Giáo án thực hành căn bản vi sinh học

MỤC LỤC NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP VI SINH MỤC TIÊU, YÊU CẦU VỀ THỰC TẬP VI SINH VẬT Bài 1: CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI VÀ CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN I SƠ LƢỢC VỀ LỊCH SỬ VÀ CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI Sự phát minh kính hiển vi Các loại kính hiển vi II KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG Cấu tạo Cách sử dụng III CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI 10 IV CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN 10 Cầu khuẩn (Cocci) 10 Trực khuẩn (Bacterium - Số nhiều Bacteria) 10 Xoắn khuẩn 11 V PHẦN THỰC TẬP 11 Bài 2: CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN, KHỬ KHUẨN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT 12 I KHÁI NIỆM .12 II THAO TÁC VÃ KỸ THUẬT VÔ KHUẨN 12 Ý nghĩa thao tác kỹ thuật vô khuẩn thực hành vi sinh vật 12 Các thao tác kỹ thuật vô khuẩn 13 III CÁC PHƢƠNG PHÁP KHỬ KHUẨN .14 Các loại cồn 14 Các hợp chất Phenol .14 Các hợp chất ammonium bậc 14 Các hợp chất halogen 14 Muối kim loại 15 Chọn lựa hoá chất để khử khuẩn 15 IV CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN 15 Đốt lửa nóng 15 Sấy khô không khí nóng (dùng tủ sấy khơ) 15 Tiệt khuẩn nhiệt ẩm dƣới áp lực (nồi hấp Autoclave) 16 Phƣơng pháp Tyndall 18 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Tiệt khuẩn lọc 18 Hóa chất 18 Phóng xạ ion hóa 19 V PHẦN THỰC TẬP 19 Bài 3: KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ CÁC KỸ THUẬT NHUỘM VI SINH VẬT 20 I ĐẠI CƢƠNG VỀ NHUỘM VI KHUẨN 20 Khái niệm nhuộm vi khuẩn 20 Các loại thuốc nhuộm vi khuẩn 20 Giới thiệu sơ lƣợc loại kỹ thuật nhuộm vi khuẩn 20 II CÁCH LÀM TIÊU BẢN 21 Dàn mỏng vết bôi 21 Làm khô 21 Cố định 21 III KỸ THUẬT NHUỘM ĐƠN 21 Mục đích 21 Nguyên tắc 22 Thuốc nhuộm 22 Cách thực 22 Kết soi kính 22 IV PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM 22 Mục đích 22 Nguyên tắc 22 Thuốc nhuộm 23 Cách thực 23 Kết soi kính 24 V PHƢƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL-NEELSEN 24 Nguyên lý 24 Thuốc nhuộm 24 Kỹ thuật nhuộm 24 Kết soi kính 25 VI PHẦN THỰC TẬP 25 Bài 4: CÁCH LẤY, BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN BỆNH PHẨM TRONG CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT 26 I KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC LẤY BỆNH PHẨM 26 Khái niệm bệnh phẩm 26 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Một số nguyên tắc .26 II CÁC LOẠI BỆNH PHẨM, MẪU NGHIỆM THƢỜNG LẤY 27 Máu 27 Các bệnh phẩm đƣờng hô hấp .27 Các bệnh phẩm đƣờng tiêu hoá 28 Bệnh phẩm đƣờng tiết niệu, sinh dục 28 Bệnh phẩm từ vết thƣơng, vết bỏng, áp xe, mụn nhọt .29 Bệnh phẩm tử thi 29 Các loại vật phẩm 29 III PHẦN THỰC TẬP 29 Bài 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN 30 I KHẢO SÁT TRỰC TIẾP BẰNG KÍNH HIỂN VI .30 II PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY 30 Môi trƣờng nuôi cấy 30 Nuôi cấy vi khuẩn 32 Phân lập ria cấy 33 III XÁC ĐỊNH VI KHUẨN 34 IV PHẦN THỰC TẬP 34 Bài 6: CÁC PHẢN ỨNG SINH HOÁ – MIỄN DỊCH DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT .35 I CÁC PHẢN ỨNG SINH HOÁ 35 Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có nitơ 35 Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon .36 Những phản ứng liên hệ đến enzym 37 II CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH .37 Xét nghiệm Viêm gan B (HbsAg) 37 Xét nghiệm HIV 39 III PHẦN THỰC TẬP 40 Bài 7: KHÁNG SINH ĐỒ 41 I ĐẠI CƢƠNG 41 Định nghĩa 41 Mục đích 41 Các yêu cầu thực kháng sinh đồ 41 Các kỹ thuật làm kháng sinh đồ 42 II KỸ THUẬT ĐĨA KHÁNG SINH KHUẾCH TÁN TRONG THẠCH (Kirby - Bauer) 42 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Nguyên lý 42 Chuẩn bị phƣơng tiện 42 III PHẦN THỰC TẬP 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP VI SINH Để đảm bảo an toàn trật tự buổi thực hành phịng thí nghiệm, sinh viên có trách nhiệm thực quy định sau: Phải có mặt phòng thực tập phút trước vào lớp, phải mặc áo choàng trắng đeo bảng tên vào phòng thực tập Phải để cặp xách đồ dùng cá nhân quy định, không để bàn thực tập Ở phòng thực tập phải tuyệt đối giữ gìn trật tự: ngồi chỗ quy định, không đùa giỡn, không hút thuốc hay ăn uống, khỏi phịng thí nghiệm cần xin phép cán hướng dẫn Sử dụng quy cách dụng cụ thí nghiệm kính hiển vi dụng cụ thí nghiệm khác + Trước sau sử dụng cần cấy vi khuẩn phải tiệt khuẩn cách nung đỏ lửa + Khi vô ý làm đổ, vỡ ống nghiệm hay hộp lồng có chứa vi khuẩn phải báo cho cán hướng dẫn biết để xử lý + Các lam kính dùng xong phải để vào bình chứa thuốc sát khuẩn đặt bàn cuối phịng thực tập + Kính hiển vi dùng xong phải lau dầu vật kính (100x) giấy lau kính theo quy định cuối buổi thực tập phải trả vào tủ bảo quản Phải giữ gìn vệ sinh phịng thực tập: không xả rác hay làm vấy bẩn thuốc nhuộm xuống sàn nhà, sau buổi thực tập dụng cụ thí nghiệm, chai thuốc nhuộm cần đặt nơi quy định ban đầu Bàn nhuộm vi khuẩn cuối phịng sau hồn tất buổi thực tập cần làm vệ sinh trả vị trí trước buổi thực tập Sau buổi thực tập phải rửa tay xà phòng hay nước sát khuẩn Ở phịng thí nghiệm sinh viên phải tn thủ quy định phòng thực tập hướng dẫn cán hướng dẫn Các sinh viên không tuân thủ nội quy hướng dẫn buổi thực hành bị đề nghị xử lý kỷ luật Bộ môn hay đề nghị mức kỷ luật trường Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y MỤC TIÊU, YÊU CẦU VỀ THỰC TẬP VI SINH VẬT Qua thực tập sinh viên rèn luyện bước thói quen tỉ mỉ, xác, trung thực người cán Sinh viên học tập phương pháp chuẩn đoán Vi sinh vật Quá trình thực tập giúp sinh viên nắm giữ số nguyên tắc, kiến thức sau: - Sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học - Quan sát hình thể tế bào vi khuẩn - Thao tác nhuộm số phương pháp nhuộm vi khuẩn - Nắm đặc tính sinh hóa vi khuẩn - Biết được, thực trình phân lập, định danh số vi khuẩn gây bệnh quan trọng Thu thập hiểu biết cần thiết định xét nghiệm Vi sinh vật giải thích số kết xét nghiệm Vi sinh vật Thực thành thạo số xét nghiệm chẩn đoán Vi sinh vật đơn giản trường hợp cần thiết Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Bài CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI VÀ CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN Mục tiêu: Trình bày đặc điểm cấu tạo kính hiển vi quang học sáng Nắm cách sử dụng bảo quản sử dụng vật kính x100 Nhận dạng phân biệt loại hình thể vi khuẩn I SƠ LƢỢC VỀ LỊCH SỬ VÀ CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI Sự phát minh kính hiển vi Anton van Leeuwenhoek (1632 - 1723), người Hà Lan, người kỷ 17 nhìn thấy vi sinh vật nhờ kính hiển vi độ phóng đại 270 - 300 lần mà ơng chế tạo (1676) Ơng chế tạo kính hiển vi cách xếp nhiều thấu kính khoảng cách khác trục quang học, kết làm phóng đại hình ảnh vật thể lên nhiều lần, ông dùng để quan sát hồng cầu, phấn hoa, mao mạch phổi sau với kính hiển vi có độ phóng đại khoảng 300 lần ông phát vi sinh vật nước Các loại kính hiển vi Kính hiển vi quang học sáng: thường sử dụng phịng thí nghiệm để xét nghiệm với mục đích quan sát hình thể, tính chất bắt màu vi khuẩn Kính hiển vi đen: loại kính hiển vi quang học, phận tụ quang thay cấu trúc khác để tạo tối, hay sử dụng để quan sát di động vi khuẩn Kính hiển vi tương phản phase: Kính hiển vi tương phản phase cung cấp phương tiện để đạt độ tương phản thích hợp nhìn thấy vi sinh vật mà khơng cần nhuộm Kính hiển vi tương phản phase thường sử dụng để khảo sát nấm men, mốc nguyên bào Kính hiển vi huỳnh quang: kính hiển vi quang học có nguồn sáng đèn huỳnh quang, thường dùng để quan sát tiêu sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang, phân biệt cấu trúc khác tế bào vi sinh vật Kính hiển vi điện tử: sử dụng chùm tia điện tử có bước sóng ngắn, suất phân li lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt điểm gần nhau, dùng để quan sát virus, cấu trúc phân tử tế bào Trong phịng thí nghiệm vi sinh bản, kính hiển vi quang học sáng loại kính sử dụng phổ biến dễ sử dụng Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y II KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG Cấu tạo Gồm có giá kính, hệ thống điều chỉnh nhanh, tinh hệ thống quang học 1.1 Giá kính Gồm có đế kính, thân kính, ống kính, bàn xoay, bàn kính - Đế kính nặng có lỗ để cắm đèn chiếu cắm gương phản chiếu - Thân kính có hình cong để cầm di chuyển dễ dàng kính hiển vi - Ống kính mang thị kính, cố định quay lúc nới lỏng ốc nhỏ bên ống kính - Bàn xoay có nhiều lỗ để lắp vật kính - Bàn kính dùng để mang tiêu bản, có ốc để di chuyển tiêu theo chiều thẳng góc với nhau, có kẹp cố định tiêu bản, có thước đo du xích để ghi toạ độ 1.2 Hệ thống điều chỉnh nhanh tinh Cần thiết để điều chỉnh tiêu Hệ thống gồm có ốc đặt trục Ốc lớn (ốc vĩ cấp) điều chỉnh nhanh làm cho ảnh ra, ốc nhỏ (ốc vi cấp) điều chỉnh chậm tinh nhằm điều chỉnh ảnh cho thật rõ Chỉ ảnh điều chỉnh ốc lớn vặn ốc nhỏ để làm rõ ảnh 1.3 Hệ thống quang học Gồm có vật kính, thị kính, kính tụ quang đèn chiếu - Thị kính gồm hệ thống thấu kính, hướng mắt, hướng vật quan sát - Vật kính hệ thống quang học phức tạp trực tiếp phóng đại mẫu vật quan sát Nó gồm số thấu kính, thấu kính ngồi hướng vào vật quan sát gọi thấu kính trực diện - Có loại vật kính: + Vật kính thơ: Vật kính thơ có độ phóng đại nhỏ, đường kính thấu kính tương đối lớn vật kính 10, vật kính 40 + Vật kính dầu: có độ phóng đại lớn, hay dùng vật kính 100, thấu kính có đường kính nhỏ Do có phần chùm tia sáng chiếu lọt vào vật kính, phần ánh sáng bị khúc xạ ngồi nên ảnh khơng rõ Muốn có ảnh rõ phải đặt mẫu vật vật kính giọt dầu có chiết xuất n = 1,515 gần chiết xuất thuỷ tinh n =1,52 để tạo nên môi trường đồng để ánh sáng không bị khúc xạ mà thẳng vào vật kính Muốn biết độ phóng đại thấu kính hiển vi người ta nhân độ phóng đại thị kính với độ phóng đại vật kính - Kính tụ quang gồm có hệ thống thấu kính tập trung ánh sáng hệ thống chắn sáng có nhiệm vụ giảm bớt góc hình nón ánh sáng để sau qua mẫu vật đến vật kính khơng vượt qua đường kính thấu kính trực diện Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y - Đèn chiếu đặt tụ quang cung cấp nguồn sáng thích hợp Cấu tạo kính hiển vi quang học (1.Thị kính, 2.Giá điều chỉnh vật kính, 3.Vật kính, 4.Ốc vĩ cấp, 5.Ốc vi cấp, 6.Bàn kính, 7.Nguồn sáng, 8.Tụ quang, 9.Vi chỉnh) Cách sử dụng 2.1 Các bƣớc để soi kính - Đặt tiêu lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ giọt dầu soi kính để soi chìm phiến kính soi vật kính x100 - Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp - Điều chỉnh ánh sáng - Điều chỉnh tụ quang: vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang đoạn giữa, vật kính x100 để tụ quang cao - Điều chỉnh cỡ chắn tương ứng với vật kính - Nâng bàn kính để tiêu từ từ sát với vật kính (nếu dùng vật kính x100 để tiêu chạm sát đầu vật kính) Phải quan sát khoảng cách tiêu vật kính để tránh làm vỡ tiêu - Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa bàn kính xuống nhìn thấy hình ảnh mờ vi trường, điều chỉnh ốc vi cấp để hình ảnh rõ nét - Muốn quan sát tốt tiêu thì: mắt nhìn vào thị kính tay điều chỉnh ốc vi cấp cho hình ảnh quan sát ln rõ nét, tay xoay ốc xe tiêu để chuyển dịch vị trí cần quan sát - Cần phải soi tiêu cách tuần tự, theo đường “dích dắc” lúc tìm hình thể vi khuẩn điều chỉnh ốc vi cấp để có hình thể vi khuẩn rõ nét 2.2 Ghi toạ độ điểm tiêu Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Để tìm trở lại điểm cần quan sát tiêu phải ghi toạ độ điểm đó, muốn đọc hoành độ tung độ thước chia mm di động đồng thời với tiêu du xích cố định, thước di động du xích cố định thẳng góc với III CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI Sau sử dụng, kính hiển vi phải bảo quản tốt để sử dụng lâu dài, cần thực đầy đủ bước sau: - Lúc sử dụng xong, hạ bàn kính lấy tiêu khỏi bàn kính - Xoay vật kính dầu vị trí dễ lau - Dùng khăn mềm vải mịn khăn giấy để lau vật kính, nhúng góc khăn với xylen lau vật kính dầu Sau lau khơ với góc khăn - Lau bụi nước bám vào thân, đế, bàn kính khăn vải mềm, tránh làm xây xước kính - Đặt vật kính có độ phóng đại nhỏ trục quang học - Hạ tụ quang xuống (cho đến đường trượt che kín nhất) - Đóng chắn sáng - Để thân kính, mâm kính vào tư “nghỉ” - Cho kính vào tủ bảo quản có chất chống ẩm để phịng có máy điều hịa có máy hút ẩm - Lúc di chuyển: đỡ đế kính tay, cầm thân kính tay để giữ kính vị trí thẳng đứng lúc đặt kính bàn IV CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN Theo hình thái bề ngồi, vi khuẩn thường chia thành loại hình thể chính: cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn Cầu khuẩn (Cocci) Là vi khuẩn có hình cầu kích thước khoảng 0,5 x 1,2 µm, tuỳ theo cách thức liên kết tế bào, mặt giao tiếp mà cầu khuẩn chia thành: - Đơn cầu: Thường đứng riêng tế bào một, đa số tạp khuẩn gặp nước, đất khơng khí như: Micrococcus pyogenes - Tụ cầu (Staphylococcus): Các cầu khuẩn liên kết với thành tập đoàn chùm nho Đặc trưng có lồi Staphylococcus aureus, S epidermidis, - Song cầu: Là cầu khuẩn đứng thành đơi Có số lồi song cầu có khả gây bệnh cho người như: Neisseria meningitidis, N Gonorrhoeae, - Tứ cầu (Tetracoccus): Là cầu khuẩn xếp thành cụm cầu khuẩn - Liên cầu (Streptococcus): Các cầu khuẩn liên kết với tạo thành chuỗi: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Trực khuẩn (Bacterium - Số nhiều Bacteria) Là vi khuẩn có hình que đa dạng, kích thước khoảng 0,5 - 1,0 x µm, loại trực khuẩn thường gặp là: 10 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Môi trường nuôi cấy vi khuẩn hổn hợp nhân tạo có chứa yếu tố cần thiết cho phát triển vi khuẩn cách thuận lợi Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn thay đổi, có loại vi khuẩn mọc mơi trường tổng hợp chứa muối muối Amoni, thêm hợp chất đơn giản Glucoza Asparagin làm nguồn cácbon lượng, loại vi khuẩn khác đòi hỏi hợp chất đặc biệt tìm thấy máu mơ động vật 1.2 Phân loại mơi trƣờng ni cấy vi khuẩn Có nhiều cách phân loại mơi trường ni cấy vi khuẩn, dựa vào tính chất vật lý mơi trường, đặc điểm dinh dưỡng, tính chọn lọc 1.2.1 Mơi trƣờng lỏng môi trƣờng đặc - Môi trường lỏng: nước pepton nước thịt cao thịt hoà tan nước, phịng thí nghiệm hat gọi canh thang môi trường lỏng thường dùng để tăng sinh vi khuẩn - Môi trường đặc: môi trường lỏng thêm 1-2% thạch (agar) tuỳ theo u cầu ni cấy, mục đích dùng để phân lập vi khuẩn, dùng 0,5% thạch tạo mơi trường thạch mềm, hay dùng để giử chủng vi khuẩn hay thử nghiệm tính di động vi khuẩn 1.2.2 Môi trƣờng tối thiểu môi trƣờng - Môi trường tối thiểu: môi trường tổng hợp có nước chứa muối vơ kể muối amoni, thêm hợp chất đơn giản glucoza aspagarin làm nguồn cacbon lượng - Môi trường bản: môi trường dinh dưỡng chứa pepton nước thịt cao thịt Từ mơi trường dinh dưỡng biến đổi theo nhiều cách để tạo loại môi trường nuôi cấy khác Để điều chế môi trường đặc cần thêm thạch, môi trường phong phú thêm huyết thanh, nước báng máu khử tơ huyết 1.2.3 Môi trƣờng thƣờng môi trƣờng phong phú - Môi trường thường: chứa thành phần mơi trường bản, chứa pepton nước thịt cao thịt - Môi trường phong phú: chứa thành phần môi trường bản, thêm huyết thanh, nước báng máu khử tơ huyết 1.2.4 Môi trƣờng thông thƣờng môi trƣờng chọn lọc - Mơi trường thơng thường: ni cấy loại vi khuẩn hiếu khí khơng có nhu cầu dinh dưỡng cao, loại vi khuẩn mọc môi trường khơng tạo khuẩn lạc có tính chất riêng biệt để giúp chẩn đốn phân biệt loại vi khuẩn - Môi trường chọn lọc: dùng để phân lập ni cấy vi khuẩn, chứa thêm tác nhân ức chế cho phép vi khuẩn cần phân lập phát triển lại ức chế vi khuẩn khác, mọc môi trường ni cấy chúng tạo hình thái khuẩn lạc, tính chất ni cấy tương đối điển hình, có giá trị để phân biệt giúp chẩn đốn, định danh loài vi khuẩn Tuỳ theo mức độ chọn lọc mà người ta chia tính chất chọn lọc loại môi trường khác nhau: 31 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y + Mơi trường có tính chọn lọc thấp: cho phép vài loại vi khuẩn mọc, tạo tính chất riêng Ví dụ: Thạch lactose đỏ phenol dùng để phân lập E.coli, Salmonella Shigella phân, môi trường Mac-Conkey cho trực khuẩn Gram âm mọc + Môi trường có tính chọn lọc vừa phải: cho phép vài loại vi khuẩn mọc, tạo tính chất riêng Rất có giá trị xác định định danh vi khuẩn, ví dụ mơi trường SS (Shigella - Salmonella), môi trường DCA (Deoxycholat Citrat Agar) hay dùng để phân lập vi khuẩn đường ruột; môi trường thạch máu để quan sát liên cầu, phế cầu + Môi trường có tính chọn lọc cao: cho phép vài loại vi khuẩn mọc, tạo tính chất riêng biệt, có giá trị để xác định vi khuẩn cần phân lập Ví dụ mơi trường pepton kiềm mặn, thạch kiềm mặn để phân lập vi khuẩn tả, môi trường Chapmann để phân lập tụ cầu vàng gây bệnh, môi trường EMB (Eosin Methylene Blue) để xác định E.coli, môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Agar) dùng để phân lập vi khuẩn tả Trong phịng thí nghiệm để phân lập loại vi khuẩn nhóm vi khuẩn người ta sử dụng trình phân lập cần thiết phải lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp cho loại bệnh phẩm loại vi khuẩn cần phân lập Nuôi cấy vi khuẩn Người ta ni cấy vi khuẩn mơi trường thích hợp lỏng đặc Môi trường lỏng thông dụng canh thang Dùng que cấy pipet Pasteur cho bệnh phẩm vào canh thang Đem ủ nhiệt độ thích hợp, thơng thường 360C thời gian 18 - 24 Vi khuẩn phát triển làm đục môi trường Môi trường đặc thông dụng thạch dinh dưỡng đổ vào ống nghiệm tạo thành mặt phẳng nghiêng gọi thạch nghiêng tạo thành hình trụ gọi ống thạch, đổ vào hộp petri gọi thạch đĩa Ở mặt thạch dinh dưỡng vi khuẩn phát triển từ tế bào riêng rẽ dính lại với thành quần thể trông thấy mắt gọi khuẩn lạc Kích thước, màu sắc, hình thái khuẩn lạc khác loại vi khuẩn nên dựa vào khuẩn lạc mơi trường đặc người ta phân lập loại vi khuẩn rịng Hình thái khuẩn lạc biến đổi q trình cấy chuyển Khuẩn lạc phế cầu lúc phân lập suốt, lồi, bóng gọi khuẩn lạc S độc lực, cấy chuyển nhiều lần phịng thí nghiệm vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, khơ, xù xì gọi khuẩn lạc R độc lực Người ta cấy vi khuẩn với pipet Pasteur với que cấy: pipet Pasteur dùng để cấy bệnh phẩm lỏng vào canh thang mặt thạch Ở canh thang, sau lấy bệnh phẩm, cho pipet Pasteur vào ống canh thang đầu nhọn pipet chạm vào canh thang Que cấy dùng để cấy bệnh phẩm đặc Que cấy gồm loại: que cấy thẳng que cấy vòng mang vòng tròn đầu kim Que cấy vòng dùng để ria cấy mặt thạch cấy vào canh thang Que cấy thẳng dùng để cấy bề sâu thạch ống 32 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Phân lập ria cấy Muốn phân lập vi khuẩn rịng phải ria cấy mặt thạch để thu tế bào riêng rẻ phát triển thành khuẩn lạc Có nhiều phương pháp ria cấy mặt thạch, thông thường phương pháp sau: - Phương pháp Pasteur: Người ta làm thưa dần số lượng vi khuẩn cách trải số lượng vi khuẩn từ ô qua ô qua ô cuối từ ô qua ô nơi ta có tế bào riêng lẻ để phân lập Chia mặt thạch làm dùng vịng cấy lấy bệnh phẩm trải lên hình thức gạch dài rộng Đốt vòng cấy, chạm vào thạch nơi đường cấy ô 1, trải bệnh phẩm từ ô qua ô 2, từ ô qua ô từ ô qua ô đường cấy qua lại từ xuống Phương pháp dùng để cấy bệnh phẩm có mật độ vi khuẩn thấp Phương pháp ria cấy kiểu Pasteur Một số cách ria cấy thạch đĩa Petri - Phương pháp cạn dần: Lấy quai cấy bệnh phẩm cho vào ống thạch nghiêng, nhúng vào bên cạnh nơi có nước đọng phía kéo từ từ tới đầu thạch nghiêng, vừa kéo vừa đưa que cấy qua lại để để vạch mặt thạch vạch chữ chi gần song song với nhau, dùng que cấy cấy lên ống thạch nghiêng khác Sau ủ tủ ấm xuất mặt thạch ống thứ thứ khuẩn lạc riêng rẽ Phương pháp cấy cạn dần sử dụng để cấy bệnh phẩm có mật độ vi khuẩn thấp bệnh phẩm có mật độ vi khuẩn cao 33 Thực hành Căn Vi sinh học A Kỹ thuật cấy đâm sâu Khoa Y B Cấy ria ống thạch nghiêng III XÁC ĐỊNH VI KHUẨN Sau phân lập người ta xác định vi khuẩn thông qua bước: Soi trực tiếp kính hiển vi: tiêu nhuộm Gram Ziehl-Neelsen: Để kiểm tra hình thể, tính chất bắt màu vi khuẩn Khảo sát tính chất khuẩn lạc: Để khảo sát tính chất khuẩn lạc vi khuẩn mọc mơi trường ni cấy thích hợp Khảo sát tính chất sinh hố Muốn người ta thực giá sinh hoá bao gồm nhiều phản ứng phát enzyme vi khuẩn sản phẩm chuyển hoá enzyme Đối với vi khuẩn đường ruột làm giá sinh hố đơn giản Trong trường hợp cần thiết làm giá sinh hố hồn chỉnh Ngƣng kết với kháng huyết đặc hiệu Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể phản ứng đặc hiệu Một loại vi khuẩn ngưng kết với kháng huyết kích động tạo thành Trong phịng thí nghiệm, người ta có sẵn kháng huyết vi khuẩn cần định danh Sau định danh chủng vi khuẩn giá sinh hoá, người ta thực phản ứng ngưng kết phiến kính để kiểm tra kháng nguyên đặc hiệu Ví dụ: Hình thể kính hiển vi tính chất sinh hố người ta định danh chủng vi khuẩn khảo sát Salmonella typhi người ta làm phản ứng ngưng kết với huyết kháng O kháng H vi khuẩn nói phân type vi khuẩn Trong số trường hợp người ta cịn hồn chỉnh thêm việc chẩn đốn thử nghiệm độc lực động vật thí nghiệm, định type huyết thanh, định type phage IV PHẦN THỰC TẬP Sinh viên làm kỹ thuật ria cấy mẫu vi khuẩn lên môi trường nuôi cấy CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ: Mục đích việc ni cấy vi khuẩn Có loại mơi trường ni cấy Cho ví dụ Trình bày phương pháp ria cấy Pasteur Nêu bước để định danh vi khuẩn 34 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Bài CÁC PHẢN ỨNG SINH HOÁ – MIỄN DỊCH DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT Mục tiêu: Nắm mục đích khảo sát tính chất sinh hố vi khuẩn 2.Trình bày nguyên tắc phản ứng sinh hố thơng thường Quan sát phản ứng sinh hố giải thích kết Q trình phân lập định danh vi khuẩn bệnh phẩm thường thực qua bước: - Khảo sát hình thái tính chất bắt màu vi khuẩn mơi trường ni cấy kính hiển vi - Xác định tính chất sinh vật hố học - Xác định tính chất kháng nguyên ngưng kết với kháng huyết mẫu Trong khảo sát tính chất sinh hố vi khuẩn khảo sát chuyển hoá vi khuẩn I CÁC PHẢN ỨNG SINH HỐ Mỗi loại vi khuẩn khác có nhu cầu sử dụng chất khác nhau, sử dụng chất chúng tạo nên sản phẩm chuyển hố khác Thử nghiệm tính chất sinh hoá vi khuẩn khảo sát sản phẩm chuyển hoá chúng, sản phẩm chuyển hoá nhận biết chất thị màu môi trường bị biến đổi thay đổi độ pH…Để dễ dàng ghi nhớ người ta xếp phản ứng sinh hố vào nhóm lớn: Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có nitơ 1.1 Phản ứng Indol: Một số vi khuẩn E.coli có enzyme Tryptophanase chuyển Tryptophan thành Indol Nuôi cấy vi khuẩn nước pepton không chứa đường sau 24 - 48 ủ 370C, thêm 10 giọt thuốc thử Kovacs (para dimethyl amino benzaldehyt rượu isoamyl HCl) màu đỏ xuất vòng phút cho biết phản ứng dương tính 1.2 Khả tạo thành H2S: Nhiều vi khuẩn sử dụng hợp chất có chứa S Thiosulfate tạo thành H2S, H2S phản ứng với FeSO4 môi trường tạo thành FeS màu đen FeSO4 + H 2S FeS + H2SO4 35 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Ở phòng xét nghiệm người ta thường khảo sát khả tạo thành H2S môi trường KIA chứa FeSO4 Na2S2O3 1.3 Phản ứng phân giải urê: Vi khuẩn có enzyme Urease làm phân giải Urea tạo thành NH3 NH2 O = C + H 2O → CO2 + NH3 NH2 NH3 kiềm hố mơi trường, đổi thị màu đỏ Phenol thành màu đỏ cánh sen Thông thường người ta cấy vi khuẩn vào môi trường Urea Christensen Phản ứng áp dụng để phân biệt loại Proteus có khả phân giải Urea cao làm đỏ mơi trường vịng 2-3 1.4 Khả phân giải protein: Nhiều vi khuẩn có khả phân giải protein Người ta phát khả cách cấy vi khuẩn huyết đông gelatin 1.5 Khả làm tan máu: Nhiều vi khuẩn có khả làm tan hồng cầu nhiều động vật Để khảo sát tính chất này, người ta cấy vi khuẩn lên thạch máu quan sát vòng tan máu tạo thành xung quanh khuẩn lạc Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon 2.1 Khả lên men đƣờng: Trong trình phát triển, vi khuẩn lên men đường tạo thành acid làm đổi thị màu đỏ phenol từ màu đỏ sang màu vàng Người ta cấy vi khuẩn vào ống đường chứa pepton, cao thịt, 1% đường thị màu Trường hợp vi khuẩn có enzym hydrogenlyase tạo thành phát ống Durham HCOOH  H2 + CO2 2.2 Phản ứng đỏ methyl (MR, Methyl Red): Những vi khuẩn E.coli lên men Glucoza theo type lên men acid formic pha tạo thành hỗn hợp nhiều acid làm cho pH môi trường giảm đến pH ≤ 4,5 Người ta phát thị đỏ Methyl Chỉ thị đổi màu đỏ lúc pH ≤ 4,5 Nuôi cấy vi khuẩn môi trường Clark-lubs sau 48 thêm giọt đỏ Methyl vào Phản ứng dương tính lúc mơi trường trở thành màu đỏ 2.3 Phản ứng Voges - Proskauer (VP): Những vi khuẩn Enterobacter aerogenes lên men glucose theo type lên men butylen glycol, sản phẩm chuyển hố ngồi acid cịn có acetoin, hợp chất bị khử oxy butylen glycol Thuốc thử VP phát diện acetoin Nuôi cấy vi khuẩn môi trường Clark-lubs sau 48 thêm 1ml thuốc thử Để nhiệt độ 36 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y phịng thí nghiệm 30 phút, không đậy nắp ống nghiệm, phản ứng dương tính làm xuất màu đỏ eosin 2.4 Khả sử dụng Citrat: Khác với E.coli, loài Krebsiella Enterobacter sử dụng citrat nguồn cacbon Cấy vi khuẩn vào ống thạch nghiêng Citrat Simmons chứa thị màu xanh Bromothymol Sau 48 giờ, vi khuẩn sử dụng Citrat để phát triển làm kiềm hố mơi trường Phản ứng dương tính cho thấy mơi trường chuyển từ màu cỏ úa sang màu xanh dương Những phản ứng liên hệ đến enzym Thử nghiệm enzym cho phép phân biệt nhóm vi khuẩn khác Những thử nghiệm enzym thường thực bao gồm thử nghiệm sau: 3.1 Thử nghiệm catalase: Catalase enzym thuỷ phân H2O2 làm xuất oxy Catalase H2 O2 H2 O + 1/2O2 Phản ứng ứng dụng để phân biệt tụ cầu liên cầu nhận biết vi khuẩn khác 3.2 Thử nghiệm Coagulase: Coagulase enzym số vi khuẩn tiết làm đơng huyết tương người thỏ Thử nghiệm coagulase ứng dụng để xác định tụ cầu gây bệnh 3.3 Thử nghiệm Oxydase: Một số vi khuẩn có Oxydase, khơng khí enzym phản ứng với vài amin thơm để tạo thành phẩm vật có màu Thể nghiệm sử dụng để nhận biết lậu cầu, cầu khuẩn màng não, phẩy khuẩn tả II CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên kết hợp với kháng thể kích thích thể tạo thành Do phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể sử dụng để xác định kháng nguyên kháng thể hai phân tử biết Hiệu giá kháng thể huyết người động vật xác định nhờ kháng nguyên biết cho biết tiếp xúc trước với kháng nguyên Ngược lại nhờ kháng thể biết kháng nguyên khác vi sinh vật nhận mặt Mặt khác hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép chọn lựa thích đáng vi sinh vật dùng làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng Xét nghiệm Viêm gan B (HbsAg) Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính phương pháp dịng chảy chiều để phát có mặt kháng nguyên virus Viêm gan B huyết huyết tương Màng kit thử phủ lớp kháng thể kháng HBsAg vùng kết Trong trình làm xét nghiệm, mẫu 37 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y huyết huyết tương phản ứng với phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp phản ứng kết tủa màu với kháng thể kháng HBsAg lớp màng tạo vạch màu Sự có mặt vạch màu vùng kết kit thử cho biết kết dương tính, ngược lại trường hợp khơng có vạch màu kết âm tính Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, vạch màu luôn xuất vùng chứng (gọi vạch chứng) để khẳng định lượng mẫu đủ lớp màng thấm tốt 1.1 Mẫu xét nghiệm: - Mẫu xét ngiệm phải dùng huyết tương huyết - Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống serum ống EDTA - Ly tâm 3000 vòng/phút - 10 phút Xét nghiệm phải tiến hành sau lấy mẫu Không để mẫu phẩm nhiệt độ phòng thời gian dài Mẫu huyết huyết tương bảo quản nhiệt độ 2-80C vòng ngày 1.2 Quy trình: Để kit thử, mẫu phẩm nhiệt độ phòng (15-30°C) trước làm xét nghiệm - Lấy 50µl huyết tương - huyết cho vào ống nghiệm - Lấy kit thử khỏi túi kín đựng sản phẩm sử dụng kit thử nhanh tốt Để đạt kết tốt nhất, tồn q trình xét nghiệm phải hồn thành vịng kể từ mở túi đựng sản phẩm… - Cầm kit thử cho mũi tên kit thử hướng xuống: nhúng kit thử theo phương thẳng đứng vào mẫu phẩm ngâm 15 giây - Tiếp theo, đặt kit thử mặt phẳng nằm ngang khơng hút nước bắt đầu tính thời gian - Đọc kết vòng 15 phút Lưu ý: - Không nhúng kit thử sâu vạch tối đa (MAX line - đầu mũi tên que thử) - Chờ đến vạch đỏ xuất kit thử Không sử dụng kết 20 phút 1.3 Đọc diễn giải kết quả: - Dương tính: Xuất hai vạch đỏ rõ rệt: vùng chứng gọi vạch chứng ©, vạch vùng kết gọi vạch kết (T) Lưu ý: Độ đậm màu đỏ vạch kết (T) khác phụ thuộc vào nồng độ HBsAg có mẫu phẩm Vì vậy, độ mờ vạch kết (T) coi dương tính - Âm tính: Xuất vạch chứng © Không thấy xuất vạch kết (T) dù đậm hay mờ - Kết khơng có giá trị: Khơng thấy xuất vạch chứng © Nguyên nhân thường gặp lượng mẫu phẩm không đủ thao tác xét nghiệm sai 38 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Quy trình thực cách đọc kết kit chẩn đoán HbsAg Xét nghiệm HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người (HIV) tác nhân gây bệnh suy giảm miễn dịch có tên gọi AIDS Việc định tính phát kháng thể kháng HIV type có ý nghĩa để chẩn đoán nhiễm virus HIV hay chưa Các protein tái tổ hợp đặc hiệu với HIV (p24 gp41 HIV1, gp36 HIV2) sử dụng có khả phát kháng thể kháng HIV type huyết thanh, huyết tương máu tồn phần người với độ xác cao Card Test DipS tick HIV 1&2 Card Test DipStick HIV 1&2 dùng để phát định tính kháng thể HIV 1&2 huyết tương hay huyết người (chẩn đoán nhanh nhiễm virus HIV 1&2) 2.1 Mẫu xét nghiệm: - Mẫu xét ngiệm phải dùng huyết tương huyết - Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống serum ống EDTA - Ly tâm 3000 vòng/phút - 10 phút 39 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Xét nghiệm phải tiến hành sau lấy mẫu Không để mẫu phẩm nhiệt độ phòng thời gian dài Mẫu huyết huyết tương bảo quản nhiệt độ 2-80C vòng ngày 2.2 Quy trình: Để kit thử, mẫu phẩm nhiệt độ phịng (15-30°C) trước làm xét nghiệm - Xé bao, đặt kit thử lên bàn phẳng sạch, khô - Dùng pipet nhỏ 02 - 03 giọt (khoảng 60µl) huyết tương - huyết vào giếng thử (ô chữ S) - Nhỏ dung dịch pha loãng - Đọc kết vòng 15 phút Lưu ý: - Chờ đến vạch đỏ xuất kit thử Không sử dụng kết 30 phút 2.3 Đọc diễn giải kết quả: - Dương tính: Xuất vạch đỏ vùng chứng gọi vạch chứng © vạch đỏ vùng kết gọi vạch kết (T) + T1 có vạch đỏ: HIV-1 (+) + T2 có vạch đỏ: HIV-2 (+) + T1 T2 có vạch đỏ: HIV 1,2 (+) Lưu ý: Độ đậm màu đỏ vạch kết (T) khác phụ thuộc vào nồng độ kháng thể có mẫu phẩm Vì vậy, độ mờ vạch kết (T) coi dương tính - Âm tính: Xuất vạch chứng © Không thấy xuất vạch kết (T) dù đậm hay mờ - Kết khơng có giá trị: Khơng thấy xuất vạch chứng © Nguyên nhân thường gặp lượng mẫu phẩm không đủ thao tác xét nghiệm sai III PHẦN THỰC TẬP Sinh viên thực làm giá sinh hoá chẩn đoán vi sinh vật kit chẩn đoán nhanh HbsAg, HIV 1&2 CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ: 1.Nêu mục đích việc khảo sát tính chất sinh hố vi khuẩn 2.Trình bày thử nghiệm sinh H2S 3.Trình bày thử nghiệm liên hệ đến enzym Trình bày cách thực kit thử chẩn đoán HbsAg HIV 1,2 40 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Bài KHÁNG SINH ĐỒ Mục tiêu: Nắm khái niệm, mục đích kháng sinh đồ Nắm yếu tố ảnh hưởng tới kháng sinh đồ Trình bày kỹ thuật đĩa kháng sinh khuếch tán thạch Hiện nhiều vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây nên nhiều vụ dịch nhiễm khuẩn nặng, điều dẫn đến nhu cầu cần có chương trình theo dõi tính kháng thuốc vi khuẩn phạm vi quốc gia quốc tế Khảo sát dịch tễ học kháng thuốc vi khuẩn giúp cho thầy thuốc lâm sàng chọn thuốc kháng sinh thích hợp để điều trị bệnh nhiễm khuẩn Xác định độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc kháng sinh phương pháp phịng thí nghiệm tin cậy thống để có kiện so sánh I ĐẠI CƢƠNG Định nghĩa Thử nghiệm độ nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh phịng thí nghiệm gọi kháng sinh đồ, thực phương pháp hịa lỗng phương pháp khuếch tán môi trường đặc Mục đích - Tìm loại kháng sinh cơng hiệu để tiêu diệt ức chế loại vi khuẩn - Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: minimal inhibition concentration) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC: minimal bactericidal concentration) loại kháng sinh loại vi khuẩn định - Khảo sát hiệu phối hợp kháng sinh Các yêu cầu thực kháng sinh đồ Khi thực kháng sinh đồ vi khuẩn cần phải nuôi cấy khiết, đa số vi khuẩn gây bệnh người phân lập cần 16 - 18 phát triển, bệnh phẩm loại vi khuẩn cần thêm 16 - 18 để làm kháng sinh đồ, kết kháng sinh đồ sớm 36 - 48 Trong trường hợp bệnh phẩm nhiều vi khuẩn, nhiều vi khuẩn phát triển chậm cần thời gian lâu Đối với số vi khuẩn mà tính kháng sinh ổn định rõ ràng khơng cần thiết phải làm kháng sinh đồ vi khuẩn bạch hầu, liên cầu A tan máu β 41 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Tính chất đề kháng kháng sinh vi khuẩn có tính chất dịch tễ, phịng thí nghiệm vi khuẩn bệnh viện cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp điều trị bệnh nhiễm khuẩn Các kỹ thuật làm kháng sinh đồ - Pha lỗng kháng sinh vào mơi trường thạch canh thang để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) kháng sinh vi khuẩn - Kỹ thuật đĩa kháng sinh khuếch tán thạch thường áp dụng để xác định độ nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh khác (định tính), kháng sinh thường thấm đĩa giấy với hàm lượng định theo quy định chung quốc tế II KỸ THUẬT ĐĨA KHÁNG SINH KHUẾCH TÁN TRONG THẠCH (Kirby - Bauer) Nguyên lý Những đĩa giấy tẩm kháng sinh đặt môi trường thạch ria cấy với vi khuẩn thử nghiệm, kháng sinh khuếch tán từ đĩa tạo thành gradien kháng sinh vi khuẩn mọc nơi khơng có kháng sinh hay có nồng độ kháng sinh thấp hình thành vòng ức chế Những vùng điều kiện chuẩn phụ thuộc với độ nhạy cảm vi khuẩn thử nghiệm Dựa vào đường kính vịng ức chế, người ta xác định gần độ nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh Chuẩn bị phƣơng tiện Kết thử nghiệm khuếch tán phụ thuộc vào yếu tố chủ yếu: - Chất lượng đĩa kháng sinh - Môi trường dùng làm kháng sinh đồ - Nồng độ vi khuẩn 2.1 Đĩa kháng sinh: Mỗi đĩa giấy thấm lượng kháng sinh định loại kháng sinh Mỗi kháng sinh có độ bền vững khác Nhiệt độ độ ẩm cao làm bất hoạt kháng sinh nhanh, kháng sinh β lactamin Vì việc cất giữ tốt 200C 40C lọ nút kín chống ẩm 2.2 Môi trƣờng: Môi trường nuôi cấy dùng để kiểm tra mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn phải mơi trường chẩn hóa cao để giúp cho hầu hết vi khuẩn gây bệnh mọc tốt môi trường Mueller-Hinton Đối với vi khuẩn khó mọc, địi hỏi phải có thêm yếu tố làm phong phú môi trường máu sản phẩm máu, vitamin yếu tố phát triển khác 42 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y Môi trường Mueller-Hinton chuẩn bị theo hướng dẫn hãng sản xuất đổ vào đĩa Petri vô khuẩn với độ dày từ 3,5 - 4,5 mm Các đĩa phải đặt mặt phẳng ngang để đảm bảo cho độ sâu thạch vị trí đĩa 2.3 Nồng độ vi khuẩn: Chỉ thực kháng sinh đồ với vi khuẩn chủng Lượng vi khuẩn cấy vào mơi trường có ảnh hưởng lớn đến đường kính vùng ức chế lượng vi khuẩn nhiều vịng ức chế nhỏ lại, lượng vi khuẩn vịng ức chế rộng Đối với phần lớn vi khuẩn gây bệnh thường gặp, nồng độ vi khuẩn thường dùng 108 vk/ml 2.3 Cách tiến hành - Ria cấy vi khuẩn: Sau vi khuẩn khiết ni cấy qua đêm mơi trường khơng có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5-10 khuẩn lạc nghiền vào ống PBS (Phosphat Buffer Saline) nước muối sinh lý vô khuẩn, lắc đều, so sánh với ống độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục cho thêm PBS; ngược lại khơng đủ đục cho thêm vi khuẩn) Ta hỗn dịch vi khuẩn tương đương 108CFU/ml (Colony Forming Unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc) Dùng que tăm bơng vơ khuẩn nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn ép vào thành ống cho bớt nước ria khắp với đường bắt chéo 1200 lên mặt thạch - Dùng kẹp vô khuẩn gắp đĩa kháng sinh chọn lựa với loại vi khuẩn thử lên mặt thạch cho đĩa cách đĩa cm cách thành đĩa Petri 1,5 cm Để đĩa thạch nhiệt độ phòng khoảng 30 phút để kháng sinh khuếch tán - Để môi trường tủ ấm 370C /18-24 Q uy trìn h thực kỹ thuậ t Đĩa ng sinh khu ếch thạch 2.4 Đọc đánh giá kết quả: 43 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y - Đo đường kính vòng ức chế đĩa kháng sinh thước đo milimet - Đánh giá kết quả: So sánh vào bảng “Giới hạn đường kính vùng ức chế” để phân loại nhạy cảm, trung gian hay đề kháng ghi kết Mỗi hãng sản xuất đĩa kháng sinh có bảng giới hạn riêng, nên ý để điều kiện thí nghiệm phù hợp, thống với quy định hãng Bảng lựa chọn kháng sinh thử nghiệm diễn giải đường kính vùng ức chế Staphylococcus aureus III PHẦN THỰC TẬP Sinh viên làm kỹ thuật đĩa kháng sinh khuếch tán thạch đọc kết kháng sinh đồ CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ: Nêu mục đích kháng sinh đồ Trình bày yếu tố ảnh hưởng đến kết kháng sinh đồ Trình bày cách tiến hành kỹ thuật đĩa kháng sinh khuếch tán thạch 44 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y TÀI LIỆU THAM KHẢO Vi sinh y học, 2006, Nhà xuất Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Vi sinh vật Bài giảng Vi sinh y học, 2009, Trường Đại học Y Dược Huế, Bộ môn Vi sinh vật Lê Duy Linh, Thực tập Vi sinh sở, 2001, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm Vi sinh vật học, 2006, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân, Cẩm nang kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, 2002, Trường Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh Tài liệu thực tập Vi sinh vật học, 2015, Đại học Huế, Trường Đại học Y dược, Bộ môn Vi sinh vật Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích Vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, 2006, NXB Giáo dục Étienne lévy-lambert, 1978, Techniques de base pour le laboratoire médical Kỹ thuật phòng xét nghiệm, người dịch: Nguyễn Viết Thọ - Nguyễn Xuân Thiều, NXB Y học Balley and Scott’s (1994), Diagnostic Microbiology, 9e edition, Mosby 45 ... luật trường Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y MỤC TIÊU, YÊU CẦU VỀ THỰC TẬP VI SINH VẬT Qua thực tập sinh vi? ?n rèn luyện bước thói quen tỉ mỉ, xác, trung thực người cán Sinh vi? ?n học tập phương... cách tiến hành kỹ thuật đĩa kháng sinh khuếch tán thạch 44 Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y TÀI LIỆU THAM KHẢO Vi sinh y học, 2006, Nhà xuất Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Vi sinh vật... bào Trong phịng thí nghiệm vi sinh bản, kính hiển vi quang học sáng loại kính sử dụng phổ biến dễ sử dụng Thực hành Căn Vi sinh học Khoa Y II KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG Cấu tạo Gồm có giá kính,