Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới

3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.5.3. Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới

3.5.3.1. Phƣơng pháp trồng cây kí chủ

Để chủng bệnh, phải trồng cải ngọt sạch bệnh trong nhà lƣới.

Giống cải ngọt để trồng đƣợc mua từ các công ty giống cây trồng bao gồm 3 giống: Số 4, Hai mũi tên đỏ và H&V.

Giá thể trồng: vật liệu làm giá thể trồng bao gồm xơ dừa, rơm rạ hoai mục, tro trấu. Các thành phần trộn theo tỷ lệ 1:1:1, hỗn hợp này sau đó trộn với đất trồng theo tỷ lệ 1:1 tạo giá thể hoàn chỉnh. Toàn bộ giá thể đƣợc hấp khử trùng ở nhiệt độ 121o

C. Xử lý hạt giống: trƣớc khi gieo, ngâm hạt trong nƣớc ấm 50oC sau đó đem gieo vào khay gieo sạch. Khay gieo có kích thƣớc 50 cm x 30 cm, chứa khoảng 200 lỗ. Cây con sau khi mọc 10 ngày đem trồng ra khay xốp với kích thƣớc lỗ lớn.

Khi cây cải 20 ngày tuổi có khoảng 3 – 4 lá thật thì tiến hành chủng bệnh.

3.5.3.2. Chủng bệnh

Để xác định dòng vi khuẩn gây bệnh, chủng bệnh tiến hành theo phƣơng pháp châm kim tạo vết thƣơng trên bề mặt lá. Trên mỗi lá châm thành hàng ở phần thịt lá dọc hai bên gân chính, mỗi bên châm khoảng 5 – 7 vết. Một bên sẽ đƣợc chủng vi khuẩn, bên kia không chủng để làm đối chứng so sánh.

Các dòng vi khuẩn chọn chủng đƣợc cấy trên môi trƣờng PDA để thu sinh khối. Dùng tăm bông khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc trên đĩa chấm vào vết thƣơng để lây nhiễm vi khuẩn vào mô lá.

Khay cải sau chủng đƣợc ủ ẩm bằng cách bọc trong túi ni lông có miệng để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn và tránh sự lẫn tạp các dòng với nhau. Sau 3 – 4 ngày, quan sát triệu chứng và ghi nhận kết quả. Lá nhiễm bệnh khi xung quanh vết châm có sự hoại tử mô tế bào (khác biệt với vết châm đối chứng ở đối diện gân lá).

Để quan sát triệu chứng, hình thái và phản ứng của tế bào lá sau khi chủng. Chúng tôi tiến hành nhuộm lá bằng dung dịch Alcohollic lactophenol (thành phần và cách pha dung dịch: xem phần phụ lục).

Phƣơng pháp nhuộm lá đƣợc mô tả nhƣ sau: -Cho lá cải cần nhuộm vào ống nghiệm, mỗi ống 2 lá.

- Rót dung dịch Alcohollic lactophenol vào ống nghiệm đến khi ngập lá.

- Đƣa ống nghiệm vào nồi nƣớc đang sôi, đến khi thấy bọt khí nổi lên thì lấy ra. - Để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng cho đến khi bọt khí ngừng nổi.

- Đổ bỏ dung dịch và rửa lá bằng nƣớc cất. - Mẫu lá sau đó đƣợc để khô tự nhiên. - Lƣu mẫu ở 4oC.

Mẫu lá xác định có nhiễm bệnh đƣợc đem phân lập vi khuẩn gây bệnh. Các bƣớc phận lập đƣợc tiến hành nhƣ phƣơng pháp đƣợc trình bày ở mục 3.5.2.

3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn

Vi khuẩn đƣợc nhân sinh khối trong môi trƣờng LB lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, thu sinh khối và tiến hành ly trích.

Ly trích DNA theo phƣơng pháp sử dụng CTAB:

1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC. Rửa sinh khối vi khuẩn đƣợc với 1 ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex (rửa 2 – 3 lần). Ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC.

2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10%, trộn đều bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 h.

3. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex.

4. Thêm 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (1/10 thể tích), pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65oC trong 10 phút.

5. Chiết xuất dung dịch DNA với 500 µl dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1). Trộn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4oC. 6. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới .

7. Thêm 780 µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4 oC.

8. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol (2/3 thể tích dung dịch thu đƣợc), ủ ở - 20 oC/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10 phút/4 oC. Lấy kết tủa sau ly tâm.

9. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20 oC, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4 oC. Đổ cồn ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.

10.Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4 oC trong suốt thời gian tiến hành đề tài.

3.5.5. Phƣơng pháp PCR

3.5.5.1. Khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn

Phản ứng tiến hành với cặp mồi không chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm khuếch đại trình tự vùng ITS (intergenic spacer sequence) nằm giữa vùng rDNA 16S và 23S (Goncalves và Rosato, 2002):

- Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’ - Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’

Thành phần của phản ứng đƣợc thiết lập bao gồm:

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Nồng độ sau cùng Thể tích ( l) PCR buffer 10X 1X 2,5 dNTP 1 mM 100 M 0,5 MgCl2 25 mM 1,5 mM 0,75 Primer 5 M 0,25 M 2 DNA 25 ng / l 1,25 ng / l 1

Taq polymerase 5 unit / l 0,1 unit / l 0,2

H2O 18,05

Chu kỳ nhiệt của phản ứng đƣợc thiết lập theo bảng sau:

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan322 Giai đoạn Nhiệt độ (0

C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 58 72 1 phút 45 giây 1 phút 30 Hoàn thành 72 10 phút 1 Giữ mẫu 4 30 phút 1

3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF

Với thành phần nhƣ trên, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi chuyên biệt, đƣợc thiết kế dựa vào trình tự gen hrpF (Young Jin Park và ctv, 2004).

- XCF 5’ CGATTCGGCCATGAATGACT 3’ - XCR 5’ CTGTTGATGGTGGTCTGCAA 3’

Quy trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau:

Bảng 3.3 Quy trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCF và XCR

3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết quả 3.5.6.1. Điện di trên gel agarose

Cho 0,125 gram agarose vào 12,5 ml dung dịch 0,5X TAE

Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 58 72 15 giây 15 giây 30 giây 35 Hoàn thành 72 5 phút 1 Giữ mẫu 4 30 phút 1

Đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò viba (đun 2 lần, mỗi lần 1 phút)

Để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.

Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí trên gel.

Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel, cho dung dịch 0,5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel khoảng 1 – 1,5 cm.

Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng thang chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100 V và 250 mA.

3.5.6.2. Đọc kết quả điện di

Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút.

Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm Quantity one 2000).

Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel.

3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA

* Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dƣ thừa cũng nhƣ các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện đƣợc. Quy trình tinh sạch gồm các bƣớc nhƣ sau:

Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose). Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lƣợng.

Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao tác này đƣợc tiến hành dƣới tia UV trong phòng tối), cắt càng sát band chứa

DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã đƣợc cân từ trƣớc, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn.

Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lƣợng của miếng gel.

Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh sạch là 300 l buffer và 300 mg gel).

Vortex nhẹ và ủ ở 600C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thƣờng khoảng 10 – 15 phút.

Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube.

Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu xuống phần đáy của ependorf.

Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy nhẹ theo thành column). Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút.

Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây.

Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào collection tube trở lại.

Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây.

Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã đƣợc làm lạnh.

Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch.

* Định lƣợng DNA tinh sạch

DNA sau khi tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P. Curran, 2002).

Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự

Sản phẩm PCR Lƣợng 100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1-3 ng 3-10 ng 5-20 ng

1000-2000 bp 10-40 ng

3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) Kit (Applied Biosystems)

* Thành phần hóa chất

Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự đƣợc thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự

Sản phẩm PCR Lƣợng BDT mix Buffer DNA khuôn (580 bp) Primer Nƣớc khử ion 4 l 2 l 1 l 1 l 2 l Tổng số 10 l

* Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự

Đặt các ống tube vào Thermal cycler và cài đặt thể tích 10 l. Làm nóng các ống tube ở 950C trong 5 phút.

Bƣớc 1:950C trong 30 giây

Bƣớc 2: 50 - 550C trong 10 giây 25 chu kỳ Bƣớc 3: 600C trong 4 phút

Hạ nhiệt độ xuống 40C và duy trì cho tới khi tinh sạch.

3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại

Mục đích của việc tinh sạch là để loại bỏ dye terminator còn dƣ trƣớc khi điện di. Sử dụng phƣơng pháp tinh sạch của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh: Bổ sung 5 l EDTA 125 mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm PCR. Spin nhẹ.

Thêm vào 60 l ethnol 100 %. Ủ tại nhiệt độ phòng 15 phút.

Thu tủa sau đó rửa tủa bằng 60 l ethanol 70 %. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút.

Loại dịch thu cặn.

Làm khô bằng máy speed vac. Thêm vào 10 l Hidiformamide. Biến tính ở 950C trong 3 phút.

3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer

Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại đƣợc load vào các cột mao dẫn chứa polymer để điện di phân tích kết quả.

Kết quả thu đƣợc từ tín hiệu huỳnh quang sẽ đƣợc ghi nhận bằng phần mềm của máy sequencer.

3.5.7.4. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR

Tinh sạch GFX PCR DNA and gel

band Purification kit

Phản ứng đọc trình tự Hóa chất: BDT mix Buffer DNA khuôn Primer Nƣớc khử ion Chu kỳ nhiệt: 950C/5 phút 950C/30 giây 550C/10 giây 600C/4 phút 25 chu kỳ Tinh sạch

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh

Qua quá trình khảo sát thực tế tại các ruộng trồng rau, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và phân lập đƣợc tổng cộng 8 dòng vi khuẩn nhƣ sau:

Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài

Tên mẫu Nơi lấy mẫu Cây kí chủ 1 CC1 Huyện Củ Chi Cải ngọt 2 CC2 Huyện Củ Chi Cải ngọt 3 CC3 Huyện Củ Chi Cải ngọt 4 HM1 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 5 HM2 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 6 HM3 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 7 Q12 – 1 Quận 12 Cải ngọt 8 Q12 – 2 Quận 12 Cải ngọt 9 DC vi khuẩn đối chứng

Xanthomonas axonopodis pv. citri

Bƣởi

Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau.

Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới kính hiển vi soi nổi.

Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch

(a)vi khuẩn ly trích từ lá bệnh trên môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau khi

phân lập trên môi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy.

4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới

Cây kí chủ sạch bệnh trồng trong nhà lƣới sau khi chủng 4 ngày đƣợc tiến hành quan sát triệu chứng. Kết quả cho thấy các dòng CC1, CC2, CC3, HM1, HM2 và Q12 – 1 gây triệu chứng bệnh trên cây cải ngọt trồng trong nhà lƣới. So sánh vết bệnh tạo ra trên lá cải thu thập ngoài ruộng và lá cải đƣợc chủng trong nhà lƣới, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về triệu chứng.

Ở những lá cây nhiễm bệnh, qua hình chụp đốm bệnh dƣới kính hiển vi soi nổi, ta có thể thấy rõ triệu chứng: từ vết thƣơng ban đầu, vi khuẩn xâm nhập các mô, gây hoại tử các mô tế bào lá. Vết bệnh phát triển rộng dần tạo thành đốm màu nâu đen rõ rệt.

Còn ở những lá không bị nhiễm, những tế bào tại vùng bị tổn thƣơng bị chết tạo thành vết sẹo màu trắng, không có triệu chứng bệnh.

a

d b

Hình 4.4 Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp dƣới kính hiển vi soi nổi (a) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày; (b) vết thương do kim châm tạo ra trên lá không bị bệnh; (c) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo ở lá chủng không nhiễm bệnh nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.

Đốm bệnh

Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và bên trái bị nhiễm (a)lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày; (b) lá cải sau khi chủng bệnh

4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.

4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn

Quá trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu. DNA thu đƣợc phải đáp ứng đƣợc yêu cầu về hàm lƣợng và độ tinh sạch. Sau khi tiến hành tách chiết theo đúng quy trình 8 mẫu vi khuẩn, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn (genomic DNA)

1: CC1, 2: CC2, 3:CC3, 4: HM1, 5: HM2, 6: Q12-1, 7: DC.

Qua kết quả điện di ta thấy DNA ly trích có chất lƣợng tốt, lƣợng mẫu nhiều và ít tạp nhiễm. Tuy nhiên, để chuẩn bị tốt cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành pha loãng nhằm hịêu chỉnh nồng độ mẫu DNA bằng dung dịch TE. Kết qủa thu đƣợc thể hiện qua band diện di:

Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA.

DNA thu đƣợc

Phần tạp nhiễm

Thông thƣờng, sản phẩm ly trích phải qua giai đọan tinh sạch bằng enzyme RNAse nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, dựa vào hình trên, chúng tôi nhận thấy DNA thu đƣợc có độ thuần khiết cao, do đó, không cần thiết phải tinh sạch.Hơn nữa, quá trình tinh sạch sẽ làm gãy DNA ở một mức độ nào đó.