KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN PHÁT HIỆN đột BIẾN

Bài 04 Kỹ thuật giải trình tự gen phát đột biến (sequencing) Giảng viên: TS Nguyễn Thị Hà- Trung tâm Xét nghiệm Email: nth16@huph.edu.vn Chuẩn đầu học Sau học xong, sinh viên có khả năng: Tóm tắt nguyên lý ứng dụng số kỹ thuật SHPT ứng dụng chẩn đoán số bệnh di truyền Trình bày nguyên lý giải trình tự gen Ứng dụng giải trình tự gen để xác định số đột biến TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Khái niệm Xác định trình tự ADN việc xác định trình tự xếp nucleotides đoạn DNA TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Các mốc giải mã hệ gen sinh vật khác http://www.genomesonline.org TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Genome Sequencing Supratim Mukherjee; Dimitri Stamatis; Jon Bertsch; Galina Ovchinnikova; Hema Y Katta; Alejandro Mojica; I-Min A Chen; Nikos C Kyrpides; TBK Reddy Genomes OnLine database (GOLD) v.7: updates and new features Nucl Acids Res (2018) doi: 10.1093/nar/gky977 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Các phương pháp xác định trình tự ✓ Maxam-Gilbert method (1977) ✓ Sanger method (1977) ✓ Giải trình tự tự động ✓ Next generation sequencing ✓ Third generation sequencing TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Phương pháp Maxam-Gilbert • Là phương pháp phân giải hóa học • Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN vị trí base đặc hiệu→ tạo đoạn có chiều dài khác TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Citation Trends 600 500 400 300 200 100 2004 2001 1998 1995 1992 1989 1986 1983 1980 Number of Citations 1977 Number of Citations M-G 1977 Citations Year TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method) Nguyên tắc hoạt động: sinh tổng hợp sợi DNA, DNA polymerase cần vị trí 3’OH TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP * Bệnh hemoglobin • Đột biến cấu trúc thay aa ✓ Hemoglobin S ✓ Hemoglobin E ✓ Hemoglobin C • Đột biến số lượng số lượng chuỗi globin ✓ Anpha Thalassemia ✓ Beta thalassemia TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP  Đột biến cấu trúc thay aa Đột biến cấu trúc thay aa 1.1 Hemoglobin S: Bệnh tế bào hồng cầu hình liềm (HbS) 5’.GAG.3’ 3’.XTX 5’ Gen HbS 5’.GTG.3’ 3’.XAX.5’ mARN 5’ GAG 3’ mARN 5’.GUG.3 ’ Protein ….Glu… Protein ….Val… Gen HbA TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP  Đột biến cấu trúc thay aa Bệnh tế bào hồng cầu hình liềm (HbS) -Do biến đổi cấu trúc aa thứ chuỗi beta globin: GAG (Glutamin) → GTG ( Valin) hồng cầu hình lưỡi liềm - Bệnh đột biến gen lặn NST thường -Dạng đồng hợp tử: SS - Dạng dị hợp tử: AS TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP  Đột biến cấu trúc thay aa HC hình lưỡi liềm TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP  Đột biến cấu trúc thay aa Đột biến cấu trúc thay aa 1.2 Hemoglobin C: -Do biến đổi cấu trúc aa thứ chuỗi beta globin: GAG (Glutamin) → AAG (Lyzin) - Bệnh đột biến gen lặn NST thường -Dạng đồng hợp tử: CC thiếu máu tan huyết nhẹ, lách to, máu có nhiều hồng cầu hình bia hc nhỏ - Dạng dị hợp tử: AC khơng biểu lâm sàng TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP ĐỘT BIẾN GEN VÀ BỆNH PHÂN TỬ Ở NGƯỜI Đột biến cấu trúc thay aa 1.3 Hemoglobin E: -Do biến đổi cấu trúc aa thứ 26 chuỗi beta globin : GAG (Glutamin) → AAG ( Lyzin) - Bệnh đột biến gen lặn NST thường -Dạng đồng hợp tử: EE thiếu máu tan huyết nhẹ, lách to, máu có nhiều hồng cầu hình bia hc nhỏ - Dạng dị hợp tử: AE khơng biểu lâm sàng TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến số lượng số lượng chuỗi globin (Thalassemia) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến số lượng số lượng chuỗi globin (Thalassemia) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến số lượng số lượng chuỗi globin (Thalassemia) Thalassemia dạng alpha Có gene: gene từ bố gene từ mẹ • Một gene đột biến: khơng có dấu hiệu triệu chứng (mang gene bất thường di truyền) • Hai gene đột biến: có dấu hiệu triệu chứng nhẹ (thể nhẹ hay alpha-thalassemia thể ẩn) • Ba gene đột biến: dấu hiệu triệu chứng bệnh nặng (bệnh hemoglobin H) • Bốn gene đột biến: thể nặng hay phù thai (chết lưu chết sơ sinh) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP ĐỘT BIẾN GEN VÀ BỆNH PHÂN TỬ Ở NGƯỜI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP ĐỘT BIẾN GEN VÀ BỆNH PHÂN TỬ Ở NGƯỜI Thalassemia dạng beta Có gene: gene từ bố từ mẹ • Một gen đột biến: dấu hiệu triệu chứng nhẹ (thể nhẹ) • Hai gen đột biến: dấu hiệu triệu chứng bệnh nặng (thể nặng thiếu máu Cooley) • Trẻ thường khỏe mạnh sinh, dấu hiệu triệu chứng xuất hai năm đầu đời TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Ứng dụng PCR chẩn đốn bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Kỹ thuật di truyền - Nguyên lý Ứng dụng, Đinh Trường Sơn, dinhtruongson77@gmail.com Ứng dụng PCR chẩn đốn bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Kỹ thuật di truyền - Nguyên lý Ứng dụng, Đinh Trường Sơn, dinhtruongson77@gmail.com • Sau diễn phản ứng, sản phẩm ống trộn lẫn cho điện di “giếng” gel (sẽ cho băng dẫy) … • Gần phần đỉnh gel máy phân tích, kích thích phát huỳnh quang oligo nucleotid tia laser di chuyển qua Màu ánh sáng huỳnh quang Oligo nucleotid phát qua thiết bị điện tử TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP • Thơng tin kết nối với máy tính có phần mềm chương trình hố biến đổi thơng tin màu thành trình tự base Thí dụ xanh da trời màu chuỗi oligonucleotid thu từ phản ứng dideoxy C, kết thúc base ddC, xanh A, da cam G đỏ T • Máy tính in sơ đồ xác định trình tự vừa nêu lưu giữ thơng số TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP ... dụng số kỹ thuật SHPT ứng dụng chẩn đốn số bệnh di truyền Trình bày nguyên lý giải trình tự gen Ứng dụng giải trình tự gen để xác định số đột biến TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN... (haploid) Tốn cho dự án giải trình tự genome người? ~$2.7 tỷ Bao lâu để giải trình tự genome người? ~13 năm Dự án giải trình tự genome người hồn thành nào? 2000-2003 Bộ genome ai? Nhiều người,... quản • Trình tự DNA đọc tự động TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự tự động theo Sanger Phương pháp tự động • Có hai phương pháp giải trình tự tự động