DNA làm khuôn: thu nhận qua quá trình ly trích DNA bộ gen của nấm
Trichoderma, sau đó pha loãng đến nồng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR khoảng 15 – 20 ng/ µl.
Primer: PCR khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 với primer ITS4 và ITS5 (White và cs, 1990) và dựa vào sơ đồ, cấu trúc primer trên toàn vùng tef1 do Chaverri, P. và cs thiết lập năm 2003, chúng tôi chọn cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R (Carbone và Kohn, 1999) để khuếch đại một phần của vùng tef1.
Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng
Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
EF1 – 728F CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG
EF1 – 986R TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC
Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5
Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R
Các thành phần phản ứng PCR đƣợc phối trộn theo thứ tự đƣợc liệt kê ở bảng bên dƣới để đảm bảo hiệu quả cho phản ứng do Taq DNA polymerase khi trộn vào hỗn hợp phản ứng PCR sẽ hoạt động ngay.
Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng Thành phần Thể tích sử dụng ( l) Nồng độ cuối Nƣớc cất 31.75 PCR buffer 10X 10.00 1.0X MgCl2 3.00 1.5 mM dNTP 0.50 0.2 mM Primer 1 1.50 10.0 pmol/ l Primer 2 1.50 10.0 pmol/ l Khuôn DNA 1.50 15.0 ng/ l
Taq DNA polymerase 0.25 5.0 U/ l
Tổng cộng 50.00
Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: tham khảo, kết hợp và cải tiến quy trình của Wang C. Z. (2002), White và cs. (1990), Carbone và Kohn (1999) và VBI – CLF (2002) cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR
Cặp primer ITS4 và ITS5 Cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Chu kỳ Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ Nhiệt độ (0
C) Thời gian 1 95 3 phút 1 95 3 phút 2 – 31 95 1 phút 2 – 31 95 1 phút 58 45 giây 58 45 giây 72 1 phút 72 1 phút 31 72 10 phút 31 72 10 phút 3.9. Đánh giá kết quả PCR
Thực hiện tƣơng tự nhƣ phần đánh giá DNA pha loãng ở mục 3.7 (kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA). Các dòng nấm khác nhau đƣợc khuếch đại cùng
một cặp primer, trên band điện di không thể phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các dòng này, do đó cần phải giải trình tự sản phẩm PCR để phân tích.
3.10. Định danh tên loài 11 dòng Trichoderma
Sản phẩm PCR của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng nấm
Trichoderma khảo sát đƣợc giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng
Trichoderma khảo sát. Dữ liệu trên NCBI đƣợc chúng tôi so sánh với nhau (bằng phần mềm Clustal X 1.83) trong phạm vi từng loài để chọn ra trình tự ổn định nhất (không có đột biến) và 1 – 2 trình tự đột biến phổ biến (không có đột biến điểm đơn lẻ). Việc làm này nhằm loại bỏ hiện tƣợng trình tự dòng khảo sát có tỉ lệ tƣơng đồng cao với trình tự đột biến của loài khác, sẽ làm nhiễu kết quả so sánh trình tự. Các loài đƣợc sử dụng cho so sánh dựa theo tiêu chí
Loài đƣợc định danh dựa vào hình thái.
Loài có đặc điểm gần giống về hình thái với loài định danh dựa vào hình thái.
Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI
Tên loài Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian công bố Tác giả T. asperellum
AY266673 Trung Quốc 01-04-2003 Zhang,C.L. và Xu,T. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
AY380912 Mỹ 03-09-2003 Samuels,G.J. và cs
T. atroviride AY585878 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs
Z48818 Đức 29-03-1995 Kuhls,K.
T. hamatum
AJ507086 Úc 28-08-2002 Wuczkowski,M. và
Kubicek,C.P.
Z48816 Đức 29-03-1995 Kuhls,K.
AF362101 Hàn Quốc 19-03-2001 Park,D.S. và cs
T. koningii DQ313146 Canada 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs
DQ313135 Brazil 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs
T.
longibrachiatum
AY328038 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs
DQ297053 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs
T. reesei X93938 Đức 04-12-1995 Kuhls,K. và cs
T. sinensis DQ083012 Đài Loan 01-06-2005 Samuels,G.J.
T. tomentosum AY154932 Iran 24-09-2002 Zafari,D.
DQ085432 Canada 03-06-2005 Samuels,G.J.
T. virens
AF057599 Hoa Kỳ 31-03-1998 Ospina,M.D. và cs
AF099008 Hoa Kỳ 16-10-1998 Samuels,G.J. và cs.
T. viride
DQ313155 New
Zealand 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs
DQ315439 Anh 02-12-2005 Samuels,G.J. và cs
Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI
Tên loài Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian công bố Tác giả T. asperellum
AY376058 Hoa Kỳ 28-08-2003 Holmes,K.A. và cs
AY857274 Úc 13-12-2004 Druzhinina,I.S. và cs
T. atroviride AF348112 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DQ307550 Sri Lanka 28-11-2005 Samuels,G.J.
T. harzianum
AF348101 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
AF348103 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
T. koningii DQ288997 Ecuador 14-11-2005 Samuels,G.J. và cs
T.
longibrachiatum
AY937412 Hoa Kỳ 17-02-2005 Samuels,G.J.
DQ297066 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs
T.
saturnisporum AY937414 Nam Phi 14-09-2004 Samuels,G.J. T. sinensis AY750888 Đài Loan 14-09-2004 Samuels,G.J.
T. tomentosum AY750882 Canada 14-09-2004 Samuels,G.J.
Gliocladium
flavofuscum AY750891 Hoa Kỳ 14-09-2004 Samuels,G.J.
Hypocrea
virens AY750894
Cote
d'Ivoire 14-09-2004 Samuels,G.J.
T. viride
AF348116 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
DQ307555 CH. Czech 28-11-2005 Samuels,G.J. và cs
3.11. Phân nhóm xác đi ̣nh mối quan hê ̣ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma
Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng
Trichoderma. Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6 từ đó phân nhóm xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng.
3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới
Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma
phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số Trichoderma (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Đối với
Trichoderma, việc ly trích gặp nhiều khó khăn do thành tế bào rất mỏng và mềm vì đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng chitin thay vì cellulose nhƣ ở thực vật do đó rất dễ vỡ trong quá trình nghiền, bên trong tế bào chất lại chứa hàm lƣợng lớn polysaccharide, protein và lipid.
Qui trình ly trích DNA của chúng tôi đơn giản nhƣng vẫn thu đƣợc DNA có độ tinh khiết cao. Do ở qui trình này, mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng (giúp bảo vệ thành tế bào) đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra, tạo điều kiện thuận lợi cho lysis buffer tác dụng phá thành tế bào. Mặt khác, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1), sau đó thêm bƣớc sử dụng chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) giúp DNA tách ra khỏi protein và loại hết loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA có trong mẫu và phenol còn sót lại. Đồng thời, chúng tôi ly tâm tốc độ thấp (4000 vòng/ phút) kết hợp với kéo dài thời gian vừa phải (10 phút) ở nhiệt độ thấp (10 0C) giúp giảm sự gãy của DNA nhƣng vẫn đảm bảo sự phân lớp và tác dụng của các hóa chất.
Ngoài ra, việc tủa DNA bằng isopropanol (lạnh) để qua đêm và bƣớc dùng que thu tủa DNA mà không cần ly tâm giúp DNA bớt gãy vụng và thu đƣợc DNA tinh hơn. Do đó, DNA ly trích đƣợc với độ tinh khiết cao, đảm bảo cho phản ứng PCR đƣợc xảy ra. Dựa vào những hiểu biết về phƣơng pháp “định lƣợng DNA bằng phân tử Mass” (mục 2.8.3), chúng tôi định lƣợng DNA ly trích đƣợc khoảng 150 ng/ µl.
Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút
Dựa vào band DNA thu nhận đƣợc từ kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma
ly trích đƣợc, tiến hành pha loãng DNA tổng số đến nồng độ thích hợp thực hiện phản ứng PCR. Nồng độ DNA sau khi pha loãng khoảng 15 ng/ µl
Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút
4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1
Dựa vào thang ladder cho thấy qui trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4/ ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F/ EF1 – 986R cho kết quả thể hiện bằng điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, có kích thƣớc lần lƣợt là 600 bp và 320 bp. Tất cả các mẫu đều xuất hiện band mong muốn và hoàn toàn không có band phụ, chỉ có 1 trong tổng số 11 mẫu với cặp
primer ITS4 và ITS5 cho band mờ (mẫu T88), mẫu này khi thực hiện PCR lại chúng tôi tăng lƣợng DNA khuôn lên gần gấp đôi (2.5 ml) thì kết quả PCR cho band sáng rõ, không có band phụ.
Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thƣớc 600 bp
Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R, có kích thƣớc 320 bp
4.3. Kết quả định danh tên loài
Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma
khảo sátđƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng Trichoderma khảo sát.
Dòng T37: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. sinensis, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T37 là
Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI
Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) (mã số truy cập-tên loài-địa điểm phân lập) 1: X93938-T.reesei-Đức 100 99 99 99 99 99 98 2: AY328038-T.longibrachiatum-Hunrary 99 100 99 99 99 99 98 3: DQ297053-T.longibrachiatum-Mexico 99 99 100 100 100 99 99 4: T37-T.sinensis-ITS_rDNA-Việt Nam 99 99 100 100 100 99 99 5: Z48726-T.saturnisporum-Đức 99 99 100 100 100 100 99 6: AF048744-T.saturnisporum-Hàn Quốc 99 99 99 99 100 100 99 7: DQ083012-T.sinensis-Đài Loan 98 98 99 99 99 99 100
Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83)
1: DQ297066-T.longibrachiatum-Mexico 100 100 99 78 78 81 84 2: T37-T.sinensis-tef1-Việt Nam 100 100 99 67 67 69 75 3: AY937412-T.longibrachiatum-Hoa Kỳ 99 99 100 76 75 80 84 4: AY750888-T.sinensis-Đài Loan 78 67 76 100 99 85 79 5: AY750889-T.sinensis-Đài Loan 78 67 75 99 100 85 78 6: AY937414-T.saturnisporum-Nam Phi 81 69 80 85 85 100 78 7: Z23012-T.reesei-Phần Lan 84 75 84 79 78 78 100
Dòng T42: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. viride, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T42 là
Trichoderma asperellum.
Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI
Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83)
1:AY585878-T.atroviride-Hungary 100 100 100 100 99 99 99 98 99 2:Z48818-T.atroviride-Đức 100 100 100 100 100 99 98 98 98 3:DQ313146-T.koningiopsis-Canada 100 100 100 100 100 99 99 98 99 4:DQ313135-T.koningiopsis-Brazil 100 100 100 100 100 99 99 98 99 5:DQ313155-T.viride-New Zealand 99 100 100 100 100 100 98 98 98 6:DQ315439-T.viride-Anh 99 99 99 99 100 100 98 98 98 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 99 98 99 99 98 98 100 100 100 8:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 98 100 100 100 9:T42-T.viride-ITS_rDNA-Việt Nam 99 98 99 99 98 98 100 100 100
Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83)
1:AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 100 99 90 91 89 88 86 77 84 2:DQ307555-T.viride-CH.Czech 99 100 89 92 89 89 85 78 84 3:AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 90 89 100 96 88 89 87 79 86 4:DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 91 92 96 100 90 91 87 85 88 5:DQ288997-T.koningii-Ecuador 89 89 88 90 100 96 84 78 85 6:DQ289002-T.koningii-Brazil 88 89 89 91 96 100 84 78 84 7:AY857274-T.asperellum-Úc 86 85 87 87 84 84 100 92 100 8:T42-T.viride-tef1-Việt Nam 77 78 79 85 78 78 92 100 92 9:AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 84 84 86 88 85 84 100 92 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dòng T38: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi xác định dòng T38 chỉ có thể
là T. virens hay Gliocladium flavofuscum (là một teleomorph của T. virens) hoặc
Hypocrea virens (cũng là một teleomorph của T. virens) nhƣng kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái (là T. virens), chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T38 là Trichoderma virens.
Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI
Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83)
1: AY154935-T.spirale-Iran 100 100 99 99 98 98 98 2: DQ083014-T.spira-Thái Lan 100 100 99 99 98 98 98 3: AF099008-T.virens-Hoa Kỳ 99 99 100 100 98 98 98 4: T38-T.virens-ITS_rDNA -Việt Nam 99 99 100 100 98 98 98 5: AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 98 98 98 98 100 99 99 6: AF455502-T.inhamatum-Úc 98 98 98 98 99 100 99 7: AF057599-T.virens-Hoa Kỳ 98 98 98 98 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83)
1: AY750890-T.spirale-Thái Lan 100 97 89 84 89 85 86 2: AY750896-T.spirale-Canada 97 100 89 84 89 86 86 3: AY750894-H.virens-Cote.d'Ivoir 89 89 100 96 99 85 85 4: T38-T.virens-tef1-Việt Nam 84 84 96 100 96 76 76 5: AY750891-G.flavofuscum-Hoa Kỳ 89 89 99 96 100 85 85 6: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 85 86 85 76 85 100 93 7: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 86 86 85 76 85 93 100
Dòng T19: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T19 là Trichoderma asperellum.
Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI
Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83)
1:DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 100 99 98 98 98 97 97 2:DQ315439-T.viride-Anh 100 100 99 99 97 97 97 97 97 3:Z48818-T.atroviride-Đức 100 99 100 100 97 97 98 97 97 4:AY585878-T.atroviride-Hungary 99 99 100 100 98 98 98 97 97 5:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 97 97 98 100 100 100 99 99 6:T19-T.asperellum-ITS_rDNA-Việt Nam 98 97 97 98 100 100 100 99 99 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 98 97 98 98 100 100 100 99 99 8:AJ507086-T.hamatum-Úc 97 97 97 97 99 99 99 100 100 9:Z48816-T.hamatum-Đức 97 97 97 97 99 99 99 100 100
Dòng T33: đƣợc chúng tôi khẳng định tên loài chính xác là Trichoderma asperellum dựa vào kết quả định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp