Bài 4 giải trình tự gen xác định đột biến kháng thuốc và phenotype của vi sinh vật (1)

Bài 4: Giải trình tự gen xác định đột biến kháng thuốc (genotype) phenotype vi sinh vật Trung tâm Xét nghiệm, Đại học Y tế công công Chuẩn đầu Lấy ví dụ minh họa nguyên nhân đột biến gen liên quan đến kháng thuốc vi sinh vật Diễn giải chế kháng kháng sinh vai trò gen liên quan đến khả kháng kháng sinh vi khuẩn Diễn giải quy trình xác định đột biến kháng thuốc genotype TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen – kháng thuốc TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Kháng thuốc Kháng thuốc gì? + Vi sinh vật phát triển với diện thuốc + Điều trị không hiệu TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Kháng thuốc Ngun nhân: + Chủ yếu đột biến gen nhiễm sắc thể tiếp nhận plasmid kháng thuốc + Nguyên nhân ngồi gen TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen • Các gen liên quan đến kháng sinh: + Gen chromosome + Gen plasmid • • Đột biến gen chromosome : tần suất 10 -7 đến 10 -9 Đột biến gen plasmid: tần suất lớn, lây truyền cao TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc • Cơ chế hình thành tính kháng thuốc: + Đột biến gen + Tái tổ hợp + Tiếp nhận Plasmid + Tiếp nhận Transposon TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc • Một số ví dụ: Vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin: đột biến gen gyrA parC: + gen gyrA: đột biến codon 91 (Ser thành Phe); codon 95 (Asp thành Ala) + gen parC: đột biến codon 85 (Ser thành Asn) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc • Một số ví dụ: Streptococcus pneumoniae kháng erythromycin: đột biến vùng II thuộc gen 23S rRNA: đột biến vị trí codon 225,227,228,231,232 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc Kết phân tích đột biến gen vùng II thuộc gen 23S rRNA chủng Streptocococcus pneumoniae TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự Sanger - - Mỗi ống chứa nồng độ loại ddNTP với nồng độ thấp dNTP  ddNTP gắn ngẫu nhiên làm ngừng chuỗi -  ống biến tính lần điện di gel polyacrylamide phân tách sản phẩm theo kích thước TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự Sanger TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ - NGS (Next Generation Sequencing) -2000 Cho phép giải mã đồng thời hàng triệu DNA lúc Thế hệ (Thế hệ cũ): Phương pháp Frederick sanger: Dùng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp DNA bang đieoxynucleotide TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ - Thế hệ (bắt đầu hệ mới): - PP Pyrosenquencing: Đo lượng PPI giải phóng phản ứng tổng hợp chuỗi AND; PP Semiconductor: đo tín hiệu H+ giải phóng phản ứng tổng hợp chuỗi AND; PP Illumina: đo tín hiệu huỳnh quang gắn vào nucleotide phản ứng tổng hợp DNA TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ - PP pyrosenquencing: phương pháp giải trình tự DNA dựa nguyên lý “đọc trình tự tổng hợp” Khác Sanger: dựa phát giải phóng pyrophosphate (Ppi) dNTP thêm vào chuỗi, thay kết thúc ddNTP - https://youtu.be/bNKEhOGvcaI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ - PP semiconductor: phát trình tự thơng qua việc phát tín hiệu đo hiệu điện ion H+ giải phóng trình tổng hợp DNA máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip cảm ứng TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ - PP Illumina: https://youtu.be/fCd6B5HRaZ8 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Giải trình tự gen hệ - Thế hệ 3: - Gỉai trình tự dựa kỹ thuật phân tích tín hiệu đơn phân tử Phân tích tức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang găn vào nucleotide phản ứng tổng hợp chuội DNA giếng nano - https://youtu.be/NHCJ8PtYCFc TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Tóm tắt ý Lấy mẫu bệnh phẩm Xử lý mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật PCR, GTTG TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Phân tích/trả kết quả, lưu trữ Câu hỏi lượng giá Câu 1: Nguyên nhân làm xuất gen kháng thuốc? A Đột biến gen NST tiếp nhận gen đột biến qua plasmid B Nguyên nhân ngồi gen TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Câu hỏi lượng giá Câu 2: Các kỹ thuật xác định gen kháng thuốc, xác định genotype vi khuẩn thay kỹ thuật xác định phenotype A Đúng B Sai TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Tài liệu tham khảo Nguyễn Vũ Trung, Vi sinh – ký sinh trùng lâm sàng, tập 1, Nhà xuất Y học, 2014 (Trang 35-45) James Versalovic, Karen C Carroll, Guido Funke, James H Jorgensen, Marie Louise Landry, David W Warnock, Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, ASM, 2011 (Trang 1189-1235) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Tài liệu tham khảo 3.George Manuselis Connie R.Mahon, Text Book of Diagnostic Microbiology, Second Edition, Elsevier Health Sciences, 2000 (Chương 13) Jawetz, Melnick, Adelberg, Medical microbiology, 2013 (Chương 11) McGraw-Hill, Molecular Microbiology, 2012 (Trang 1090-1099) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP ... nhân đột biến gen liên quan đến kháng thuốc vi sinh vật Diễn giải chế kháng kháng sinh vai trò gen liên quan đến khả kháng kháng sinh vi khuẩn Diễn giải quy trình xác định đột biến kháng thuốc genotype... HỘI NHẬP Xác định gen đột biến kháng thuốc Xét nghiệm kiểu gen: xác định gen đột biến kháng thuốc: + Xác định xác mặt phân tử + Định hướng điều trị + Dự đoán khả kháng thuốc (genotype  phenotype) ... NHẬP Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc Kết giải trình tự gen phát gen đột biến kháng thuốc vi rút HBV TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Cơ chế kháng kháng sinh