Ly trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Đối với
Trichoderma, việc ly trích gặp nhiều khó khăn do thành tế bào rất mỏng và mềm vì đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng chitin thay vì cellulose nhƣ ở thực vật do đó rất dễ vỡ trong quá trình nghiền, bên trong tế bào chất lại chứa hàm lƣợng lớn polysaccharide, protein và lipid.
Qui trình ly trích DNA của chúng tôi đơn giản nhƣng vẫn thu đƣợc DNA có độ tinh khiết cao. Do ở qui trình này, mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng (giúp bảo vệ thành tế bào) đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra, tạo điều kiện thuận lợi cho lysis buffer tác dụng phá thành tế bào. Mặt khác, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1), sau đó thêm bƣớc sử dụng chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) giúp DNA tách ra khỏi protein và loại hết loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA có trong mẫu và phenol còn sót lại. Đồng thời, chúng tôi ly tâm tốc độ thấp (4000 vòng/ phút) kết hợp với kéo dài thời gian vừa phải (10 phút) ở nhiệt độ thấp (10 0C) giúp giảm sự gãy của DNA nhƣng vẫn đảm bảo sự phân lớp và tác dụng của các hóa chất.
Ngoài ra, việc tủa DNA bằng isopropanol (lạnh) để qua đêm và bƣớc dùng que thu tủa DNA mà không cần ly tâm giúp DNA bớt gãy vụng và thu đƣợc DNA tinh hơn. Do đó, DNA ly trích đƣợc với độ tinh khiết cao, đảm bảo cho phản ứng PCR đƣợc xảy ra. Dựa vào những hiểu biết về phƣơng pháp “định lƣợng DNA bằng phân tử Mass” (mục 2.8.3), chúng tôi định lƣợng DNA ly trích đƣợc khoảng 150 ng/ µl.
Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút
Dựa vào band DNA thu nhận đƣợc từ kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma
ly trích đƣợc, tiến hành pha loãng DNA tổng số đến nồng độ thích hợp thực hiện phản ứng PCR. Nồng độ DNA sau khi pha loãng khoảng 15 ng/ µl
Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút