Chuong 11 ky thuat giai trinh tu

Chương 11 Kỹ thuật xác định trình tự ADN Khái niệm •Xác định trình tự ADN việc xác định trình tự xếp nucleotides đoạn DNA Các mốc giải mã hệ gen sinh vật khác http://www.genomesonline.org Genome Sequencing http://www.genomesonline.org/ Các phương pháp xác định trình tự ✓Maxam-Gilbert method (1977) ✓Sanger method (1977) ✓Giải trình tự tự động ✓Next generation sequencing ✓Third generation sequencing Nguyên tắc: Nếu biết khoảng cách loại base từ nguồn gốc biêt, suy trình tự DNA Thí dụ ta biết: A vị trí 2, 3, 11, 13 G vị trí 1, 12, C vị trí 6, 7, 8, 10, 15 T vị trí 4, 5, 9, 14 Thì suy trình tự đoạn DNA ban đầu là: GAATTCCCTCAGTC Để có đuợc thơng tin này, tạo vị trí kết thúc đoạn DNA kéo dài base biêt (A, T, C G) vị trí biết DNA Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN Maxam-Gilbert Method • Là phương pháp phân giải hóa học • Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN vị trí base đặc hiệu→ tạo đoạn có chiều dài khác Các loại hóa chất sử dụng ◼ ◼ ◼ ◼ ◼ Dimethyl sulfat methyl hóa G Axit formic pH=2 gây biến đổi loại A + G Hydrazin gây biến đổi C T Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi C Piperidine dùng để loại bỏ base sau bị biến đổi cắt mạch Base specificity Chemical used for base alteration Chemical used for altered base removal Chemical used for strand cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine Pyrosequencing Biochemistry • Trong trình tổng hợp DNA nhờ DNA polymerase, dNTP gắn vào đầu 3’ mạch DNA giải phóng phân tử phosphates dạng pyrophosphate (PPi) • Sử dụng ATP sulfurylase xúc tác kết hợp PPi adenosine 5’phosphosulfate thành ATP • Luciferase sử dụng luciferin ATP làm chất chuyển hóa luciferin thành oxyluciferin giải phóng lượng dạng ánh sáng Năng lượng ánh sáng tạo thành tỷ lệ thuận với số nucleotides tổng hợp vào mạch DNA • Sau phản ứng kết thúc, sử dụng enzyme apyrase để phân hủy tất dNTPs dư thừa Pyrogram Ronaghi M Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing Genome Res 2001 Overview of The 454 Sequencing System (300-800 base pairs) biotin tag 1) Prepare Adapter Ligated ssDNA Library (A-[insert]-B) 3) Load beads and enzymes in PicoTiter Plate™ CSB2008 August 2008 2) EmPCR: Clonal Amplification on 28 µ beads followed by enrichment 4) Perform sequencing-by-synthesis on the 454 Sequencer UCSC Sequencing Center Emulsion Based Clonal Amplification A + PCR Reagents + Emulsion Oil B Micro-reactors Adapter carrying library DNA Mix DNA Library & capture beads (limited dilution) “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Create “Water-in-oil” emulsion Perform emulsion PCR • Generation of millions of clonally amplified sequencing templates on each bead • No cloning and colony picking CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center Depositing DNA Beads into the PicoTiter™Plate Load beads into PicoTiter™Plate Load Enzyme Beads Centrifuge Step 44 μm CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center Sequencing By Synthesis Sequencing-By-Synthesis ▪ Simultaneous sequencing of the entire genome in hundreds of thousands of picoliter-size wells ▪ Pyrophosphate signal generation DNA Capture Bead Containing Millions of Copies of a Single Clonal Fragment A A T C G G C A T G C T A A A A G T C A T Anneal Primer Sulfuryla se Luciferas e APS ATP PP i luciferin Light + oxy luciferin CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center 454 Technology ion torrent sequencing Advances in DNA sequencing technology 2003: ABI 3730 Sequencer 2012: Oxford Nanopore MiniION Human Genome: $2.7 Billion, 13 Years Human Genome: $900, Hours 20-node GridION setup can sequence a complete human genome in just 15 minutes Giải trình tự Giải trình tự Ghép nối Mục đích: Kết thúc • Tồn bộ genome • Chính xác Định tên gene Cơng bố We know the sequence—but can we understand it? ... (Roche/454FLX) -Sequencing by synthesis (Illumina/Solexa Genome analyzer) -Sequencing by ligation (Applied Biosystems SOLID System) Third generation sequencing - Nanopore sequencing - Real-time monitoring... monitoring of PCR activity -Helicos Helioscope (2008) -Pacific Biosciences SMRT (2010) - Nanopore technology (2012) 41 Next-Generation Sequencing Technologies Landscape of Next-Generation Sequencing... phản ứng đoạn mồi (tổng hợp hóa học, đánh dấu) • Bổ xung DNA polymerase • nucleotides: d-ATP, d-CTP, d-GTP d-TTP • Một lượng nhỏ dideoxynucleotides (ddNTP) (cho vào ống phản ứng riêng rẽ) • Các