1. Nguyên lý
Những đĩa giấy tẩm kháng sinh được đặt ở môi trường thạch ria cấy đều với vi khuẩn thử nghiệm, kháng sinh khuếch tán từ đĩa tạo thành một gradien kháng sinh và vi khuẩn chỉ mọc nơi không có kháng sinh hay có nồng độ kháng sinh thấp hình thành một vòng ức chế. Những vùng này trong điều kiện chuẩn phụ thuộc với độ nhạy cảm của vi khuẩn thử nghiệm. Dựa vào đường kính vòng ức chế, người ta xác định gần đúng độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh.
2. Chuẩn bị phƣơng tiện
Kết quả của thử nghiệm khuếch tán phụ thuộc vào 3 yếu tố chủ yếu: - Chất lượng của đĩa kháng sinh
- Môi trường dùng làm kháng sinh đồ - Nồng độ vi khuẩn
2.1. Đĩa kháng sinh:
Mỗi đĩa giấy thấm một lượng kháng sinh nhất định của một loại kháng sinh. Mỗi kháng sinh có độ bền vững khác nhau. Nhiệt độ và độ ẩm cao làm bất hoạt kháng sinh nhanh, nhất là kháng sinh β lactamin. Vì vậy việc cất giữ tốt nhất là ở 200C hoặc ở 40C trong các lọ nút kín chống ẩm.
2.2. Môi trƣờng:
Môi trường nuôi cấy dùng để kiểm tra mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn phải là môi trường được chẩn hóa cao để giúp cho hầu hết vi khuẩn gây bệnh mọc tốt như môi trường Mueller-Hinton. Đối với các vi khuẩn khó mọc, đòi hỏi phải có thêm các yếu tố làm phong phú trong môi trường trên như máu và các sản phẩm của máu, các vitamin hoặc các yếu tố phát triển khác.
43
Môi trường Mueller-Hinton được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất và đổ vào đĩa Petri đã vô khuẩn với độ dày từ 3,5 - 4,5 mm. Các đĩa này phải đặt trên một mặt phẳng ngang bằng để đảm bảo cho độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa bằng nhau.
2.3. Nồng độ vi khuẩn:
Chỉ thực hiện kháng sinh đồ với vi khuẩn thuần chủng. Lượng vi khuẩn cấy vào môi trường có ảnh hưởng lớn đến đường kính vùng ức chế như lượng vi khuẩn nhiều vòng ức chế nhỏ lại, lượng vi khuẩn ít vòng ức chế rộng ra. Đối với phần lớn các vi khuẩn gây bệnh thường gặp, nồng độ vi khuẩn thường dùng là 108 vk/ml.
2.3. Cách tiến hành
- Ria cấy vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy qua đêm trên các môi trường không có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5-10 khuẩn lạc nghiền vào một ống PBS (Phosphat Buffer Saline) hoặc nước muối sinh lý vô khuẩn, lắc đều, so sánh với ống độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục quá thì cho thêm PBS; ngược lại nếu không đủ đục thì cho thêm vi khuẩn). Ta được hỗn dịch vi khuẩn tương đương 108
CFU/ml (Colony Forming Unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc). Dùng que tăm bông vô khuẩn nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn trên ép vào thành ống cho bớt nước rồi ria đều khắp với những đường bắt chéo nhau 1200 lên mặt thạch.
- Dùng kẹp vô khuẩn gắp các đĩa kháng sinh đã chọn lựa với từng loại vi khuẩn được thử lên mặt thạch sao cho đĩa nọ cách đĩa kia 2 cm và cách thành đĩa Petri 1,5 cm. Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút để kháng sinh khuếch tán.
- Để môi trường trong tủ ấm 370C /18-24 giờ.
Q uy trìn h thực hiện kỹ thuậ t Đĩa khá ng sinh khu ếch trong thạch 2.4. Đọc và đánh giá kết quả:
44
- Đo đường kính vòng ức chế của mỗi đĩa kháng sinh bằng thước đo milimet. - Đánh giá kết quả: So sánh vào bảng “Giới hạn đường kính vùng ức chế” để phân loại nhạy cảm, trung gian hay đề kháng và ghi kết quả. Mỗi hãng sản xuất đĩa kháng sinh có một bảng giới hạn riêng, vì vậy nên chú ý để các điều kiện thí nghiệm phù hợp, thống
nhất với quy định của hãng đó.
Bảng lựa chọn kháng sinh thử nghiệm và diễn giải đường kính vùng ức chế của Staphylococcus aureus
III. PHẦN THỰC TẬP
Sinh viên làm kỹ thuật đĩa kháng sinh khuếch tán trong thạch và đọc kết quả kháng sinh đồ.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ:
1. Nêu mục đích của kháng sinh đồ.
2. Trình bày các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả kháng sinh đồ.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vi sinh y học, 2006, Nhà xuất bản Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Vi sinh vật.
2. Bài giảng Vi sinh y học, 2009, Trường Đại học Y Dược Huế, Bộ môn Vi sinh
vật.
3. Lê Duy Linh, Thực tập Vi sinh cơ sở, 2001, NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm Vi sinh
vật học, 2006, NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
5. Phạm Hùng Vân, Cẩm nang các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, 2002,
Trường Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh.
6. Tài liệu thực tập Vi sinh vật học, 2015, Đại học Huế, Trường Đại học Y dược, Bộ môn Vi sinh vật.
7. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích Vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, 2006, NXB Giáo dục.
8. Étienne lévy-lambert, 1978, Techniques de base pour le laboratoire médical -
Kỹ thuật cơ bản của phòng xét nghiệm, người dịch: Nguyễn Viết Thọ - Nguyễn Xuân
Thiều, NXB Y học.