Luận văn : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA part 3 pdf

26 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh Qua quá trình khảo sát thực tế tại các ruộng trồng rau, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và phân lập đƣợc tổng cộng 8 dòng vi khuẩn nhƣ sau: Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài Tên mẫu Nơi lấy mẫu Cây kí chủ 1 CC1 Huyện Củ Chi Cải ngọt 2 CC2 Huyện Củ Chi Cải ngọt 3 CC3 Huyện Củ Chi Cải ngọt 4 HM1 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 5 HM2 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 6 HM3 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 7 Q12 – 1 Quận 12 Cải ngọt 8 Q12 – 2 Quận 12 Cải ngọt 9 DC vi khuẩn đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri Bƣởi Đốm bệnh do vi khuẩn Đốm do bọ nhảy gây hại trên rau 27 Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau. Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới kính hiển vi soi nổi. Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch (a) vi khuẩn ly trích từ lá bệnh trên môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau khi phân lập trên môi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy. a b 28 4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới Cây kí chủ sạch bệnh trồng trong nhà lƣới sau khi chủng 4 ngày đƣợc tiến hành quan sát triệu chứng. Kết quả cho thấy các dòng CC1, CC2, CC3, HM1, HM2 và Q12 – 1 gây triệu chứng bệnh trên cây cải ngọt trồng trong nhà lƣới. So sánh vết bệnh tạo ra trên lá cải thu thập ngoài ruộng và lá cải đƣợc chủng trong nhà lƣới, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về triệu chứng. Ở những lá cây nhiễm bệnh, qua hình chụp đốm bệnh dƣới kính hiển vi soi nổi, ta có thể thấy rõ triệu chứng: từ vết thƣơng ban đầu, vi khuẩn xâm nhập các mô, gây hoại tử các mô tế bào lá. Vết bệnh phát triển rộng dần tạo thành đốm màu nâu đen rõ rệt. Còn ở những lá không bị nhiễm, những tế bào tại vùng bị tổn thƣơng bị chết tạo thành vết sẹo màu trắng, không có triệu chứng bệnh. a d b c 29 Hình 4.4 Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp dƣới kính hiển vi soi nổi (a) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày; (b) vết thương do kim châm tạo ra trên lá không bị bệnh; (c) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo ở lá chủng không nhiễm bệnh nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol. Đốm bệnh Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và bên trái bị nhiễm (a) lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày; (b) lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol. 4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn a b 30 Quá trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu. DNA thu đƣợc phải đáp ứng đƣợc yêu cầu về hàm lƣợng và độ tinh sạch. Sau khi tiến hành tách chiết theo đúng quy trình 8 mẫu vi khuẩn, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn (genomic DNA) 1: CC1, 2: CC2, 3:CC3, 4: HM1, 5: HM2, 6: Q12-1, 7: DC. Qua kết quả điện di ta thấy DNA ly trích có chất lƣợng tốt, lƣợng mẫu nhiều và ít tạp nhiễm. Tuy nhiên, để chuẩn bị tốt cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành pha loãng nhằm hịêu chỉnh nồng độ mẫu DNA bằng dung dịch TE. Kết qủa thu đƣợc thể hiện qua band diện di: Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA. DNA thu đƣợc Phần tạp nhiễm 31 Thông thƣờng, sản phẩm ly trích phải qua giai đọan tinh sạch bằng enzyme RNAse nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, dựa vào hình trên, chúng tôi nhận thấy DNA thu đƣợc có độ thuần khiết cao, do đó, không cần thiết phải tinh sạch. Hơn nữa, quá trình tinh sạch sẽ làm gãy DNA ở một mức độ nào đó. 4.4. Kết quả phản ứng PCR 4.4.1. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng. Sau khi hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen trong vùng ITS, chúng tôi tiến hành phản ứng trên các mẫu DNA đã ly trích. Kết quả thu đƣợc rất khả quan. So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR từ các dòng thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1kb. Kích thƣớc sản phẩm hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Goncalves, E.R. và Rosato, Y.B. Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA 1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC. Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh. 1,1kb 32 4.4.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Chọn hai mẫu CC1 và HM2 để tiến hành tinh sạch theo quy trình GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham Company). Cf1 HM2 Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR. 4.4.3. Kết quả PCR vùng hrpF Theo Young Jin Park và ctv (2004), primer XCR và XCF thiết kế dựa trên trình tự gen hrpF có tính chuyên biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có kích thƣớc 535 bp. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR dùng cặp mồi trên đối với các dòng vi khuẩn CC1, CC2, HM1, HM2 và Q12 – 1. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Các dòng CC1, CC2, HM2 và Q12 – 1 tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp, hoàn toàn phù hợp với báo cáo của Young Jin Park và ctv (2004). Do đó, có thể kết luận các dòng vi khuẩn này là Xanthomonas campestris pv. campestris. - Dòng đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri không tạo sản phẩm khuếch đại. - Riêng dòng HM2 tạo sản phẩm có kích thƣớc 1 kb. Tuy là kết quả dƣơng tính nhƣng chƣa thể có kết luận định danh đối với dòng vi khuẩn này. 33 Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF 1: HM1, 2: HM2, 3: CC1, 4: Ladder 1kb, 5: CC2, 6: Q12 – 1, 7: DC. Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Kết thúc đề tài, chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm của Tp. HCM: Tiến hành khảo sát trên ruộng rau, thu thập các mẫu lá xuất hiện các đốm nhỏ màu nâu đen, rửa sạch đất cát, ủ ẩm trong bao ni lông cho vi khuẩn phát triển trƣớc khi phân lập. Phân lập vi khuẩn từ các đốm bệnh trên lá: Rửa sạch lá bằng nƣớc vòi, mỗi mẫu bệnh chọn các đốm bệnh còn mới màu xanh giọt dầu để phân lập. Khử trùng bề mặt, cắt nhỏ mẫu bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng 5 – 10 phút. Hút dịch khuẩn cấy trang lên môi trƣờng PDA, ủ ở 28 o C trong 24 – 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích. Chủng bệnh trên cây cải ngọt sạch bệnh trồng trong nhà lƣới bằng phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng cách xâm kim và nhiễm vi khuẩn trên vết thƣơng. 535 bp 1 kb 34 Ly trích DNA từ vi khuẩn bằng phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi khuẩn tăng sinh bằng môi trƣờng LB lỏng. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử dụng cặp primer Xan1330 và Xan322 làm vật liệu giải trình tự. Thực hiện phản ứng với thành phần nêu trong Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2. Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF và XCR khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF . Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.3. Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng định vi khuẩn gây bệnh thuộc loài Xanthomonas campestris pv. campestris. Chúng tôi đã xác định đƣợc các dòng CC1, CC2, HM1 và Q12–1 gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris. 5.2. Đề nghị Tiến hành khảo sát, nghiên cứu ở quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn hơn trên các cây rau họ thập tự. Cụ thể là mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long, Lâm Đồng, Long An và các tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu trên phổ kí chủ rộng hơn (cây họ thập tự). Hoàn thành đề tài ở mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn gây bệnh, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có cơ sở. Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật RFLP. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206. 3. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virút hại cây trồng. NXB Giáo Dục Hà Nội. Trang 99 – 100. 4. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng rau ngoại thành Tp Hồ Chí Minh. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. 5. Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996. Sổ tay người trồng rau . Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 114 trang. 6. Trần Thanh Tùng, 1997. Những bệnh hại quan trọng trên một số loại rau trồng phổ biến tại Tp Hồ Chí Minh và biện pháp phòng trừ. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. [...]... radish Phytopathology 9 3: 1292 – 130 0 13 Massomo, S.M.S., Hanne Nielsen, Mabagala, R.B., Keld Mansfield – Giese, John Hockenhull, and Mortensen, C.N., 20 03 Identification and characterisation of Xanthomonas campestris pv campestris strains from Tanzania by pathogenicity tests, Biolog, rep – PCR and fatty acid methyl ester analysis European Journal of Plant Pathology 10 9: 775 – 789 14 Moffett, M.L.,... Aust Plant Pathology Soc 5: 30 – 32 15 Pernezny, K., and Dickstein, E., 20 03 An outbreak of bacterial leaf spot disease of cabbage in Southrn Florida caused by Xanthomonas campestris pv armoraciae Plant Disease 8 7: 872 – 8 73 16 Ruissen, M.A., and Gielink, A.J.,19 93 The development of black rot in cabbage as a result of difference in guttation between cultivars Proceedings 37 of the Eight International... miếng, cho vào 1 lít nƣớc đun sôi trong 40 phút Lọc, thêm nƣớc cho đủ 1 lít, cho dextrose, agar vào, khuấy tan bằng máy khấy từ, dịch môi trƣờng cho vào bình tam giác 250 ml, đem khử trùng bằng nồi hấp ở 121oC trong 30 phút Sau khi hấp, để nguội đến 50o C và đổ vào đĩa petri - Môi trƣờng YGC: Glucose 5g Yeast extract không có agar 5g Calcium carbonate 40 g Agar 15g Nƣớc 1 lít - Môi trƣờng LB: NaCl 10g... protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell Cell 8 7: 130 7 – 131 6 20 Van Gijsegem, F., Genin, S., and Boucher, C.A., 19 93 Conservation of secretion pathways for pathogenicity determinants of plant and animal bacteria Trends Microbiol 1: 175 – 180 21 Veronique Hugouvieux, Barber, C.E., and Daniel, M.J., 1998 Entry of Xanthomoas campestris pv campestris into hydathodes of Arabidopis thalian leaves: a systems... thalian leaves: a systems in bacterial pathogenis Molecular Plant – Microbe Interaction 1 1: 537 – 5 43 22 Vicente, I.G., Everett, B., and Robert, S.J., 2006 Identification of isolates that cause z leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv raphani and pathogenic and genetic coparison with related pathovars Phytopathology 9 6: 735 – 745 23 Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000 Bacterial.. .36 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 7 Bradbury, J.F., 1986 Guide to plant pathogenic bacteria Wallingford, UK: CAB International 8 Gaetan, S., and Lopez, N., 2005 First outbreak of bacterial leaf spot caused by Xanthomonas campestris on Canola in argentina Plant Disease 8 9: 6 83 – 684 9 Goncalves, E.R., and Rosato, Y.B., 2002 Phylogenetic analysis of Xanthomonas species based upon 16S- 23S rDNA intergenic... Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 5 2: 35 5 – 36 1 10 John P Curran, 2002 Automated DNA sequencing (ABI PRISM 31 00) Training Manuals/Protocols 11 Klement, Z., 1982 Hypersensitivity Phytopathogenic Prokaryotes Pages 149 – 177 12 M S Krause, M.S., De Ceuster, T.J.J., Tiquia, S.M., Michel Jr.F.C., Madden, L.V., and Hoitink, H.A., 20 03 Isolation and characterization of rhizobacteria from... phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận Lƣu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy hiểm đến sức khỏe - Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch tris HCl 0.5M, pH8 - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên - Lập lại chu kỳ này một lần nữa Sau đó phủ lên trên dung dịch... phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc) Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH8 Trƣớc hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8 Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nƣớc tinh sạch Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8 2 Thành phần môi trƣờng Chuẩn bị môi trƣờng PDA (potato dextrose agar ): Nguyên liệu Liều lƣợng - Khoai tây gọt sạch vỏ 500 g - Dextrose... campestris Plant disease 8 4: 1008 – 1014 24 Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000 Bacterial leaf spot of leafy crucifer in Oklahoma caused by Pseudomonas syringae pv maculicola Plant Disease 8 4: 1015 – 1020 25 Yuong Jin Park, Byuong Moo Lee, Jang Ho-Hahn, Gil Bok Lee, and Dong Suk Park, 2004 Sensitive and specific detection of Xanthomonas 38 campestris pv campestris by PCR using species specific . quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA 1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC. Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so sánh. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Kết thúc đề tài, chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM. Quy trình đƣợc thực. mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn gây bệnh, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có cơ sở. Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn gây bệnh bằng