4 Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh 7

2.1.5 Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh 8

2.1.6 Phương pháp phân lập và dịnh danh tác nhân gây bệnh 8

2.1.7 Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử……… 10

2.2 Tổng quan nghiên cứu trong nước 12

2.3 Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity) 13

2.3.1 Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity) 13

iv

2.3.2 Ribosome DNA (rDNA) 13

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 15

3.1 Thời gian và địa điểm 15

3.1.1 Thời gian 15

3.1.2 Địa điểm 15

3.2 Vật liệu 15

3.3 Hóa chất 15

3.3.1 Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn 15

3.3.2 Các hóa chất dùng trong điện di 16

3.3.3 Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) 16

3.3.4 Môi trường 17

3.4 Dụng cụ, thiết bị 17

3.5 Phương pháp 17

3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh 17

3.5.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh 18

3.5.3 Phương pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lưới 18

3.5.3.1 Phương pháp trồng cây kí chủ 18

3.5.3.2 Chủng bệnh 19

3.5.4 Phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn 20

3.5.5 Phương pháp PCR 20

3.5.5.1 Khuếch đại đoạn DNA trong vùng ITS của vi khuẩn 20

3.5.5.2 Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF 22

3.5.6 Phương pháp điện di và đọc kết qủa 22

3.5.6.1 Điện di trên gel agarose 22

3.5.6.2 Đọc kết quả điện di 22

3.5.7 Phương pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR 23

3.5.7.1 Chuẩn bị khuôn DNA 23

3.5.7.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) 24

3.5.7.3 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 25

3.5.7.4 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer 25

v

3.5.7.5 Quy trình tóm tắt các bước đọc trình tự 26

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh 27

4.2 Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lưới 28

4.3 Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn 31

4.4 Kết quả phản ứng PCR 32

4.4.1 Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS 32

4.4.2 Kết quả điện di tinh sạch sản phẩm PCR 32

4.4.3 Kết quả PCR khuếch đại vùng hrpF 33

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 39

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTAB :Cethyltrimethylammonium bromide EDTA :Ethyleneediamine tetraacetic acid ng : nano gram

cDNA : complementary DNA nm : nano mol

g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA

dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA

UI : unit international bp : base pair

Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau……… 26

Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dưới kính hiển vi soi nổi….…….……… 27

Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch……… 27

Hình 4.4Vết bệnh sau khi chủng và vết thương không bị nhiễm chụp dưới kính hiển vi soi nổi………28

Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và

bên trái bị nhiễm………29

Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn……… … 30

Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA……… 30

Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA……… 31

Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR……… 32

Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF……….………… 32

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây rau cải nằm trong họ thập tự được trồng phổ biến ở khắp châu Âu, Địa Trung Hải, nơi được coi là nguồn gốc của chúng (Nguyễn Văn Thắng, Trần Khắc

Thi, 1996) Chúng được sử dụng rộng rãi làm thức ăn cho người và gia súc, làm nguyên liệu nghành dược Cây cải chiếm vị trí quan trọng bậc nhất trong ngành rau nhờ chủng loại phong phú, sản lượng cao, thích nghi rộng rãi với điều kiện thời tiết, đất đai khác nhau, dễ vận chuyển, cất giữ lâu, dễ ăn, dễ chế biến và nấu

nướng

Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày của con người, đặc biệt là với các dân tộc Châu Á và nhất là với người Việt Nam Dù ở đâu – trong nước hay ngoài nước – bữa ăn của người Việt Nam luôn có món rau với số lượng nhiều hơn so với của các dân tộc khác Có lẽ vì vậy mà người Việt trẻ hơn, đẹp hơn so với người cùng lứa tuổi của các châu lục khác

Theo sự phát triển của đời sống xã hội, nhiều nhà dinh dưỡng học của Việt Nam cũng như của thế giới nghiên cứu về khẩu phần thức ăn cho nguời Việt Nam đã tính rằng hàng ngày chúng ta cần khoảng 2300 – 2500 calo năng lượng để sống và hoạt động Để có được năng lượng này, nhu cầu tiêu dùng rau hằng ngày trung bình cho một người phải vào khoảng 250 – 300 g (tức là khoảng 7,5 – 9 kg/người mỗi tháng) Còn nghiên cứu của nhà khoa học Pháp, ông Dorolle từ năm 1942 đã tính là khoảng 360 g/ngày (tức là khoảng 10,8 kg/một tháng cho mổi người) Theo các số liệu thống kê thì hiện nay tính bình quân chung cả nước chúng ta mới sản xuất được khoảng 4 – 5 kg/người mỗi tháng (không tính phần sản xuất tự túc trong dân) (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996)

Nhưng tác dụng của rau không phải là bảo đảm số calo chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng mà là cung cấp đủ chất xơ (xenlulo) để kích thích hoạt động của nhu mô ruột và các sinh tố (vitamin) cho cơ thể

Ở phía nam nước ta, cải ngọt được trồng nhiều ở các tỉnh như: Tp HCM, Đồng Nai, Lâm Đồng, Long An Cùng các loại rau khác, cải ngọt đã mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho đời sống con người như cung cấp rau tươi, bổ sung nguồn dinh dưỡng, chất xơ cũng như các loại vitamin Trong một vài năm trở lại đây, do tốc độ đô thị hóa diễn

ra nhanh, các khu công nghiệp tập trung số lượng lớn công nhân, do vậy nhu cầu

lượng rau xanh hàng ngày rất lớn Chính vì vậy, cây cải ngọt (Brassica chinensis L.)

được nông dân quan tâm, chọn trồng nhiều do chúng có những đặc tính sinh trưởng phù hợp cho việc thu hoạch thường xuyên như: thời gian sinh trưởng ngắn (30 – 35 ngày), trồng được quanh năm, có nhiều giống trồng trong cả mùa khô và mùa

mưa, năng suất cao, đáp ứng được nhu cầu của thị trường

Đối với cây cải ngọt, do hàm lượng nước lớn, trên 90% (Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985) nên là ký chủ thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật gây bệnh như nấm, vi khuẩn Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên cây cải ngọt bao gồm: vi khuẩn gây thối nhũn, cháy lá chữ V, đốm lá Bệnh đốm lá vi khuẩn không phải là đối tượng quan trọng Nhưng hiện nay, khi diện tích gieo trồng tăng, trồng nhiều vụ trong năm, có sự tích lũy nguồn bệnh qua các vụ, nó trở thành vấn đề được nhiều người quan tâm

Triệu chứng ban đầu của bệnh là các đốm nhỏ xuất hiện ở bề mặt dưới của lá Vết bệnh dạng tròn, sũng nước, đường kính từ 1 – 3 mm Vết bệnh lúc già thì phần mô ở giữa bị hoại tử, nhìn mặt trên lá sẽ thấy các đốm màu nâu Bệnh cũng xuất hiện ở phần thân và cuống lá làm cho lá bị cong lại và vết bệnh có màu đen

Bệnh làm giảm năng suất, giá trị thương phẩm của rau, giảm thời gian bảo quản nên giá trị kinh tế không cao Hơn nữa, ngoài cải ngọt, bệnh cũng gây hại trên khá nhiều các loại cây trồng khác cùng họ thập tự như: cải bắp, súp lơ, cải thảo, cải xanh Chính vì vậy, xác định được tác nhân gây bệnh là việc cần thiết nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng trừ sau này

Đó là lý do tôi chọn thực hiện đề tài: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh

đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA” Đề tài là một phần trong chương trình nghiên cứu bệnh vi khuẩn

trên cây họ thập tự của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Đại Học Nông Lâm Tp HCM

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích

Định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt làm cơ sở cho các nghiên

cứu sâu hơn sau này nhằm phòng trừ bệnh có hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho nông dân trồng rau

1.2.2 Yêu cầu

- Thu thập mẫu bệnh phẩm tại các vùng trồng rau Củ Chi, quận 12, Hóc Môn - Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm

- Chủng bệnh trên cây rau cải trồng trong nhà lưới

- Chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh trong số các dòng thu thập được dựa vào kết quả chủng bệnh

- Ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR định danh tác nhân gây bệnh - Đọc trình tự vùng 16S – 23S rDNA

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố

Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây rau họ thập tự phân bố rộng rãi, chúng đã được ghi nhận là có mặt ở khoảng 85 quốc gia khắp Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ và Nam Mỹ (Bradbury, 1986)

Bệnh được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1929 trên cây cải ngựa, năm 1930 phát hiện trên củ cải trắng và củ cải đỏ (Youfu Zhao và ctv, 2005) Bệnh cũng được tìm thấy ở nhiều vùng thuộc nước Mỹ như Riverside, Santa Barbara, Santa Clara (Matsumoto, 1975)

Bệnh này được ghi nhận gây hại trên họ thập tự ở Argentina (Gaetan, 1995) và ở

Brazil trong năm 1992 (Leit, 1994) Ở miền bắc Ấn Độ trong những năm từ 1989 – 1992 bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên cây cải bông (Shyam, 1994) Vi kuẩn

gây bệnh đã được tìm thấy từ hạt cải bắp ở Nhật Bản năm 1988 (Shiomi, 1992) Ở Hàn Quốc, đốm lá là bệnh quan trọng trên cây cải bắp (Kim, 1986) Schaad và Taveechi (1983) đã báo cáo rằng: bệnh xuất hiện ở vùng phía bắc, tây bắc và miền trung Thái Lan

Theo CPC (Crop protection compendium) (2001) cho đến nay, bệnh đã xuất hiện trên nhiều quốc gia khác nhau Ở châu Âu bao gồm: Bungary, CH Séc, Đan Mạch, Pháp, Đức, Hy Lạp, Hungary, Iceland, Ireland, Ý Hà Lan, Na Uy, Bồ Đào Nha, Rumani, Nga, Thụy Điển, Thụy Sĩ, Anh Ở châu Á bao gồm các quốc gia như: Brunei, Cam Pu Chia, Trung Quốc, Đài Loan, Tây Tạng, Ấn Độ, Inđônêxia, Iran, Nhật, Hàn Quốc, Malayxia, Nêpan, Philippin, Srilanka, Thái Lan, Thổ Nhĩ Kỳ, Uzbêkistan và Việt Nam Châu Phi gồm có: Angola, Ethiopia, Ghana, Kenya, Libya, Malawi, Mauritius, Morocco, Mozambique, Seychelles, Somalia, Tanzania, Togo, Uganda, Zimbabwe Ở vùng tây bán cầu có các quốc gia như: Argentina, Barbados, Bermuda, Bolivia, Brazil, Parana, Canada, British Columbia, Costa Rica, Cuba, Dominica, El Salvador, Guatemala, Haiti, Honduras, Jamaica, Mexico, Nicaragua, Panama, Puerto Rico Ở nước Mỹ, bệnh xuất hiện ở các bang như: California, Florida, Georgia, Hawaii, Illinois, Michigan, New York, Washington, Wisconsin Ở châu Đại Dương bệnh xuất hiện ở American Samoa, New South Wales Ở Úc, bệnh xuất hiện ở các khu vực như: Queensland, Nam Úc, Tây Úc Ngoài ra, bệnh cũng được ghi nhận là đã có mặt Cook Islands, Fiji New Caledonia, New Zealand, Norfolk Island, Papua New Guinea, Tonga

Như vậy, chúng ta thấy rằng đây là bệnh phân bố khá rộng rãi, hầu như chúng có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới

2.1.2 Tác nhân và triệu chứng bệnh

Theo Lowell L Black (2000), bệnh do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae gây nên Bệnh xuất hiện trên tất cả các loại cây trồng thuộc họ thập tự và

một số giống cải hoang

Triệu chứng chính của bệnh là đốm trên lá thật, đôi khi bệnh cũng xuất hiện trên lá mầm, bông, cuống lá và bắp của cây cải bắp Các đốm nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá do sự xâm nhiễm qua lỗ khí khổng của vi khuẩn hoặc rìa mép lá do quá trình xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng Vết bệnh ban đầu là các lỗ nhỏ sũng nước, về sau khi triệu chứng bệnh điển hình, đường kính vết bệnh có thể lên đến 3 mm và có dạng hình tròn Bao quanh vết bệnh là vành màu nâu sáng, khi bệnh già ở giữa có vùng hoại tử màu trắng Vết bệnh trên gân, cuống lá thường có dạng sọc đen dài

Youfu Zhao và ctv (2000, 2002) đã phân lập các vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên các

cây trồng họ thập tự ở Oklahoma (cải bắp, cải rổ, cải củ, cải thìa) là Xanthomonas campestris pv armoraciae, Xanthomonas campestris pv campestris, Pseudomonas syringae pv maculicola Trong đó hai loài vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae, Xanthomonas campestris pv campestris là những tác nhân quan

trọng những vi khuẩn này cùng tồn tại và phát triển trên đồng ruộng

Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris thuờng gây triệu chứng cháy lá

chữ V (V – shape), đôi lúc cũng có triệu chứng đốm lá, nếu xâm nhiễm qua lỗ thủy

khổng Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae gây triệu chứng đốm lá Đối với bệnh đốm lá do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv maculicola gây triệu

chứng đốm lá, vết bệnh thường không định hình, kích thước vết bệnh khoảng 2 mm, khi nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau, đường kính vết bệnh có thể lên tới 1 cm Màu sắc vết bệnh thường có dạng sũng nước, viền úa vàng bao quanh vết bệnh

Trong nghiên cứu của mình về bệnh đốm lá trên cây canola (Brassica napus), một

loại cây trồng thuộc họ thập tự, S Geatan, N Lopez (2005) đã xác định rằng, tác nhân

của bệnh này là do vi khuẩn Xanthomonas campestris gây nên Vi khuẩn xâm nhiễm

qua lỗ khí khổng tạo nên các vết đốm hoại tử Triệu chứng bệnh đôi lúc có dạng cháy lá chữ V, đó là kết quả của sự xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng ở mép lá

Từ tháng 12 năm 2001, K Pernezn, E Dickstein phát hiện dịch bệnh đốm lá cải bắp ở trang trại vùng Everglades thuộc phía nam bang Florida Triệu chứng là các đốm nhỏ, kích thước khoảng 1 – 2 mm và thường xuất hiện ở phần mặt lá Tác nhân là do vi

khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae gây nên

Xanthomonas campestris pv campestris và các chủng khác thuộc loại này như X campestris pv abbrans, raphani, armmoraciae, và incanae được biết đến như là

những chủng gây bệnh đốm lá hoặc cháy lá chữ V trên các cây trồng họ thập tự (J.G Vicente, 2001)

Cũng theo J.G Vicente và ctv (2006) phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây củ cải trắng và cây cải ngựa (horseradish), kết quả cho thấy, tác nhân

gây bệnh là vi khuẩn Xanthomonas campesrtis pv armoraciae hoặc Xanthomonas campesrtis pv raphani

Ở Queensland, Australia, tác nhân gây bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn

Xanthomonas campestris pv campestris gây nên Vi khuẩn thường gây hại mạnh trên

các giống cải (Moffett, M.L và ctv, 1976)

Như vậy, tác nhân gây bệnh đốm lá họ tập tự cho đến nay bao gồm hai

giống chính, giống Xanthomonas bao gồm: Xanthomonas campestris pv armoraciae, Xanthomonas campestris pv campestris, Xanthomonas campesrtis pv raphani Và giống Pseudomonas gồm có: Pseudomonas syringae pv maculicola

2.1.3 Tác động kinh tế của bệnh

Bệnh đốm lá vi khuẩn họ thập tự phân bố rộng rãi, gây hại nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Ở Oklahoma, hàng năm có khoảng 600 ha rau bị bệnh tấn công Bệnh làm giảm năng suất và chất lượng của một số loại rau ăn lá họ thập tự Từ 1994 đến 1996 bệnh làm thiệt hại hoàn toàn những cánh đồng trồng cải rổ, cải xanh, củ cải ở bang này (Youfu Zhao và ctv, 2000)

Theo CPC (2001), bệnh đốm lá họ thập tự là bệnh quan trọng gây tổn thất đáng kể về năng suất cũng như chất lượng Bệnh là đối tượng nguy hiểm cho cây trồng họ thập tự ở các bang phía bắc nước Mỹ Trong những năm 1960 và 1970, bệnh gây hại rất nặng rên cánh đồng trồng cải bắp của bang Texas Năm 1972 và 1973, bệnh đã gây thành dịch cho các khu vực Đông – Bắc, và các bang phía tây nước Mỹ, khoảng 70% cây con lấy từ típ ươm cây đều bị nhiễm bệnh, sự thiệt hại này ước tính là khoảng

1 triệu USD Ở Canada, trong vụ Đông 1979 – 1980, bệnh gây tổn thất khoảng 60% sản lượng cải bắp

Ở miền nam tỉnh Buenos Aires – Argentina, tỷ lệ bệnh đốm lá cây canola (Brassica napus) trung bình koảng 59%, những năm bệnh nặng, tỷ lệ bệnh khoảng 90% và làm

thất thoát khoảng 20% năng suất (S Geatan, N Lopez, 2005)

Các loài gây bệnh thuộc giống Xanthomonas spp Là vi khuẩn gây tổn thất kinh tế

nặng nề nhất trên các cây trồng họ thập tự như cải bông, cải bắp, cải xanh (J.G Vicente và ctv, 2006)

2.1.4 Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh

Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae tồn tại trong tàn dư cây trồng ở

trong đất, nhưng không sống trong đất sau khi tàn dư cây trồng bị phân hủy Vi khuẩn cũng có thể tồn tại trên cây cỏ, hạt giống Bệnh phát triển mạnh khi có ẩm độ lá cao (trên 85%), khoảng nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển tương đối rộng 20 – 30o

C Trong điều kiện thời tiết có sương hoặc mưa liên tục kết hợp với nhiệt độ cao là điều kiện rất thuận lợi để bệnh phát triển mạnh mẽ Vi khuẩn có thể lan từ cây này qua cây khác do mưa, tưới và các dụng cụ lao động (Lowell L Black, 2000)

Theo Youfu Zhao (2002), vi khuẩn gây bệnh lan truyền qua hạt giống là chủ yếu

nếu bệnh do Xanthomonas campestris pv campestris gây nên thì vi khuẩn có thể

tồn tại cả ở hạt giống, tàn dư thực vật và cỏ dại Chưa phát hiện được sự tồn tại và

lan truyền qua đất và tồn dư cây trồng của vi khuẩn gây bệnh là Xanthomonas campestris pv armoraciae

Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae và Pseudomonas syringae pv maculicola gây bệnh đốm lá cây rau ăn lá họ thập tự gần như không tồn tại trong

tàn dư cây trồng được chôn vùi sâu, nhưng chúng tồn tại lâu hơn trong tàn dư cây

trồng trên mặt đất Điều này cũng tương tự như vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas syringae pv phaseolicola Chúng có thể tồn tại lâu hơn trong tồn dư thực vật trên mặt đất Vi khuẩn gây bệnh cũng tồn tại trong tồn dư thực vật đã bị hoai mục

Cũng như các vi khuẩn gây bệnh khác, vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae có quan hệ chặt chẽ với sự xâm nhiễm vào mô lá qua lỗ hở tự nhiên

(khí khổng, thủy khổng) và các vết thương tạo nên hiện tượng đốm lá (Veronique

Hugouvieux, 1998)

Theo CPC (2001), Xanthomonas campestris pv campestris sống sót qua mùa đông

trong đất, đặc biệt là các cây kí chủ nhiễm bệnh và các loài cỏ dại mọc gần ruộng trồng cây họ thập tự, vi khuẩn có thể tồn tại tới 3 năm Vi khuẩn xâm nhập vào hạt, lỗ khí khổng và thủy khổng của cây Vi khuẩn từ lá mầm ở cây con có thể lan truyền trực tiếp lên các lá thật Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua sự hình thành giọt nước tiết ra từ lỗ thủy khổng trong giai đoạn buổi sáng (Ruisen và Gielink, 1993)

Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn là 25 – 30oC Trong những điều kiện như vậy, triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7 – 14 ngày Nhiệt độ thấp, triệu chứng bệnh xuất hiện chậm Triệu chứng bệnh không thể hiện rõ khi nhiệt độ dưới 18 – 20oC Vi khuẩn có thể sống sót trên bề mặt lá đến 73 ngày sau khi lá được chủng bệnh bằng phương pháp phun (Schultz và Gabrielson, 1986) Vi khuẩn có thể lây lan từ cây này qua cây khác nhờ gió, mưa và công cụ lao động

2.1.5 Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh

Các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas thường có phản ứng Gram

âm, háo khí, tế bào hình gậy (0,4 – 0,7 x 0,7 – 1,8 μm), tiêm mao đơn cực, không sản sinh nitrates, phản ứng catalase dương tính, tạo axít yếu từ các nguồn carbonhydrate Khuẩn lạc có màu vàng, nhầy, lồi và bóng trên môi trường NGA và YDC agar

Đối với các loài Xanthomonas, khuẩn lạc có thể mọc và phát triển ở nhiệt độ 35oC, hóa lỏng gelatin, không tạo urease, sản sinh axit từ arabinose, glucose và manose (N.W Schaad, 1998)

2.1.6 Phương pháp phân lập tác nhân gây bệnh

Theo Youfu Zhao (2000), đối với bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn thuộc giống

Xanthomonas, việc ly trích vi khuẩn tốt nhất từ các đốm lá mới bị nhiễm bệnh

Sát trùng bề mặt bằng sodium hypochlorite 0,25% trong 30 giây, đốm bệnh được cắt nhỏ trong giọt nước tiệt trùng và cấy zích zắc dịch khuẩn lên môi trường nutrient agar (NA) Đĩa cấy ủ trong 28o

C, sau 3 – 5 ngày đem quan sát khuẩn lạc Chọn các khuẩn lạc màu vàng, mọc tách rời để nghiên cứu

Theo CPC (2001), vi khuẩn gây bệnh thực vật giống Xanthomonas có thể được

phân lập từ rìa vết bệnh (phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe ) Vi khuẩn được cấy trên môi trường Yeast dextrose calcium carbonate (YDC), Beef peptone agar + 5% water soluble starch

Theo Shaad, N.W (1988), vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris có

thể được phát hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường bán chọn lọc (semiselective media) Các loại môi trường bán chọn lọc chuyên biệt được sử dụng là SX agar, SM agar, NSCAA, BSCAA Các môi trường này thường dùng phân lập vi khuẩn

Xanthomonas campestris pv Campestris trong đất và hạt giống

2.1.7 Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử

Để đánh giá sự đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn Xanthomonas

campestris gây bệnh đốm lá trên cây họ thập tự, Youfu Zhao và ctv (2000) đã sử dụng

kỹ thuật rep-PCR với BOX primer BOXAIR [5’ –

CTACGGCAAGGCGACGCTGACG – 3’] Phản ứng rep – PCR trên các mẫu nghiên cứu tạo sản phẩm là các đoạn DNA có kích thước từ 0,3 – 4 kb cho phép đánh giá sự tương quan về mặt kiểu gen giữa các loài

Hình 2.1 Sản phẩm rep – PCR trong nghiên cứu của Youfu Zhao và ctv

Goncalves, E.R., và Rosato, Y.B (2002), trong nghiên cứu của mình về sự phát

sinh loài vi khuẩn Xanthomonas campestris đã dùng kỹ thuật PCR sử dụng cặp primer

Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’ Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’

thiết kế dựa trên vùng rDNA 16S và 23S để khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS có kích thước 1,1 kb

Hình 2.2 Cấu trúc vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn Xanthomonas

Said M.S Massomo và ctv (2003) đã thực hiện nghiên cứu định danh vi khuẩn

Xanthomonas campestris pv campestris trên cải bắp ở Tanzania bằng phương pháp

chủng bệnh, phân tích methyl este acit béo, ELISA gián tiếp và rep – PCR Vi khuẩn sau khi phân lập được tiến hành phân tích sinh hóa; chủng bệnh bằng phương pháp châm kim tạo vết thương, lây nhiễm trên lá mầm, phun dịch khuẩn trên cây trưởng thành Acit béo được methyl hóa, ly trích và phân tích bằng máy sắc ký khí Vi khuẩn được xác định bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu Các dòng vi khuẩn sau khi xác định được tiến hành phân tích genomic fingerprinting bằng kỹ thuật rep – PCR với primer

BOXAIR (5’ – CTACggCAAggCgACgCTgACg – 3’) và REP – PCR dùng cặp primer:

REP 1R (5’ – IIIICgICgICATCIggC – 3’) REP 2I (5’ – ICgICTTATggCCTAC – 3’)

Young Jin Park và ctv (2004) đã thực hiện nghiên cứu phát hiện vi khuẩn

Xanthomonas campestris pv campestris bằng kỹ thuật PCR dựa trên cặp primer

XCF (5’ – CGATTCGGCCATGAATGACT – 3’) và

XCR (5’ – CTGTTGATGGTGGTCTGCAA – 3’) được thiết kế từ gen hrpF của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris để khuếch đại đoạn DNA có

kích thước 535 bp Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm chứng minh tính chuyên biệt và đặc hiệu của primer XCR, XCF bằng cách thực hiện phản ứng PCR với nhiều thành phần hóa chất mà máy luân nhiệt khác nhau Ngoài ra, kỹ thuật

DNA dot – blot cũng được thực hiện nhằm kiểm chứng sự hiện diện của gen hrpF

trong vi khuẩn, qua đó rút ra kết luận về sự bảo toàn của gen này

2.2 Tổng quan nghiên cứu trong nước

Cho đến nay, những nghiên cứu về bệnh đốm lá họ thập tự nói chung và cây cải ngọt nói riêng còn khá ít Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), bệnh đốm lá

súp lơ là do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv maculicola gây nên Bệnh được phát

hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1911 Triệu chứng bệnh trên các lá thật thường là các đốm nhỏ, tròn, góc cạnh, màu nâu tím hoặc đen Trên lá mầm xuất hiện các đốm trong giọt dầu, mép lá uốn cong Đường kính vết bệnh từ 1 – 3 mm

Vi khuẩn gây bệnh hình gậy, hai đầu tròn, kích thước khoảng 1,5 – 3 x 0,5 – 1 μm, chuyển động nhờ vài ba lông roi ở một đầu Khuẩn lạc trắng kem, tròn nhẵn, rìa gợn sóng Vi khuẩn có khả năng phát huỳnh quang, tạo NH3, khử nitrate, không phân giải đường thành axít, khí, không làm đông váng sữa, phân giải gelatin rất yếu, khả năng yếu tạo H2S và indol

Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng là 24 – 25oC, nhiệt độ tối đa là 29oC, nhiệt độ gây chết là 47oC, nhạy cảm với tác động của ánh sáng mặt trời và khô hạn Vi khuẩn xâm nhiễm qua lỗ khí khổng, vết thương Thời kỳ ủ bệnh là khoảng 4 – 6 ngày Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện ẩm độ cao (90%), nhiệt độ 17 – 25oC Bệnh có thể lan truyền qua bọ nhảy

Ở trên cây cải bông và một số rau ăn lá như cải thìa, cải xanh, cải ngọt, bệnh đốm lá

do vi khuẩn Xanthomonas spp gây nên thường xuất hiện trong vụ đông xuân

Trên cải bông, bệnh xuất hiện nhiều hơn so với các giống cải khác (Trần Thanh Tùng, 1997)

Theo Phạm Văn Biên và Mai Thị Vinh (1998, 2000), bệnh đốm lá cải bông vùng

trồng rau thành phố HCM do vi khuẩn Pseudomonas spp gây nên Bệnh thường xuất

hiện trên cải bông trồng trong vụ đông xuân Bệnh phát sinh gây hại nặng vào những

năm có thời tiết nóng ẩm Giống Xanthomonas spp thường gây bệnh cháy lá chữ V

trên cải bắp, cải bông vùng Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh Bệnh cũng thường xuất hiện trong vụ đông – xuân, khoảng từ tháng 11 – 2

Trong giống Xanthomonas spp có một loài gây bệnh đốm lá cải bông được phát

hiện trong năm 1998 ở vùng rau Vĩnh Lộc B, Bình Chánh, Tp HCM Triệu chứng bệnh ban đầu là các đốm nhỏ vàng sáng ở các lá thấp gần mặt đất, các đốm này trông gần giống với đốm do bọ nhảy gây hại Bệnh thường nặng hơn vào giai đoạn cuối vụ Tỷ lệ bệnh giai đoạn phát triển thân lá khoảng 21%, nhưng ở giai đoạn ra bông , bệnh có thể lên tới 50% (Mai Thị Vinh, 1998)

Nhìn chung, số công trình nghiên cứu về tác nhân cũng như các đặc tính sinh học, sinh lý, sinh hóa, dịch tễ học của bệnh đốm lá cải ngọt nói riêng và bệnh đốm lá cây họ thập tự nói chung ở Việt Nam còn khá ít

2.3 Vùng 16S – 23S rDNA ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF

(hypersensitive reaction and pathogenicity)

2.3.1 Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity)

Để xâm nhập và gây bệnh trên cây kí chủ, các loài vi khuẩn thường có hệ thống riêng tiết ra các loại enzyme (pectinases, cellulases, proteases) và các chất độc (Beattie

và Lindow, 1994) Ngoài ra còn có sự tham gia của hệ thống các gen hrp Gen này

hiện diện trong hầu hết các loài vi khuẩn Gram âm ngoại trừ Agrobacterium

(Lindgren, 1986) Gen này tạo cho vi khuẩn khả năng xâm nhập và nhân sinh khối trong cây nhiễm (susceptible plant), đồng thời tạo phản ứng siêu nhạy cảm (hypersensitive reaction) ở cây kháng (resistant plant) Phản ứng siêu nhạy cảm là một đáp ứng phòng vệ của cây kí chủ, thể hiện bằng sự hoại tử ở mô bị nhiễm (Klement,

1982) Tổ hợp gen này bao gồm 21 gen và 2 gen điều tiết là hrpX, hrpG nằm bên

ngoài Các gen hrp mã hóa các protein hrp Các protein này là thành phần của hệ

thống phóng tiết loại III (type III secretion system) cho phép tiết ra các loại protein gây độc (Van Gijsegem, 1993 và Van den Ackerveken, 1996)

2 3.2 Ribosome DNA (rDNA)

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các

nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa Hơn nữa, ribosom

hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và ctv, 1996)

Theo Goncalves, E.R., và Rosato, Y.B (2002), rDNA 16S và 23S có tính bảo toàn cao Ngược lại, vùng ITS tiến hóa nhanh hơn và có nhiều biến động Do đó, các primer được thiết kế dựa trên trình tự các vùng bảo toàn để khuếch vùng ITS, dùng trong các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền, nguồn gốc phát sinh cũng như quan hệ giữa các loài Ngoài ra, vùng ITS còn được sử dụng giải trình tự, đối chiếu với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh sinh vật

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài sử dụng dòng vi khuẩn đối chứng Xanthomonas axonopodis pv citri gây

bệnh ung thư trên cây bưởi

3.3 Hóa chất

Các hoá chất được sử dụng trong đề tài này được sản xuất bởi Công ty Sigma,

Merk, Amersham Biosence và Bio Rad

3.3.1 Các hoá chất dùng để ly trích DNA từ vi khuẩn

Phenol Chloroform Isoamyl Isopropanol Ethanol 100% Ethanol 70% RNAse 1mg/ml

Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1)

Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH 8,0