Năm 2002, Christian P. Kubicek và cs giải mã trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron, khuếch đại bằng cặp primer tef1fw và tef1rev) trên 96 dòng nấm đƣợc phân lập từ những địa điểm khác nhau ở Đài Loan, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Burma, Malaysia và Singapore. Kết luận 37 dòng là T. harzianum, 16 dòng T. virens, 8 dòng là T. spirale, T. asperellum có 4 dòng, T. koningii có 3 dòng, T. atroviride có 3 dòng, 1 dòng là T. hamatum, 1 dòng là T. ghanense và 2 dòng là Hypocrea jecorina (anamorph là T. reesei). Và xác định sự
tƣơng quan, mối quan hệ di truyền của chúng, trong 4 loài T. harzianum, T. virens,
T. asperellum và T. atroviride thì T. harzianum có quan hệ di truyền gần với T. virens nhất và T. asperellum với T. atroviride có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất. Đồng thời, xác nhận phổ hệ di truyền từ đặc điểm hình thái tƣơng đồng với phổ hệ di truyền phân tử vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron).
Cũng vào năm này, Christopher R. Thornton và cs cũng sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA để xác định mối quan hệ di truyền của các loài phân lập đƣợc. Trong 5 loài T. longibrachiatum, T. harzianum, T. virens, T. asperellum và T. atroviride thì
T. harzianum cũng có quan hệ di truyền gần với T. virens nhất và T. asperellum với
T. atroviride cũng có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất, đồng thời T. longibrachianum có mối quan hệ di truyền khá xa với các loài còn lại.
Khi nghiên cứu trên 83 dòng nấm, Gary J. Samuels (2005) dựa vào hình thái nhận diện 72 dòng là Trichoderma và 19 dòng chƣa xác định chính xác có phải đó là Hypocrea hay không. Khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2, đọc trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định tên loài. Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA sẽ ko hoàn toàn chính xác vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng lớn về trình tự vùng này do đây là vùng bảo tồn. Do đó, việc xác định vùng gen chuyên biệt hơn nhƣ vùng gene mã hoá actin (act1), calmodulin (cal1), endochitinase 42 (ech42) và vùng tef1 sẽ giúp việc định danh chính xác hơn, phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Lại Hà Tố Hoa (2006), khuyếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với 2 cặp primer ITS4 – ITS5 và ElongR – ElongF của dòng Trichoderma T4 (đƣợc TS. Lê Đình Đôn và cs phân lập và định danh bằng hình thái tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ mẫu đất tại huyện Củ Chi, Tp. HCM), giải trình tự và so sánh với những dòng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và khẳng định tên loài của dòng T4 là Trichoderma asperellum. Có mức độ tƣơng đồng của vùng ITS – rDNA và vùng tef1fw – tef2rev cùng là 98%.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP