Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia cát tiên

Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia cát tiên

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC

VẬT Ở VƯỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007

Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC

VẬT Ở VƯỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ PHAN TRUN G HẬU ThS KIỀU PHƯƠNG NAM

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Bù i Văn Lê ̣ , người đã tâ ̣n tình hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điền kiê ̣n để em thực hiê ̣n khóa luâ ̣n này

Thạc sĩ Kiều Phương Nam , là người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt những kinh nghiệm quí báo trong suốt quá trình làm đề tài Em xin cảm ơn thầy rất nhiều!

Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt cho chúng em những kiến thức quý báu suốt 4 năm học qua

Em cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tư trường ĐH Khoa ho ̣c Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đô ̣ng viên tôi những lúc gă ̣p khó khăn trong đề tài

Cảm ơn tất cả các thành viên lớp CNSH 29 và các ba ̣n thân đã cùng tôi chia sẻ những nỗi buồn vui những năm đa ̣i ho ̣c

Và trên hết , con cảm ơn ba má , và các anh chị đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tưởng và khích lệ con những lúc khó khăn nhất để con có thể vững bước trên con đường đã chọn

Tháng 9/2007 Phan Trung Hậu

- Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng tác động lên chồi thuốc lá trong điều kiện

in vitro và khả năng kích thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in vivo), chúng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh

trưởng trên thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ON16a, ON20a, ON28a và ON29b

Kết quả định danh:

Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium Riêng chủng 6012a có thể là một loài mới

Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men và có đặc điểm tương đồng với các giống nấm men sau:

- Các chủng 6019b, ON16a, ON20a, ON29b có điểm tương đồng với giống

Pichia

- Chủng 6019a có điểm tương đồng với giống Cocidiascusc

- Chủng 6021a có điểm tương đồng với giống Rhodotorula

- Chủng ON28a có điểm tương đồng với giống Endomycopsis

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xi

Danh sách các bảng xii

Chương 1: MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined 1.1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined 1.2 Mục tiêu Error! Bookmark not defined 1.3 Yêu cầu Error! Bookmark not defined Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1 Vườn Quốc gia Cát Tiên Error! Bookmark not defined 2.2 Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật Error! Bookmark not defined 2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự

2.3 Các phương pháp định danh vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.3.1 Phương pháp truyền thống Error! Bookmark not defined

2.3.1 Phương pháp hiện đại Error! Bookmark not defined

Chương 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined 3.1 Thời gian và địa điểm Error! Bookmark not defined 3.2 Vật liệu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.2.2 Thiết bị dụng cụ Error! Bookmark not defined 3.2.3 Hóa chất Error! Bookmark not defined

3.2.3.1 Môi trường phân lập và làm thuần vi sinh vật biến dưỡng methyl

(MMS)……… Error! Bookmark not defined

3.2.3.2 Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO) Error! Bookmark not defined

3.2.3.3 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) Error! Bookmark not defined 3.2.3.4 Các môi trường khác Error! Bookmark not defined 3.3 Phương pháp thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.3.1 Phân lập và làm thuần Error! Bookmark not defined 3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh mẫu: Error! Bookmark not defined 3.3.1.2 Phân lập chọn lọc Error! Bookmark not defined

3.3.1.3 Giữ giống

……….Error! Bookmark not defined

3.3.2 Định tính Error! Bookmark not defined

3.3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng kiện in

vitro và in vivo Error! Bookmark not defined

3.3.2.2 Xử lý thống kê Error! Bookmark not defined 3.3.2.3 Quan sát hình thái Error! Bookmark not defined 3.3.3 Định danh vi khuẩn Error! Bookmark not defined 3.3.3.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Error! Bookmark not defined

3.3.3.2 Đặc điểm sinh lý Error! Bookmark not defined 3.3.3.3 Đặc điểm sinh hóa Error! Bookmark not defined

3.3.3.4 So sánh tính tương đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard Error! Bookmark not defined

3.3.3.5 Phân tích trình tự rDNA 16S Error! Bookmark not defined 3.3.4 Định danh nấm men Error! Bookmark not defined 3.3.4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men Error! Bookmark not defined 3.3.4.2 Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men Error! Bookmark not defined

Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 4.1 Kết quả phân lập và làm thuần Error! Bookmark not defined 4.2 Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tương tác với thực vật Error! Bookmark not defined

4.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng VSV trong

điều kiện in vitro Error! Bookmark not defined

4.2.2 Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống Error! Bookmark not defined

4.3 Định danh vi sinh vật Error! Bookmark not defined 4.3.1 Kết quả quan sát hình thái Error! Bookmark not defined

4.3.2 Định danh vi vi khuẩn 59

4.3.2.1 Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 59

4.3.2.2 Phân tích trình tự rDNA 16S 70

4.3.3 Định danh nấm men 77

4.3.3.1 Quan sát các đặc điểm hình thái nấm men 77

4.3.3.2 Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa 80

Chương 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined.2

5.1 Kết luận Error! Bookmark not defined.2

5.2 Đề nghị Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… ………….85

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid

CMS Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2% casein

PPFM Pink-Pigment Facultative Methylotrophic

MSo Môi trường khoáng MS không có nitrogen

DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi

khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn lạc Methylobacterium

từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập 6

Hình 2.2: Phổ tương tác cố định đạm trên thực vật 10

Hình 2.3: Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa 11

Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR 41

Hình 4.1: Kết quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên chồi thuốc lá sau 2 tuần 49

Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung chủng 6027a 49

Hình 4.3: Kết quả tương tác của 2 chủng vi sinh vật ON16a (A), ON29b (B) lên chồi thuốc lá 52

Hình 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chúng 6012a so với đối chứng sau 2 ngày 55

Hình 4.5: Kết quả khảo sát khả năng kích hạt nảy mầm của chủng ON20a so với đối chứng 57

Hình 4.6: Hình thái tế bào qua kính hiển vi vật kính 100X 60

Hình 4.7: Khảo sát ngưỡng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn 6012a và vi khuẩn 6027a 63

Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR của hai chủng vi khuẩn 66

Hình 4.9: Kết khảo sát khả năng cố định nitơ của hai chủng 6012a và 6027a 67

Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển vi huỳnh quang bươc sóng 460nm. 68

Hình 4.11: DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn 71

Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F, 2R) 72 Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi (27F, 1525R) 73 Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi (520F, 920R) 74 Hình 4.15: Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 6012a với tất cả

các chủng chuẩn của các loài Methylobacterium đã và sẽ công

bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn 76

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

TRANG Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm 24 Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên

chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS 47 Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng

lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS 48 Biểu đồ 4.3: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên chiều cao và

chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MSo 51 Biểu đồ 4.4: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên trọng lượng tươi và

trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MSo 51 Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và

mật độ tế bào 61 Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân lập được 61 Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai

chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy 62 Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi

khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy 62

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm

sinh hóa IDS 14GNR 37

Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) 47

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng

vi sinh vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo 50

Bảng 4.3: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng

vi sinh vật biến dưỡng methyl 53

Bảng 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường MSo 55

Bảng 4.5: Bảng thống kê các đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật có khả năng tương tác với thực vật 58

Bảng 4.6: Các đặc điểm hình thái cơ bản của 2 chủng vi khuẩn 60

Bảng 4.7: Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a 64

Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR và hoạt tính Catalase………66

Bảng 4.9: Bảng tổng kết các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn 69

Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen của chủng phân lập được ghi nhận qua máy đo Nanodrop 71

Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với các loài Methylobacterium sp đã được công bố 75

Bảng 4.11: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men 78

Bảng 4.12: Khả năng lên men đường glucose 80

Bảng 4.13: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và đồng hóa nitrat 80

Chương 1 MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi nền nông nghiệp Do đó đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học Tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao Bên cạnh đó, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm

Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các hợp chất sinh học như các phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ Chính bởi những ưu điểm này mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đang là một hướng đi đầy tiềm năng Đặc biệt trong điều kiện nước ta là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên nhiên còn hoang dã, thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất lớn

Trên những cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vườn Quốc gia Cát Tiên”

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

2.1 Vườn Quốc gia Cát Tiên [23]

Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nằm trên vùng chuyển tiếp từ cao nguyên

xuống đồng bằng qua địa phận ba tỉnh: huyện Cát Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng); Bù Đăng (tỉnh Bình Phước); Vĩnh Cửu, Tân Phú (tỉnh Đồng Nai) Chính vì thế vườn có nhiều dạng địa hình: từ núi cao, sườn dốc, đồi nhấp nhô cho đến thềm sông bằng phẳng, nhiều thác ghềnh, suối lớn và những vùng đầm lầy ngập nước VQGCT cách thành phố Hồ Chí Minh 150km với tổng diện tích là 73878 ha, tài nguyên thiên nhiên phong phú, đa dạng và là một trong những Vườn Quốc gia lớn nhất Việt Nam

 Hệ thực vật

Vườn Quốc gia Các Tiên có nhiều dạng sinh cảnh: rừng nguyên sinh và thứ

sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa rụng lá nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài Lagertroemia sp đất ngập nước ngọt và trảng cỏ ngập nước theo mùa ưu thế bởi các loài Saccharum sp rừng ngập lụt ưu thế bởi các loài Hydrocarpus sp xen lẫn Ficus benjamina và

các kiểu sinh cảnh thứ sinh như rừng tre nứa, trảng cỏ Hệ thực vật đã ghi nhận 1362 loài thực vật bậc cao có mạch, trong số đó có 34 loài có tên trong "Sách Đỏ" Việt Nam và nhiều loài cây gỗ có giá trị như gõ đỏ, xoay, cẩm lai, giáng hương quả to

 Hệ động vật

Theo thống ghi nhận 77 loài thú, 318 loài chim, 58 loài bò sát, 26 loài ếch nhái, 130 loài cá Trong số đó có các loài thú lớn quý hiếm và một số loài có nguy cơ đe doạ tuyệt chủng toàn cầu như tê giác Java, bò tót, voi Châu Á, cá sấu nước

ngọt (Crocodylus siamensis); một số loài chim đặc hữu như gà so cổ hung (Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron germani), một số loài chim nước quý hiếm như quắm cánh xanh (Pseudibis davisoni), ngan cánh trắng (Cairina scutulata), già đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus) Đối tượng bảo tồn là rừng cây họ

Dầu, các hệ sinh thái đặc thù, các loài tê giác, cá sấu, bò tót, các loài chim đặc hữu VQGCT thực sự là kho bách khoa toàn thư sống cho công tác nghiên cứu thế giới tự

nhiên

2.2 Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật

Các vi khuẩn tương tác với thực vật rất đa dạng về giống loài và cơ chế tương tác với thực vật Những vi khuẩn này là một bộ phận quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn tương tác thực vật chủ yếu tập trung vào các vi sinh vật gây bệnh trên thực vật và các vi sinh vật cố định nitơ Tuy nhiên, mối quan tâm về sự đa dạng của các vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật đã và đang gia tăng Và thực tế trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật, nhưng chúng chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong quần thể vi sinh vật Những vi sinh vật này có vai trò quan trọng trong nông nghiệp hay môi trường Những tiến bộ kỹ thuật trong sinh thái và di truyền vi sinh vật đã và đang phát hiện ra nhiều loài vi sinh vật có ích, có tác động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Đồng thời cũng làm sáng tỏ các cơ chế tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, làm nền tảng cho việc ứng dụng các vi sinh này vào cuộc sống [18]

Các vi sinh vật tương tác với thực vật không chỉ bao gồm các vi sinh vật tiền nhân (Prokaryote) mà nó còn cả các vi sinh vật nhân thực (Eukaryote):

+ Prokaryote là thành phần chiếm đa số của hầu hết các quần thể vi sinh vật trong thực vật Các prokaryote này, thường là vi khuẩn có thể hiện diện với mật độ

lên tới 109 tế bào trên 1 gram mô rễ Nếu nuôi cấy chúng trên môi trường chọn lọc có thể đạt 1010

tế bào trên 1 gram sinh khối thực vật [18]

+ Eukaryote bao gồm nấm sợi, nấm men, tảo, protozoa và các tuyến trùng thường tập trung với mật độ thấp hơn các prokaryote Một thí dụ rõ ràng là các vi sinh vật cộng sinh trên rễ có thể đạt lượng tế bào trên 1 gram mô rễ là: 106-109 tế bào vi khuẩn, 107 xạ khuẩn, 105-106 tế bào nấm men, 103 đối với tảo, 102-103 đối với protozoa Bacteriophage và các loại virus cũng là thành viên của quần thể này, chúng có thể tìm thấy trong đất với mật độ 108-109 tế bào trên một gram đất [6]

Vi sinh vật tương tác thực vật có thể phân nhóm dựa vào nơi cư trú, và bản chất tác động của chúng lên thực vật

Phân nhóm dựa vào nơi cư trú bao gồm

Các vi sinh vật biểu sinh (epiphyte): bao gồm các vsv cộng sinh ở vùng rễ

(Rhizosphere) và vsv cộng sinh trên bề mặt lá (Phyllosphere) Phần lớn các vi sinh vật biểu sinh tương tác thực vật sống bằng các chất dinh dưỡng thoát ra trên bề mặt cây Ví dụ vùng rễ thường tiết ra nhựa keo (dịch nhày) chứa: Hydrat polysaccharide, acid hữu cơ, vitamin, và amino acid, đó là điều kiện tối ưu đối với một giá thể mà vi sinh vật cần cho sự sinh trưởng và phát triển Nhựa keo được bao bọc bởi nước, và như thế giúp làm môi trường thủy giải tốt đối với rễ và vi sinh vật vùng rễ phát triển [16]

Ở vùng lá, nguồn thức ăn cho các vi sinh vật là dịch lá tiết ra Trong nhóm vi sinh vật vùng lá thì vi khuẩn biến dưỡng methyl tùy ý (Pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) chiếm tỉ lệ lớn và nó được phân bố trên nhiều loại cây [14] Chúng sử dụng nguồn carbon là nguồn methanol do cây tiết ra từ quá trình phân hủy các pectin có methyl Nhờ khả năng sử dụng nguồn thức ăn khác thường này, PPFM có thể loại bỏ các chất độc này khỏi mô thực vật, và có chỗ cư ngụ trên lá Các PPFM sử dụng nguồn carbon, và các khoáng chất từ cây chủ, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hóa chuyển hóa quan trọng của cây chủ [19] (Hình 2.1)

Đa số các vi sinh vật này không làm thay đối sự sinh trưởng và sinh lý của cây Do đó, phần lớn vi sinh vật tương tác thực vật có một tương tác hội sinh (commensalisti) với cây chủ

Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi sinh vật biến dưỡng

methyl

(B) Khuẩn lạc Methylobacterium từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập [20]

Các vi sinh vật nội sinh (endophytic)

Các vi sinh vật nội sinh (endophytic) là các vi sinh vật sống bên trong mô thực vật sống và không gây hại tới cây chủ Chúng được phân lập từ bề mặt mô hay chiết xuất từ mô thực vật Mặc dù, các loại nấm endophytic đã được nghiên cứu rộng rãi trong khi các vi khuẩn endophytic thì chưa, các vi khuẩn này vẫn thu hút được sự quan tâm nhờ vào tiềm năng sử dụng của chúng trong nông nghiệp

Các vsv nội sinh được phân lập từ nhiều loại mô và cây khỏe mạnh Kobayashi và Palumbo (2000) đã biên soạn một danh sách 55 giống và 144 loài endophytic phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật [14]

2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự tương tác [16]

Theo bản chất của sự tương tác thì các vi sinh vật tương tác được chia làm 2 nhóm: nhóm vi sinh vật có lợi cho thực vật và nhóm vi sinh vật gây bất lợi cho thực vật

Các vi sinh có lợi chiếm ưu thế là các vi sinh vật kích thích sự sinh ở thực vật sinh trưởng Việc tìm hiểu và xác định các cơ chế này rất khó khăn do sự đa dạng của các cơ chế Đối với các vi sinh vật cố định đạm, sự kích thích sinh trưởng chỉ thấy rõ khi cây sống trên vùng đất nghèo đạm Đến nay khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đến nay được hiểu theo 4 con đường chính

- Gia tăng lượng các chất dinh dưỡng ở dạng dễ sử dụng cho cây - Sản xuất các phytohormone kích thích sinh trưởng thực vật - Tăng cường ảnh hưởng có lợi của các tương tác cộng sinh - Giảm tác động có hại của các mầm bệnh

2.2.1.1 Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật: thường được

tìm thấy ở các vi sinh vật nội sinh Các vi sinh vật nội sinh bảo vệ cây khỏi sự tấn công của các mầm bệnh bằng các cơ chế sau:

Cạnh tranh về nơi ở và dinh dưỡng

Các endophyte thuộc nhóm này có khả năng sinh sản rất nhanh chóng, chúng vượt qua số lượng các mầm bệnh trong cây và ức chế sự sinh sản cũng như dinh dưỡng của mầm bệnh Ví dụ điển hình trong trường hợp này là một số loại nấm men Sự sinh sản bằng cách nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lượng một cách

nhanh chóng và khiến sự nảy mầm của các bào tử B cinerea hoàn toàn bị ức chế

Sự tổng hợp các loại hợp chất thứ cấp

Trong nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy các vi sinh vật nội có sự sản sinh ra các loại hợp chất thứ cấp có hoạt tính của kháng sinh do đó chúng có khả năng ức chế và tiêu diệt một số loại nấm bệnh

Như trường hợp của 2 loại kháng sinh tự nhiên do Sporothrix floccolosa sản

xuất ra là: heptadeceonic và methyl-hepadecenoic acid có khả năng kháng khuẩn và

kháng một số loại nấm như: B cinerea, Fusarium oxysporum sp Urquhart và Punja (2002) cũng đã tinh chế một ester acid béo với hoạt tính kháng nấm từ Tilletiopsis pallescens

Enzyme phân hủy vách tế bào [16]

Nhiều nghiên cứu cho thấy , các vi sinh vật tương tác thực vật có khả năng sản sinh ra các loa ̣i enzyme phân hủy thành lysis của tế bào các loa ̣i mầm bê ̣nh như : enzyme chitinase, β-1,3-glucanase

Mô ̣t số loa ̣i nấm men như Pichia anomala, P membranifaciens,R glutinis, C laurentii, A pullulans, Tilletiopsis albescens, tạo β-1,3-glucanase chống lại các loa ̣i

nấm gây bê ̣nh trên lá và trên quả như : A niger, Sphaerotheca fuliginea, P xanthii

(Urquhart, 1994; Castoria, 1997; Jijakli và Lepoivre 1998; Castoria và cô ̣ng sự , 2001; Masih và Paul 2002) Trong công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý

với vi khuẩn Methylobactreium sp và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây

[16]

Kích thích phản ứng phòng vệ ở cây chủ

Sự cảm ứng này liên quan đến viê ̣c sản xuất mô ̣t số hợp chất như

phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase và ethylene trong mô tế vào thực vâ ̣t

2.2.1.2 Vi sinh vật gia tăng dinh dƣỡng cho cây [16]

Khả năng cố định nitơ (biến đổi nitơthành amonia) chủ yếu giới hạn trong giới prokaryotes nhưng đa dạng giữa các giống vi khuẩn Nằm trong số gần 100 loại cố định nitơ (diazotrophic), chỉ có một vài loại có tính chuyên biệt cao, các tương tác mật thiết có thể tạo một cơ quan mới hay một cơ quan có cấu trúc giống với cơ quan của cây chủ Tương tác đạt cực đại khi chúng chuyển sang cố định nitơ cho cây chủ, theo đó cung cấp một lượng dinh dưỡng cho cây chủ Ngược lại cây chủ cũng giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện môi trường và cung cấp các hợp chất giàu năng lượng cho hoạt động cố định nitơ Các vi sinh vật cố định đạm bao gồm vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu, các vi sinh vật tự do cố định đạm, các vi khuẩn lam…

 Vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu

Nghiên cứu điển hình nhất về tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật là tương tác giữa vi khuẩn tạo nốt sần trên rễ và các cây họ đậu Các cây thuộc họ này bao gồm: đậu hòa lan, đậu nành, đậu lăng và cỏ linh lăng cũng như các loại cỏ trinh nữ, cây keo…

Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn cộng sinh được phân loại thành

vài giống, và các loài chuyên biệt nhất thuộc giống Rhizobium, Sinorhizobiu, Mesorhizobium, Bradyrhizobium

Hầu hết các vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu đều tạo ra nốt sần trên rễ (các nốt sần này là những tín hiệu cho thấy có sự tương tác giữa vi khuẩn và cây trồng) Và trong sự đáp ứng này, có sự sản xuất các phân tử tín hiệu lipochitooligosaccharide thường được gọi là các nhân tố Nod Các nhân tố Nod khiến các sợi rễ xoắn lại, hạn chế sự thủy phân của thành tế bào bên trong các nốt xoắn, sự lõm vào của màng plasma, sự lắng đọng của vật liệu tạo vách tế bào mới tạo ra dòng xâm nhiễm Chúng giữ vai trò như một đường ngõ đi vào mô cây Vi khuẩn phân chia bên trong các dòng này khi chúng phát triển xuyên qua nhiều lớp vỏ tế bào trong rễ Một số loài vi khuẩn cộng sinh cây họ đậu khác lại xâm nhập vào cây thông qua các lỗ hổng ở biểu bì và di chuyển xuống vùng gian bào của rễ, có hoặc không có sự hình thành các dòng xâm nhiễm

Ở một vài loài cây chủ như là cỏ linh lăng và đậu hà lan, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân bên trong vỏ tế bào và gây nên các nốt sần bất định (các nốt sần này tiếp tục kéo dài phụ thuộc vào sự liên tục của mô phân sinh ở đỉnh); ở các cây chủ khác như đậu nành, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân của vùng bên ngoài lớp vỏ tế bào và dẫn đến sự hình thành nốt sần bất định Ở hai trong số 3 phân họ

cây họ đậu (Mimosoideae và Papilionoideae), vi khuẩn di chuyển từ dòng xâm

nhiễm vào trong tế bào chất của tế bào cây chủ bằng cơ chế nhập bào (endocytosis) Nó cho phép vi khuẩn được bao bọc bởi màng tế bào thực vật Các vi khuẩn ở trong vùng gian bào và nội bào này được gọi là các bacteroid, phân chia cho đến khi chúng chiếm đầy tế bào cây chủ và phân hóa thành dạng giàu nitrogenase, enzyme

Sự gia tăng độ

mật thiết của

các tương

3 Vi sinh vật bên trong mô cây chủ (Endophytes)

Ví dụ: Herbaspirillum sp ở cây mía đường

4 Vi sinh vật chỉ sống trên bề mặt cây

Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella

quan trọng để cố định nitơ Trong phân họ Caesalpinoideae, các vi khuẩn không rời

khỏi trong dòng xâm nhiễm thay vào đó, các dòng xâm nhiễm phân nhánh cho đến khi nó chiếm đầy tế bào chủ Sự cố định nitơ chỉ xảy ra khi nồng độ oxi tự do trong nốt sần đủ thấp để cho phép kích hoạt enzyme nitrogenase Protein liên kết oxy leghemoglobin ở thực vật (có chức năng liên quan tới hemoglobin, giữ vai trò làm giảm lượng oxy khi xử dụng oxy để hô hấp)

Ngoài ra còn có các các sinh vật nội bào cố định đạm không hình thành nốt sần (diazotrophic endophyte) đã được phân lập từ một số loại cây thân thảo như: bắp, lúa, mía đường, lúa mì…ví dụ điển hình về vi khuẩn nội bào cố định đạm là

Gluconacetobacter diazotrophicus (trước đây là Acetobacter diazotrophicus), Herbaspirillum spp ở cây mía, Alcaligenes, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter, , Klebsiella, Pseudomonas và Rhizobium trên lúa và bắp (James, 2000) Khi chủng

các loại vi khuẩn nay lên rễ, chúng sẽ xâm nhiễm vào rễ và nhiều khi là vào hệ thống mô mạch tạo thành các quần thể vi sinh vật trong vùng gian bào và có thể đạt nồng độ 101- 107 tế bào trên 1 gram trọng lượng tươi [16]

 Vi sinh vật tự do cố định nitơ

Đây là các loại vi khuẩn tương tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng cộng sinh chuyên biệt

Hình 2.2: Phổ tương tác cố định

đạm trên thực vật [16]

Hầu hết các prokaryote cố định nitrogene sống trạng thái tự do Sự cố định

nitrogen ở vùng rễ phổ biến hơn do việc cố định nitrogen cần năng lượng lớn, và vùng rễ cây là vùng giàu carbohydrate

Các loài Azospirillum là những loài cố định nitrogen đầu tiên được phân lập từ

rễ cây và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài sinh vật cố định đạm tương tác

thực vật Không giống các sinh vật nội sinh cố định đạm như Gluconacetobacter diazotrophicus và Herbaspirillum sp (nội sinh bắt buộc), Azospirillum sp là nhóm

nội sinh không bắt buộc Chúng vừa sống được cả nội sinh và trên vùng rễ

Bên cạnh nitrogen thì phosphate là loại dinh dưỡng khoáng thứ hai ảnh hưởng nhiều lên sinh trưởng của cây Lượng phosphate trong đất rất dồi dào nhưng phần lớn đều ở dạng chưa hòa tan Nhiều loài vi sinh vật rễ có thể hòa tan các phosphate vô cơ bằng cách tiết ra các acid hữu cơ, như gluconic acid và 2-ketogluconic acid, hay có thể khoáng hóa phosphate vô cơ bằng cách tiết enzyme ngoại bào phosphatases Một số loài vi khuẩn khác sản xuất các hợp chất hữu cơ (gọi là siderophore) các chất này kết hợp với Fe3+, khiến nó dễ chuyển đổi thành dạng dễ sử dụng hơn (Fe2+

) [16]

Hình 2.3 Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa [20]

2.2.2 Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật 2.2.2.1 Enzymes:

Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase) từ các vi khuẩn kích thích sinh

(1-trưởng thực vật ở vùng rễ (Li và ctv., 2000) như: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp Bacillus pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp.và Variovorax paradoxus [19] Cơ chế này được lý giải là

do ACC có khả năng làm giảm ethylen trong rễ (mà ethelen này ức chế sự sinh trưởng của rễ) do đó kích thích rễ phát triển

để kích thích sự sinh trưởng ở thực vật Chúng thường là các vi khuẩn gây bệnh như

Argobacterium tumefaciens, A rhizogenes và P syringae pv

Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh trên

thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ, ngược lại chúng còn có khả năng hỗ trợ cây chủ phát triển rất tốt Holland và Polacco (1994) đã nghiên cứu về

Methylobacterium, cytokinin và sự phát triển của thực vật bằng cách đun hạt đậu

nành (500C trong 4 giờ) để giảm khả năng nảy mầm xuống khoảng 30% Khi đó mật độ PPFM nhiễm ở hạt cũng đồng thời giảm xuống 90% Việc bổ sung cytokinin (benzyl adenine + zeatin 0,5 mg/l) vào các hạt này có tác dụng phục hồi tỉ lệ nảy mầm Bổ sung PPFM vào môi trường hạt nảy mầm cũng có tác dụng tương tự như tác dụng của cytokinin [10] Kết quả này phù hợp với giả thuyết cho rằng PPFM ảnh hưởng đến lượng cytokinin có trong mô tế bào thực vật

Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối liên hệ giữa Methylobacterium sp và thực vật ở mức phân tử Họ chứng minh bốn loài Methylobacterium sp phân lập từ lá và loài M extorquens đều tạo ra cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và

tiết vào môi trường nuôi cấy [15]

Tuy nhiên, kết quả của Koenig và cộng sự đã cung cấp bằng chứng về cơ chế

tổng hợp cytokinin ở các chủng Methylobacterium, là tiền đề cho các nghiên cứu về mối quan hệ giữa Methylobacterium và thực vật Hơn nữa, bằng chứng về một vi

khuẩn hội sinh tạo phytohormone đã đưa đến cái nhìn thấu đáo hơn về vai trò của vi

khuẩn Methylobacterium sp với thực vật

Kết quả: Methylobacterium sp có khả năng tổng hợp cytokinin phù hợp với những khám phá khác và một số dinh dưỡng methyl khác (như Methylomonas methanica, Methylovorus may) có khả năng tổng hợp cytokinin [7] Hơn thế nữa,

Joshi Jagmoha và Holland (2001) đã đưa ra giải pháp tăng năng suất bằng cách phun PPFM lên cây trồng [21]

Bên cạnh đó năm 2004, Omer và cộng sự đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trường chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn biến dưỡng methyl Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong 16 chủng phân lập có phản ứng dương tính với với thuốc thử Salkowski Điều này được chứng minh rõ hơn bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết hợp với phân tích phổ NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng từ hạt nhân) Ba chủng tạo ra IAA có hàm lượng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/l nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP) Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA tạo ra chỉ từ 1.1 – 2,4 mg/l [17], [9]

Các kết quả này đã gây được sự chú ý lớn Agricell Report nhấn mạnh: “Việc khảo sát về khả năng vi khuẩn dinh dưỡng methyl kích thích tăng trưởng và phát

sinh hình thái thực vật trong điều kiện in vitro là rất lý thú và mang lại rất nhiều

triển vọng”

Hy vọng rằng các nghiên cứu về mặt sinh lý, sinh hoá và cơ chế phân tử của vi khuẩn dinh dưỡng methyl tương tác với thực vật sẽ đem lại những hiểu biết hơn về

nguyên lý của mối quan hệ này đồng thời mở ra hướng ứng dụng mới của công

nghệ sinh học trong nông nghiệp ở điều kiện in vitro và in vivo

2.3 Các phương pháp định danh vi sinh vật

Từ lâu thì việc định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật Đồng thời, phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành để cho kết quả nhanh chóng và chính xác

2.3.1 Phương pháp truyền thống

Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào Mặc dù phương pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các chủng mới [1]

Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiệu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [22]

 Sữ dụng khóa phân loại

Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại

Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) [3]

Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất phức tạp Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên Trong khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống Sau Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện [2]

Đến năm 1952, J Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North Holland, Pub Co Amsterdam), được xuất bản lần thứ hai năm 1957 Năm 1970, J Lodder bổ sung sửa chữa lại và in tái bản lần thứ nhất năm 1970, lần thứ hai 1971 Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên thế giới Hệ thống phân loại này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định 349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau [2]

 Sử dụng phương pháp số học

Ngoài ra, dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh vật, người ta còn có thể tính hệ số tương đồng để đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi sinh vật Trong đó hệ số Jaccard được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa hai chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu [1]

2.3.2 Phương pháp hiện đại  Giới thiệu

Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền [3]

Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”

Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ

có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự [1]

Phương pháp hiện đại dùng để định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA

Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang được sử dụng hiện nay:

 Sử dụng mẫu dò kết hợp với phương pháp lai in-situ phát huỳnh quang (Fluorescence in-situ Hybridazation - FISH)

Mẫu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid nucleic (DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, dùng để nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước

Phân tích dữ liệu các trình tự SSU rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới Một số trình tự nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài cũng đã được xác định Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật mới

Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng hợp, đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các giới này Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic prode)

Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích hợp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp

lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính

hiển vi huỳnh quang, người ta có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào Kỹ

thuật lai và phát hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH)

Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật

 Phương pháp lai nucleic acid [4]

Thành phần base của DNA chỉ có tác dụng chứng minh các vi khuẩn là không có liên hệ với nhau Tỷ lệ các base trong DNA có thể thay đổi trong phạm vi rất rộng Nếu hai vi sinh vật có thành phần base khác nhau thì chúng không có liên hệ với nhau Tuy nhiên, hai vi khuẩn có cùng thành phần base chưa hẳn là có quan hệ với nhau do trình tự base có thể khác nhau Việc lai giữa các DNA của hai vi khuẩn cho phép định danh một loài mới hoặc xác định mối quan hệ đến mức giống và loài giữa hai vi khuẩn

Để xác định mối quan hệ giữa các chủng, thông thường người ta so sánh phần trăm lai (DNA-DNA) giữa chủng cần khảo sát với một chủng đã biết (chủng chuẩn) DNA từ chủng chuẩn được ly trích, tinh chế, đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, phân đoạn thành những đoạn ngắn có chiều dài ngẫu nhiên, đun nóng để tách mạch DNA từ các chủng được khảo sát cũng được chuẩn bị tương tự nhưng không được đánh dấu Tiến hành lai mẫu DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng) Sau đó tuần tự lai DNA chủng chuẩn với DNA chủng cần khảo sát Thu lấy DNA mạch kép (có lai), loại bỏ DNA mạch đơn Đo năng lượng phóng xạ của trường hợp đối chứng Lượng này được xem là tương đương 100% lai Tương tự tính năng lượng phóng xạ thu được từ các trường hợp lai giữa chủng chuẩn với chủng được khảo sát Tính phần trăm lai

Từ số liệu về mức độ lai có thể xác định mối tương quan giữa các chủng như sau:

- Trên 70% lai: 2 chủng cùng loài (khác chủng) - Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài) - Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống

Lai nucleic acid dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các base A-T và G-C Các đoạn polynuclotide đơn có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với nhau thì chúng có thể bắt cặp với nhau tạo ra phân tử lai

Một số phương pháp lai nucleic acid thường được sử dụng: - Phương pháp lai Southern Blot

- Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Rectriction Fragment Length polymorphism – RFLP) hay phương pháp dấu vân tay (Finger Printing)

- Phương pháp lai Northern Blot

 Khuếch đại trình tự đặc hiệu nhờ phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [12], [17]

Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, thì ta cần khuếch đại chúng bằng

phương pháp PCR PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch

khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Kỹ thuật này do Karl Mullis và ctv (Mỹ) phát minh năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm

Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành một số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethibium bromide

Kỹ thuật PCR được coi là nền tảng của nhiều kỹ thuật phân tích DNA

 Giải trình tự các gen mã hóa cho tiểu phần rRNA 16S

Muốn nghhiên cứu trình tự các nucleotide của một gen, một đoạn DNA, hoặc cả phân đoạn DNA cần phải tiến hành giải trình tự Một số phương pháp giải trình tự thường dùng hiện nay:

Phương pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Các đoạn

DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở dầu 5’, và được xử lý bằng các chất hóa học nhằm bẻ gãy các đoạn DNA tại các vị trí các base khác nhau

Phương pháp dideoxy (Phương pháp Sanger,1977): dựa trên hoạt động của

enzyme DNA Polymerase xúc tác phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide, và dừng lại khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTP)

Giải trình tự DNA tự động: Dựa vào sự phát tín hiệu huỳnh quang từ những

dNTP được đánh dấu Ngoài ra, gần đây hai kỹ thuật mới được thiết lập cũng được sử dụng để định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền là Ribotyping và FAME (Fatty Acid Methyl Ester):

 Kỹ thuật Ribotyping

Kỹ thuật này cũng phân tích SSU rRNA (nhưng không giải trình tự) giúp định danh vi sinh vật đến mức loài, dựa trên sự sai khác trong trình tự nhận diện của các enzyme cắt giới hạn Gen mã hóa cho SSU rRNA được khuếch đại bằng PCR, cắt bằng một hoặc vài enzyme cắt giới hạn, tách bằng điện di và lai bằng các mẫu dò Các vạch lai là chuyên biệt cho từng loài và chủng vi sinh vật, được đưa vào cơ sở dữ liệu và được sử dụng như là các mã vạch để định danh vi sinh vật []

 Kỹ thuật Fame (Fatty Acid Methyl Ester)

Kỹ thuật này dựa trên tính chuyên biệt về chủng loại và thành phần các acid béo hiện diện trong màng tế bào vi khuẩn Tính chuyên biệt này là do sự đa dạng về chiều dài mạch, nhóm thế, vòng, hydroxyl, độ không bão hòa,…của acid béo trong màng Việc phân tích dẫn xuất methyl ester của các acid béo này ngày càng được dùng rộng rãi trong chuẩn đoán bệnh, dịch tễ học, xét nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm… [4]

Chương 3

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 03/2007 đến ngày 08/2007

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Nguồn mẫu để phân lập vi sinh vật (VSV) kích thích tăng trưởng ở thực vật là mẫu lá, mẫu đất, mẫu nước tại Vườn quốc gia Cát Tiên thuộc địa phận huyện Tân Phú, Tỉnh Đồng Nai vào tháng 4 năm 2007

Chủng vi khuẩn chuẩn Methylobacterium extorquen JCM 2802T từ ngân hàng vi sinh vật Nhật Bản

E coli DH5α từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia Tp HCM

Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L cv Samsun) lấy từ Trại thực nghiệm Sinh

học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM, cơ sở Linh Trung-Thủ Đức, sử dụng để khảo sát hoạt tính kích thích sự tăng trưởng thực vật của chủng VSV phân

lập được trong điều kiện nuôi cấy in vitro

Hạt đậu xanh (Vigna radiata L., công ty cổ phần giống cây trồng miền Nam –

282, Lê Văn Sĩ, Q.Tân Bình, Tp.HCM), được sử dụng để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt

3.2.2 Thiết bị dụng cụ

 Bể ổn nhiệt (Fisfer Scientific)

 Bộ điện di ngang Mupid-EX (advance)  Cân phân tích

 Eppendorf, micropippette, microplate (Nikko)  Hộp soi đèn tử ngoại UV (Vilber Lourmat)  Kính hiển vi

 Máy đo quang phổ (Gene Quantpro)  Máy lắc tròn

 Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zantrifugen)  Lò Microwave

 Nồi hấp vô trùng autoclave  Tủ ấm Prolabo

 Tủ cấy vô trùng

 Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus)

Và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm sinh phân tử, vi sinh, nuôi cấy mô thực vật

3.2.3.2 Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO)

Môi trường khoáng MS trong đó loại bỏ một số thành phần khoáng chứa nitrogen

Khoáng MS đã được thay thế (Phụ lục 1) Đường 30g/l

Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng ở 1210C, áp suất 1 atm

3.2.3.3 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS)

Môi trường khoáng MS - Murashine & Skoog, 1962 (Phụ lục 3) bổ sung thêm: Đường sucrose 30g/l

Glycine 2mg/l Meo-inositol 100mg/l

Vitamine B1 100ml/l Cao thịt 2g/l Casein hydrolyase 2g/l

Nước cất vừa đủ 1L 3.2.3.4 Các môi trường khác

 Môi trường khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng vi sinh vật phân lập được

Môi trường dịch thể MMS trong đó Methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp nguồn carbon và bổ sung thêm chất chỉ thị pH là bromothymol blue với nồng độ cuối là 0,04%

Các chất cung cấp nguồn carbon bao gồm: acetate, betain, citrate, D-glucose, dimethylamine, ethanol, fructose, lactose, L-Abrabinose, L-glutamate, maltose, methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar

 Môi trường YM broth

Quan sát hình thái nấm men

Yeast Extract 3,0g Malt Extract 3,0g Peptone 5,0g Glucose 10,0g Nước cất vừa đủ 1L

 Môi trường acetate agar Quan sát bào tử nấm men

CH3COONa 200g Agar 20g

Nước cất vừa đủ 1L  Môi trường lên men đường

Glucose 10g Pepton 10g NaCl1 1g Meat extract 1g Chất chỉ thị pH Bromothymol Blue 0,018g/l

Nước Cất vừa đủ 1L  Môi trường đồng hóa nitrogen

Khảo sát khả năng đồng hóa nitrate

Bacto Yeast Cacbon base 117g/l Bổ sung thêm KNO3 (0,78%)

Nguồn Nitrogen được lọc vô trùng

 Một số hóa chất khác

- Bộ kit nhuộm gram của hãng MERK (Đức)

- Bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh trực khuẩn Gram âm của công ty Nam Khoa

- KOH 3% dùng để thử nghiệm String - H2O2 30% dùng trong thử nghiệm Catalase - Glycerol để giữ giống vi sinh vật

- Các hóa chất dùng trong nghiên cứu về sinh học phân tử như: dung dịch CTAB 2X, TE 0.1X, TAE 2X, Phenol:Chloroform (1:1), DEPC-H2O, Tag DNA

Polymerase, dNTP, Buffer 10X,…

3.3 Phương pháp thí nghiệm

Phương pháp thực hiện được trình bài dưới bảng sau:

Sơ đồ 3.1: Qui trình thí nghiệm 3.3.1 Phân lập và làm thuần

Vi sinh vật hiện diện trong tự nhiên ở các dạng quần xã gồm nhiều quần thể Việc nghiên cứu một quần thể VSV nhất định (tập hợp các tế bào cùng loài) sẽ phụ

Chủng thuần Nguồn mẫu

Phân lập, làm thuần

Kích thích sự nảy mầm hạt

(in vivo)

Kích thích sự tăng trưởng

thuốc lá (in vitro)

Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Định danh theo khóa phân loại của Lodder Phân tích trình tự

rDNA 16S

Định danh loài

thuộc nhiều vào khả năng phân lập, làm thuần tế bào của quần thể, khả năng giữ giống dùng cho các nghiên cứu tiếp theo Hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện trên chủng thuần

Phần lớn các phương pháp phân lập và làm thuần các chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng kết hợp với điều kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế cho

chủng quan tâm Theo Green P.N (1992), Methylobacterium sp là những vi khuẩn

có khả năng sử dụng Methanol làm nguồn carbon và năng lượng, vì thế môi trường MMS (Methanol Minerol Salts) là môi trường thích hợp để phân lập và làm thuần các chủng VSV có khả năng sử dụng methanol

Tuy nhiên, môi trường MMS chưa bổ sung Methanol có thành phần gần giống với môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962), vì vậy có thể sử dụng luôn môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) bổ sung thêm 1% Methanol làm môi trường phân lập và làm thuần VSV

Mặc khác các chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ chúng tôi sử dụng môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) nhưng loại bỏ các thành phần có chứa nitơ (MSO)

3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh mẫu:

Các mẫu đất, nước, lá lấy từ khu vực rừng Bầu Sấu thuộc vườn Quốc gia Cát Tiên

Mẫu nước có thể trải trực tiếp trên môi trường MMS và MSO

Còn đối với mẫu đất và mẫu lá, tiến hành tăng sinh trên môi trường MMS, và MSO lỏng lắc 100 vòng/phút từ 2 đến 3 ngày

3.3.1.2 Phân lập chọn lọc

Hút 100 µl mẫu (nước, đất, lá) từ từng môi trường chọn lọc và trải lên môi trường rắn MMS, MSO tươngứng, ủ ở nhiệt độ 25-30oC Sau 2-4 ngày quan sát và chọn tất cả các khuẩn lạc đơn đem đi làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần liên tiếp (3-4 lần) trên đĩa môi trường rắn tương ứng

3.3.1.3 Giữ giống

Sau khi thu được các chủng thuần đem tăng sinh trong môi trường CMS và giữ giống với Glycerol 35-50%, bảo quản trong điều kiện -20oC

3.3.2 Định tính

3.3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng VSV

trong điều kiện in vitro và in vivo

 Khảo sát trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) Mục đích:

Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các chủng vi sinh vật phân lập được

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), đơn yếu tố, và gồm 46 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại

Điều kiện nuôi cấy:

Nhiệt độ: 24 ± 20

C

Thời gian chiếu sáng: 16h

Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux Ẩm độ: 55% - 60%

Chỉ tiêu ghi nhận: