Giáo trình Hóa sinh - Trường Cao đẳng Y tế Ninh Bình

Mục tiêu của giáo trình là giúp các bạn có thể trình bày được cấu tạo, tính chất lý hóa, vai trò của các hợp chất hữu cơ cấu tạo nên cơ thể người. Trình được quá trình chuyển hóa của các chất hữu cơ diễn ra trong cơ thể người. Trình bày được chức năng hóa sinh tiêu biểu của một số cơ quan trong cơ thể. Giải thích được các nguyên tắc, nguyên nhân xuất hiện một số bệnh sinh ra do rối loạn chuyển hóa glucid, protid, lipid.

GIỚI THIỆU HỌC PHẦN HÓA SINH Đối tượng: Cao đẳng - Số tín chỉ: - Tổng số tiết: ` 02 (1/1) 45 tiết + Lý thuyết: 15 tiết + Thực hành: 30 tiết - Thời điểm thực hiện: Học kỳ MỤC TIÊU HỌC PHẦN : Trình bày cấu tạo, tính chất lý hóa, vai trị hợp chất hữu cấu tạo nên thể người Trình q trình chuyển hóa chất hữu diễn thể người Trình bày chức hóa sinh tiêu biểu số quan thể Giải thích nguyên tắc, nguyên nhân xuất số bệnh sinh rối loạn chuyển hóa glucid, protid, lipid Vận dụng kiến thức sinh hóa để giải thích bệnh lý rối loạn chuyển hóa chất thể người Thể thái độ tỷ mỷ, xác, khách quan, trung thực… Thể ý thức trách nhiệm công tác thực hành chuyên môn Thể khiêm tốn học tập, quan hệ hợp tác tốt với đồng nghiệp… NỘI DUNG HỌC PHẦN STT Tên Số tiết LT Trang TH Phần I: Lý thuyết Đại cương hóa sinh Hóa học glucid Hóa học lipid 13 Hóa học protein 19 Hóa học hemoglobin acid nucleic 25 Hóa học enzym 30 Hóa học hormon 37 Oxy hóa sinh học 47 Chuyển hoá glucid 58 10 Chuyển hoá lipid 69 11 Chuyển hóa acid nucleic sinh tổng hợp protein 78 12 Trao đổi nước chất vơ 85 13 Khí máu thăng acid-base 95 14 Hoá sinh gan 103 15 Hoá sinh thận nước tiểu 110 Phần II: Thực hành Hóa học glucid 119 Hóa học lipid 127 Hóa học protein 133 Enzym xúc tác sinh học 140 Hemoglobin 146 Acid nucleic 153 30 156 Tổng số 15 ĐÁNH GIÁ: Hình thức thi: Thi tự luận Cách tính điểm: Điểm chuyên cần x 10% + điểm kiểm tra thường xuyên x 20% + điểm thi kết thúc học phần x 70% BÀI ĐẠI CƯƠNG VỀ HĨA SINH MỤC TIÊU: Trình bày định nghĩa, nội dung hóa sinh học Trình bày vai trị hóa sinh y học Trình bày thành phần hóa học cấu tạo nên thể sống NỘI DUNG Định nghĩa hố sinh học Hố sinh mơn học nghiên cứu thành phần hoá học thể sống, chuyển hoá phân tử sinh học tế bào thể sống Nội dung hoá sinh học Mơn học hình thành sở sinh học hố học Nó cịn liên quan mật thiết với tế bào học, hầu hết phản ứng hoá học xảy tế bào Tế bào đơn vị hợp thành thể sống, có đặc điểm chung; tế bào thể khác nhau, tế bào loại mơ thể có khác biệt cấu trúc chức Chính chuyên biệt tế bào qúa trình tiến hoá tự nhiên dẫn đến khác biệt đa dạng tạo nên q trình hố sinh đặc hiệu Sự sống tượng trao đổi chất liên tục, tượng liên quan mật thiết với q trình chuyển hố vật chất Những q trình điều chỉnh nhịp nhàng ăn khớp với nhau, bảo đảm cho nội môi thể trạng thái động, ln thể ổn định Hố sinh học gồm phần: hoá sinh tĩnh - hoá sinh động - Hoá sinh tĩnh: Dựa vào phương pháp lý, hóa mơ tả cấu tạo thể sống mức độ phân tử, nguyên tử - Hố sinh động: Nghiên cứu q trình chuyển hoá, số phận chất vào thể, tính đặc hiệu phản ứng sinh học phản ứng enzym chất, hormon chất tiếp nhận Vai trò hoá sinh y học - Hoá sinh nghiên cứu chức phận thể, nhiệm vụ tế bào, mô, liên quan chúng với - Hóa sinh giúp y học tìm hiểu số bệnh sinh thay đổi bệnh lý chuyển hoá chất - Hóa sinh giúp y học tìm hiểu chế tác dụng thức ăn thuốc vào thể để tìm nguyên tắc dinh dưỡng, vệ sinh dự phòng điều trị bệnh - Đối với giải phẫu mô học: sở chung mối liên quan hình thái chức phận Thành phần hóa học thể 4.1 Dựa vào có mặt chất thể nhiều hay chia thành nhóm: - Các ngun tố chính: Carbon, hydro, oxy, nitơ, canxi: nguyên tố chiếm tới 97,5% thân trọng Natri, kali mangesi, lưu huỳnh phospho clor chiếm khoảng - 2% thân trọng - Các yếu tố vi lượng: Iod, sắt chiếm tỷ lệ nhỏ - Các yếu tố siêu vi lượng: Cu, Zn, Mn, F chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 0,01 % thân trọng Tầm quan trọng nguyên tố thể không phụ thuộc vào khối lượng nhiều hay Mọi nguyên tố có tầm quan trọng hoạt động sống thể Thiếu nguyên tố dẫn đến rối loạn phát triển, rối loạn chức quan tồn thể 4.2 Dựa vào chất hợp chất chia thành nhóm * Nước: Nước chiếm khoảng 55 - 65% thân trọng thay đổi theo lứa tuổi, thể trạng, giới tính Đàn ông nhiều nước đàn bà, người trẻ chứa nhiều nước người già Hàm lượng nước thể thay đổi tuỳ theo tổ chức Trong thể nước tồn dạng: - Nước tự do: nước lưu thông bao gồm nước máu, bạch huyết, dịch não tuỷ, dịch tiêu hoá, dịch gian bào, nước tiểu mồ Nước tự giúp hồ tan chất dinh dưỡng chất cặn bã - Nước kết hợp: tham gia vào cấu tạo tế bào gồm: nước tạo màng hydrat hoá, nước tạo mixel, gel,… * Hợp chất vô cơ: chiếm 1/10 thân trọng, tồn dạng sau: - Muối vơ rắn, khơng ion hố: nằm mơ xương, răng: phosphat, carbonat, calci - Muối vơ dạng hồ tan dung dịch, có khoang gian bào, dịch như: + Các anion: CL-, SO4 , HCO3- + Các cation: Na+, K+, Mg++, Ca++ - Các hợp chất kim: Acid, phosphoric kết hợp với chất hữu để tạo nên hợp chất kim Vd: Phospholipid, phosphoprotein * Hợp chất hưu cơ: Gồm nhóm lớn - Glucid: Gồm nguyên tố cấu tạo nên carbon, hydro oxy Hydro oxy có glucid thường với tỉ lệ nước (2/1) Do đó, glucid cịn có tên hydratcarbon, có cơng thức chung Cn(H2O)m_ Nếu glucid tạp cịn có ngun tố khác Đơn vị cấu tạo glucid monosaccarid - Lipid: Cũng gồm nguyên tố cấu tạo nên carbon, hydro oxy, ngồi cịn ngun tố khác; Lipid este amin acid béo với alcol amin alcol - Protein: Gồm nguyên tố cấu tạo nên là: Carbon, hydrro, oxy nitơ, ngồi cịn nguyên tố khác Đơn vị cấu tạo acid amin So với phần trăm trọng lượng thể: Protein chiếm 15-20%, glucid chiếm 1-15%, lipid chiếm 3-10% - 1g protein cung cấp 4,2 kcal - 1g glucid cung cấp 4,1 kcal - 1g lipid cung cấp 9,3 kcal Ngồi nhóm chất hữu trên, thể cịn có chất: Acid nucleic, nucleotid, hemoglobin, vitamin, enzym, hormon, myoglobin LƯỢNG GIÁ: * Trả lời ngắn gọn câu sau: Nội dung nghiên cứu hoá sinh tĩnh: A B Bốn vai trị hố sinh y học: A B C D Đối với giải phẫu mô học: sở mối liên quan hình thái cấu trúc Hai dạng tồn nước thể: A B Năm vai trò nước thể A B C D E Bảo vệ mô Ba dạng tồn hợp chất vô thể: A B C * Chọn câu trả lời (bằng cách khoanh tròn chữ đầu câu) Các nguyên tố cấu tạo nên thể (chiếm 97,5% thân trọng) gồm: A C, H O B C, H, O, N C C, H, O, N, Calci D C, H, O, N, Na E C, H, O, N, S Đơn vị cấu tạo Glucid: A Acid amin B Alcol C Acid béo E Monosaccarid Đơn vị cấu tạo Protein: A Acid amin C Acid béo E Monosaccarid Đơn vị cấu tạo Lipid: A Acid amin C Acid béo E Monosaccarid D Alcol acid béo B Alcol D Acol acid béo B Alcol D Acol acid béo BÀI HÓA HỌC GLUCID MỤC TIÊU: Trình bày cấu tạo, tính chất monosaccarid Phân biệt nguồn gốc, cấu tạo, tính chất của: saccarose, lactose maltose So sánh nguồn gốc, cấu tạo của: tinh bột, glycogen cellulose NỘI DUNG Đại cương 1.1 Định nghĩa glucid Glucid dẫn xuất aldehyd ceton polyalcol chất tạo dẫn xuất bị thuỷ phân Đa số thành phần nguyên tố glucid viết dạng Cn(H2O)m nên gọi carbonhydrat 1.2 Phân loại glucid: Chia làm loại - Monosaccarid (Đường đơn hay ose): Là đơn vị cấu tạo glucid, không bị thuỷ phân thành đơn vị nhỏ Ví dụ: glucose, fructose - Oligosaccarid: Là đường tạo từ đến phân tử đường đơn bị thuỷ phân Ví dụ: lactose, saccarose - Polysaccarid: Là nhóm hợp chất tạo số lớn monosaccarid bị thuỷ phân Ví dụ: glycogen, tinh bột, glucopolysaccarid 1.3 Vai trò glucid: - Vai trò tạo năng: Là nguồn cung cấp lượng chủ yếu thể - Vai trị tạo hình: Tham gia thành phần cấu tạo tế bào mô + Ở thực vật glucid chiếm 80%-90% trọng lượng khô, cellulose thành phần mơ nâng đỡ + Ở động vật glucid chiếm 2% trọng lượng khô nguồn cung cấp lượng chủ yếu + Ở vi sinh vật polysaccarid cấu tử quan trọng màng tế bào Monosaccarid (Đường đơn hay ose) 2.1 Định nghĩa - Monosaccarid aldehydalcol cetonalcol, công thức trừ carbon thuộc nhóm carbonyl (C=O), cịn tất carbon khác monosaccarid liên kết với nhóm hydroxyl (-OH) - Nếu nhóm carbonyl đầu mạch monosaccarid aldehydalcol (aldose), nhóm carbonyl vị trí khác cetonalcol (cetose) - Công thức tổng quát: H C=O CH2OH C=O (CHOH)n (CHOH)n CH2OH Aldehydalcol (aldose) CH2OH Cetoalcol (cetose) n biểu thị số nhóm alcol bậc ; n 0,1,2,3 tuỳ loại monosaccarid 2.2 Cách gọi tên: cách - Chức khử + ose Ví dụ: Aldose, cetose - Số C + ose Ví dụ: Triose, pentose - Chức khử + Số C + ose Ví dụ: Aldohexose, cetohexose - Tên riêng Ví dụ: Glucose, fructose, galactose 2.3 Cấu tạo Có dạng cấu trúc: mạch thẳng mạch vịng (hình 1.1) Phần lớn glucose biểu thị dạng cơng thức mặt phẳng chiếu Haworth (hình 1.1B) Bằng nhiễu xạ tia X người ta chứng minh vịng cạnh chứa ngun tử oxy có tự nhiên dạng ghế (hình 1.1C) Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo α-D-glucose 2.4 Tính chất monosaccarid - Các monosaccarid có vị ngọt, dễ tan nước, tan alcol, không tan ete - Trừ dioxyaceton, ose có khả làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực * Tính khử (bị oxy hóa) - Do có hố chức khử aldehyd ceton Monosaccarid tác dụng với muối kim loại nặng (muối Cu, Hg…) khử ion kim loại giải phóng kim loại tự muối kim loại có hố trị thấp hơn, thân monosaccarid bị oxy hoá trở thành acid - Ví dụ: Trong phản ứng fehling, glucose khử hydroxyd đồng II Cu(OH) thành oxid đồng I (Cu2O) kết tủa đỏ gạch Hình 2.2 Phản ứng Fehling glucose - Ứng dụng tính chất để định tính sơ định lượng đường niệu nước tiểu * Tạo glucosid - Các monosaccarid có khả tạo thành hợp chất ete với alcol Các hợp chất gọi glucosid, liên kết gọi liên kết glucosid osid 6 CH2OH O CH2OH O + CH3OH + H2O OH O CH3 liên kêt osid  -D-Glucose -metyl-D-Glucosid - Liên kết glucosid hình thành nhóm (–OH) monosaccarid với nhóm (– OH) monosaccarid khác Ví dụ: liên kết osid phân tử oligo polysaccarid O 4 O O O O O O Liên kêt osid Hình 2.3 Liên kết osid * Tạo este - Do có nhóm (–OH) alcol nên monosaccarid phản ứng với acid HNO3, H2SO4, H3PO4 , acid acetic tạo nên este tương ứng - Các este phosphat monosaccarid este quan trọng monosaccarid thể sinh vật chúng sản phẩm chuyển hoá trung gian dạng hoạt hoá chất chuyển hoá glucid * Sự chuyển dạng lẫn ose Glucose, fructose, mannose chuyển dạng lẫn môi trường kiềm yếu Oligosaccarid 3.1 Saccarose: Có nhiều mía, củ cải đường; phân tử - glucose - fructose liên kết loại phân tử nước Cơng thức hố học là: Saccarose CH OH CH2OH H O H H O H * * H HO OH H 3 O OH CH2OH H OH HO H -D-glucopyranosyl -(1 -D-fructofuranosid 2) Hình 2.4 Cơng thức cấu tạo Saccarose 3.2 Lactose: Có sữa người động vật gọi đường sữa Do -galactose glucose tạo thành cách loại phân tử nước, có cơng thức là: Lactose 6 CH2OH CH2OH H O OH O OH H H H O * OH OH H * 3 H H H OH H OH H -D-galatopyranosyl -(1 -D-glucopyranose 4) Hình 2.5 Cơng thức cấu tạo Lactose 3.3 Maltose: Có mầm lúa, kẹo mạch nha; phân tử – glucose loại phân tử nước tạo thành Công thức hoá học là: Maltose 6 CH OH CH OH H O H H O H H H H1 * OH OH H * O OH OH H OH H OH -D-glucopyranosyl -(1 4) -D-glucopyranose Hình 2.6 Cơng thức cấu tạo Maltose Polysaccarid: Là chất có phân tử lượng lớn, cấu tạo từ nhiều phân tử monosaccarid, chia làm nhóm tạp * Tinh bột: Do hàng nghìn gốc  – D glucose tạo thành, gồm thành phần cấu tạo tính chất khác amylose amylopectin Khi đun sôi tinh bột với acid hữu bị thuỷ phân thành glucose 10 Nghiền gan tươi cối sứ, thêm 6mL nước, khuấy đều, gạn lọc lấy dịch gan Tiến hành - Dùng ống nghiệm có ghi số thứ tự Cho dung dịch theo bảng: Ống nghiệm Thuốc thử - Dịch gan nghiền (mL) 2 ml ml Đun sôi phút - Xanh methylen (giọt) giọt giọt - Aldehyd formic (giọt) giọt Lắc ống nghiệm giọt 10 giọt 10 giọt Dầu vaselin (giọt) - Không lắc, để yên nhiệt độ 400C 30 phút Quan sát giải thích: biến đổi màu hai ống nghiệm III ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG CỦA ENZYM Nguyên tắc Nhiệt độ cung cấp lượng hoạt hoá cho phản ứng enzym, nhiệt độ khoảng 400C làm enzym có hoạt tính lớn nhất, nhiệt độ cao lại gây biến tính enzym, song nhiệt độ 00C enzym lại không hoạt động Chuẩn bị 2.1 Dụng cụ - Ống nghiệm (3) - Khay sứ có nhiều lỗ - Cốc có mỏ - Pipet thuỷ tinh chia vạch, bóp cao su - Pipet paster - Đèn cồn, kẹp gỗ - Nồi cách thủy - Cốc nước đá - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2 Hoá chất - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch iod mmol/L KI 3% - Nước bọt pha loãng 1/100 Tiến hành - Dùng ống nghiệm có ghi số thứ tự Cho dung dịch theo bảng: 142 Ống nghiệm ml ml Để đá 15’ Để 450C 15’ ml ml Thuốc thử - Nước bọt 1/100 - Dung dịch tinh bột ml Đun sôi 2’, lấy để giá ml Lắc đều, tiếp tục để ống nhiệt độ tương ứng Giả sử phản ứng ống số (ở 450C) xảy nhanh nhất, lấy giọt dịch ống làm phản ứng màu với iod lỗ khay sứ Sau phút lần, lấy giọt dịch ống số thử với iod lỗ khay sứ khơng làm chuyển màu iod nữa, nghĩa ống số phản ứng thuỷ phân tinh bột kết thúc, dừng lại Ngay cho ngày vào ống, ống giọt iod Màu ống thể tiến trình phản ứng thời điểm cho iod vào (cũng thời điểm dừng phản ứng ống) Đọc, nhận xét giải thích Quan sát màu ống giải thích kết IV ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG CỦA ENZYM Nguyên tắc pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hố enzym Mỗi enzym có pH tối ưu cho hoạt động nó, pH mơi trường gần pH tối ưu, tốc độ phản ứng cao, nghĩa enzym hoạt động mạnh Chuẩn bị 2.1 Dụng cụ - Ống nghiệm (3) - Khay sứ có nhiều lỗ - Cốc có mỏ - Pipet paster chia vạch - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2 Hố chất - Các dung dịch đệm phosphat có pH 5,6; 6,8 8,0 - Dung dịch tinh bột 1% NaC 0,9% - Dung dịch iod mmol/L KT 3% - Nước bọt pha loãng 1/100 Tiến hành - Dùng ống nghiệm có ghi số thứ tự Cho dung dịch theo bảng: 143 Ống nghiệm Thuốc thử - Dung dịch đệm phosphat pH 5,6 ml - Dung dịch đệm phosphat pH 6,8 ml - Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ml - Dung dịch tinh bột NaCl ml ml ml - Nước bọt 1/100 ml ml ml Lắc đều, dể ống nhiệt độ 370C Giả sử phản ứng ống số (ở pH 6,8) xảy nhanh nhất, lấy giọt dịch ống số làm phản ứng màu với iod lỗ khay sứ Sau phút lần, lấy giọt dịch ống số thử với iod lỗ khay sứ khơng làm chuyển màu iod nữa, nghĩa ống số phản ứng thuỷ phân tinh bột kết thức, dừng lại Ngay cho vào ống, ống giọt iod Màu ống thể tiến trình phản ứng thời điểm cho iod vào (cũng thời điểm dừng phản ứng ống) Đọc, nhận xét giải thích Quan sát màu ống giải thích kết V ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT HOẠT HÓA VÀ ỨC CHẾ ĐẾN TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG CỦA ENZYM Nguyên tắc Chất hoạt hố chất làm tăng cường hoạt tính xúc tác enzym làm enzym từ trạng thái khơng hoạt động thành trạng thái hoạt động, cịn chất ức chế chất có khả làm giảm hoạt tính xúc tác enzym Chuẩn bị 2.1 Dụng cụ - Ống nghiệm (3) - Khay sứ có nhiều lỗ - Cốc có mỏ - Pipet paster chia vạch - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2 Hố chất - Dung dịch tinh bột 1% - Nước bọt pha loãng 1/20 - Dung dịch iod mmol/L KT 3% - Nước cất - Dung dịch NaCl 1% 144 - Dung dịch CuSO4 1% Tiến hành - Dùng ống nghiệm có ghi số thứ tự Cho dung dịch theo bảng: Ống nghiệm Thuốc thử - Nước bọt 1/20 - Nước cất ml ml ml 10 giọt - Dung dịch NaCl 1% 10 giọt - Dung dịch CuSO4 1% 10 giọt - Dung dịch tinh bột 1% ml ml ml Lắc Giả sử phản ứng ống số (ở điều kiện có NaCl) xảy nhanh nhất, lấy môt giọt dịch ống số làm giảm phản ứng màu với iod lỗ khay sứ Sau phút lần, lấy giọt dịch ống số thử với iod lỗ khay sứ khơng làm chuyển màu iod nữa, nghĩa tai ống số phản ứng thuỷ phân tinh bột kết thúc, dừng lại Ngay cho vào ống, ống giọt iod Màu ống thể tiến trình phản ứng thời điểm cho iod vào (cũng thời điểm dừng phản ứng ống) Đọc, nhận xét giải thích Quan sát màu ống giải thích kết chất chất hoạt hố, chất chất ức chế enzym amylase 145 BÀI HEMOGLOBIN MỤC TIÊU: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, vật liệu để - Xác định tính chất giống peroxidase hemoglobin - Tìm sắc tố mật nước tiểu - Tìm hemoglobin niệu Thực hành bước quy trình kỹ thuật xác định tính chất giống peroxidase hemoglobin, tìm sắc tố mật nước tiểu, tìm hemoglobin niệu Đọc, nhận định kết xác Thái độ cẩn thận, nghiêm túc, trung thực NỘI DUNG Đại cương: Hemoglobin (Hb) protein hồng cầu (HC), chiếm khoảng 34% khối lượng HC Người trưởng thành có khoẳng 150g Hb 1lít máu tồn phần Trong HbA1 chiếm khoảng 98% HbA2 xấp xỉ 2% Chức Hb vận chuyển khí: CO2 O2 Hemoglobin có tính chất giống enzim peroxidase Hồng cầu trưởng thành có đời sống trung bình 120 ngày Hồng cầu già phá huỷ thoái hoá tổ chức võng nội mơ Sản phẩm thối hố Hb bilirubin Bilirubin vận chuyển máu dạng kết hợp với albumin huyết đến gan liên hợp với glucuronat tạo thành bilirubin liên hợp Bilirubin liên hợp đưa vào túi mật xuống ruột Nhờ vi khuẩn ruột bilirubin biến đổi thành urobilinogen Một phần sắc tố tái hấp thu trở vào máu gan đào thải qua thận nước tiểu, phận đào thải qua phân I XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT GIỐNG PEROXIDASE CỦA HEMOGLOBIN (Phản ứng Adler) Nguyên tắc Hemoglobin có tác dụng phân huỷ H2O giải phóng oxy hoạt động Chất oxy hoá dung dịch benzidin acid acetic thành màu xanh ve Chuẩn bị 2.1 Dụng cụ - Bộ dụng cụ lấy máu tĩnh mạch: bơm tiêm vô khuẩn, garo, bông, panh, ống đựng máu chống đông - Máy ly tâm - Ống nghiệm, giá cắm ống nghiệm - Cốc có mỏ 146 - Pipet thuỷ tinh chia vạch, bóp cao su - Pipet nhỏ giọt (pipet paster) - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2 Hố chất - NaCl 0,9% - Nước cất - Dung dịch Benzidin: + Benzidin: 0,15g + Acid acetic: 5mL - Dung dịch H2O2 10 thể tích (hay H2O2 3%) - Dung dịch Hb 0,01% - Dung dịch HC 0,05% (v/v) Các chuẩn bị dung dịch HC: lấy 2mL máu tồn phần có chống đơng, đem ly tâm 3000g/phút 10 phút Hút loại bỏ huyết tương bạch cầu Rồi rửa HC NaCl 0,9% với thể tích gấp 10 lần thể tích máu lần Sau lần rửa ly tâm 5000g/phút phút, loại bỏ nước, giữ lại HC Lấy 0,5ml HC cho vào 1000ml dung dịch NaCl 0,9% 2.3 Bệnh phẩm: máu tồn phần có chống đơng Tiến hành: - Dùng ống nghiệm có ghi số thứ tự Cho dung dịch theo bảng: Ống nghiệm Thuốc thử - Dung dịch benzidin - Nước cất 1mL 1mL 1mL 1mL - Dung dịch Hb 0,01mg% 1mL - Dung dịch HC 0,05% 1mL - Dung dịch H2O2 10 giọt 10 giọt 10 giọt - Lắc nhẹ ống nghiệm Đọc, nhận xét giải thích kết - Quan sát màu dung dịch ống nghiệm.Giải thích kết quả? II TÌM SẮC TỐ MẬT TRONG NƯỚC TIỂU Tìm bilirubin nước tiểu (kỹ thụât Harrisson) 1.1 Nguyên tắc Dùng bari clorid để tạo thành bilirubinat kết tủa Rồi oxy hoá tủa FeCl3 tạo màu xanh ve 1.2 Chuẩn bị 1.2.1 Dụng cụ 147 - Dụng cụ đựng nước tiểu tươi: chai, lọ, ống nghiệm - Ống nghiệm, giá cắm ống nghiệm - Cốc có mỏ, bình tam giác - Phễu thủy tinh, giấy lọc - Pipet thuỷ tinh chia vạch, bóp cao su - Pipet nhỏ giọt (pipet paster) - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 1.2.2 Hoá chất - Dung dịch BaCl2: 10% nước - Dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà - Thuốc thử Fuxe gồm: + Acid Tricloacetic 25% 100mL + Dung dịch FeCl3 10% 10mL Hoặc pha thuốc thử Fuxe theo cách sau: Hồ tan 25g acid tricloacetic nước cất, thêm 0,9 gam FeCl3 Hoàn thành 100mL với nước cất 1.2.3 Bệnh phẩm: nước tiểu tươi (mới lấy) 1.3 Tiến hành - Kiểm tra, đối chiếu mẫu nước tiểu với phiếu xét nghiệm Đánh số ống nghiệm - Cho vào ống nghiệm lần lượt: Hút 5ml nước tiểu tươi ↓ ↓ hút tiếp 2,5 ml dung dịch BaCl2, nhỏ tiếp 2-3giọt dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà Lắc đều, đem lọc lấy tủa Đợi cho chảy kiệt nước mở rộng giấy lọc Nhỏ vào tủa giọt thuốc thử Fuxe Nếu có bilirubin xuất vịng xanh ve xung quanh giọt thuốc thử Hoặc tiến hành sau: Cắt giấy lọc với kích thước x 1cm Ngâm vào dung dịch bari clorid bão hồ, đem phơi khơ sấy khơ Nhúng đầu mẩu giấy vào nước tiểu khoảng 10 giây Lấy nhỏ vào phần giấy ướt giọt thuốc thử Fuxe Nếu có bilirubin xuất màu xanh ve 1.4 Nhận định giải thích kết Bilirubin có nước tiểu trường hợp vàng da gan: Do tế bào gan bị tổn thương tiết sản phẩm từ gan bị tổn thương viêm gan 148 virus nhiễm độc Trong trường hợp vàng da sau gan tắc mật, phổ biến sỏi đường mật, K đường mật, K tuỵ Tìm Urobilinogen (phương pháp Erhlich) 2.1 Nguyên tắc Urobilinogen tác dụng với thuốc thử Erhlich tạo thành màu đỏ 2.2 Chuẩn bị 2.2.1 Dụng cụ - Dụng cụ đựng nước tiểu tươi: chai, lọ, ống nghiệm - Ống nghiệm, giá cắm ống nghiệm - Cốc có mỏ - Pipet thuỷ tinh chia vạch, bóp cao su - Pipet nhỏ giọt (pipet paster) - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2.2 Hoá chất Thuốc thử Erhlich: - Paradimethylamino benzaldehyd - Nước cất - Acid HCl tinh khiết 0,7g 100mL 150Ml 2.2.3 Bệnh phẩm: nước tiểu 2.3 Tiến hành - Kiểm tra, đối chiếu mẫu nước tiểu với phiếu xét nghiệm Đánh số ống nghiệm - Cho vào ống nghiệm Nước tiểu (đã để nguội) 5mL Thuốc thử Erhlich 2-3 giọt Hút 5ml nước tiểu ↓ ↓ nhỏ tiếp 2-3giọt thuốc thử Erhlich - Lắc ống nghiệm, quan sát 2.4 Đọc, nhận xét đánh giá kết - Nước tiểu khơng chuyển màu Khi đun nóng chuyển sang đỏ Phản ứng âm tính (bình thường) - Nước tiểu chuyển sang màu đỏ nhiệt độ thường Phản ứng dương tính 2.5 Nhận định kết 149 Urobilinogen bình thường có nước tiểu Tăng urobilinogen nước tiểu tổn thương gan: Xơ gan, ung thư gan, vàng da tắc mật, nhiễm độc, nhiễm khuẩn trường hợp ruột bị tổn thương III TÌM HEMOGLOBIN TRONG NƯỚC TIỂU Phản ứng với pyramidon (Kỹ thuật Thevenon Rolland) 1.1 Nguyên tắc: Máu (Hemoglobin) có tác dụng enzym Peroxydase, giải phóng Oxy từ nước oxy già, Oxy oxy hố số thuốc thử cho màu đặc biệt 1.2 Chuẩn bị: 1.2.1 Dụng cụ: Các dụng cụ khơng dính máu - Ống nghiệm to - Giá đựng ống nghiệm - Pipet thủy tinh chia vạch ml (2), bóp cao su - Pipet nhỏ giọt (2) - Bìa màu trắng - Cân phân tích - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 1.2.2 Hóa chất - Bột Pyramidon - Nước oxy già 10 thể tích (Mới pha): 3% - Acid acetic (Hoá nghiệm): nguyên chất - Cồn 900 1.2.3 Bệnh phẩm: Lấy nước tiểu buổi sáng sớm (Lấy dịng, nước tiểu khơng lọc) 1.3 Tiến hành: - Kiểm tra, đối chiếu mẫu nước tiểu với phiếu xét nghiệm Đánh số ống nghiệm - Cho vào ống nghiệm: Nội dung STT Hút xác ml nước tiểu Hút xác ml cồn 900 Cân xác 0,25 g Pyramidon đổ vào ống nghiệm, lắc tan Nhỏ giọt acid Actetic Nhỏ giọt oxy già Lắc đều, đọc kết sau - phút: 1.4 Đọc, nhận xét giải thích (+): Có màu tím Tuỳ theo mức độ, nhạt hay đậm mà đánh dấu (+), (++), (+++) (-): Khơng có màu tím 150 1.5 Nhận định kết quả: Phản ứng không cho phép phân biệt đái máu đái huyết sắc tố Phải soi cặn để phát hồng cầu xác định - Đái máu: Chảy máu đường tiết niệu, viêm cầu thận, viêm thận đái máu - Đái huyết sắc tố: Khi có dấu hiệu tan máu Vàng da nặng (chủ yếu vàng da tan huyết); bệnh nhiễm khuẩn (thương hàn, sốt rét); ngộ độc (Phenol, phospho); bệnh đái huyết sắc tố lạnh hay đái huyết sắc tố ban đêm; rắn độc cắn Phản ứng với Benzidin (Phản ứng Adter) 2.1 Nguyên tắc: Máu (Hemoglobin) có tác dụng enzym Peroxydase, giải phóng Oxy từ nước oxy già, Oxy oxy hố số thuốc thử cho màu đặc biệt 2.2 Chuẩn bị: 2.2.1 Dụng cụ: Các dụng cụ khơng dính máu - Ống nghiệm to, giá đựng ống nghiệm - Pipet ml (1), bóp cao su - Pipet nhỏ giọt (1) - Bìa màu trắng - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2.2 Hóa chất - Dung dịch Benzidin gồm: + Benzidin 0,15g + Acid acetic 5mL - Dung dịch H2O2 10 thể tích 2.2.3 Bệnh phẩm: Lấy nước tiểu buổi sáng sớm (Lấy dòng, nước tiểu không lọc) 2.3 Tiến hành: Cho vào ống nghiệm Dung dịch benzidin Dung dịch H2O2 1mL 10 giọt Dịch chiết xuất 1mL Hút 1ml nước tiểu ↓ ↓ hút 1ml dung dịch benzidin nhỏ tiếp 10giọt H2O2 - Lắc ống nghiệm, quan sát 2.4 Đọc, nhận xét giải thích 151 Nếu xuất màu xanh ve, phản ứng dương tính 2.5 Nhận định kết Để phân biệt hồng cầu niệu với Hb niệu, phải ly tâm nước tiểu soi cặn kính hiển vi để phát HC - Hb niệu, phản ứng màu dương tính, mức nước tiểu khơng có HC gặp số bệnh có kèm theo phá huỷ mạnh HC: tan máu, sốt rét, thương hàn, ngộ độc kali clorat, phenol, phospho - Hồng cầu niệu, phản ứng màu dương tính, soi cặn nước tiểu có hồng cầu Nguyên nhân do: viêm niệu đạo (do lậu, chấn thương), lao K tuyến tiền liệt, sỏi bàng quang, viêm thận, lao thận, K thận, sỏi thận, giun 152 BÀI ACID NUCLEIC MỤC TIÊU: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, vật liệu để xác định thành phần nucleoprotein Thực hành bước quy trình kỹ thuật: tách thuỷ phân nucleoprotein từ men bia; xác định thành phần nucleoprotein; định lượng acid uric huyết nước tiểu Đọc, nhận định kết xác Thái độ cẩn thận, nghiêm túc, trung thực NỘI DUNG I TÁCH NUCLEOPROTEIN TỪ MEN BIA VÀ XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN Nguyên tắc Men bia nguyên liệu giàu nucleoprotein Trong mơi trường acid đun nóng nucleoprotein men bia bị thuỷ phân theo sơ đồ sau: - Phát protein phản ứng Biurê - Phát base purin theo nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, base purin tác dụng với AgNO3 tạo thành muối bạc base purin có dạng tủa xốp trắng, để lâu ánh sáng chuyển sang màu nâu xám - Phát ribose phản ứng Orcin - Phát H3PO4 phản ứng tạo thành amoniphospho molypdat có màu vàng chanh 153 Chuẩn bị: 2.1 Dụng cụ: - Ống nghiệm to (5), giá đựng ống nghiệm - Ống sinh hàn ngược - Nồi cách thủy - Bình tam giác, phễu lọc, giấy lọc - Pipet ml (1), bóp cao su - Pipet nhỏ giọt (1) - Cân phân tích - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2 Hóa chất - Men bia - Acid sulfuric 5% - Dung dịch NaOH 10% - Thuốc thử Biurê - Thuốc thử Orcin - Thuốc thử molypden - Dung dịch amoniac đặc - Dung dịch AgNO32N Tiến hành: 3.1 Tách thuỷ phân nucleoprotein từ men bia: Cho vào ống nghiệm lớn 0,5g men bia khô tán nhỏ 10mL H 2SO45%, trộn Đậy ống nghiệm ống sinh hàn ngược Đun cách thuỷ sôi Để nguội, lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc để tìm sản phẩm thuỷ phân * Xác định sản phẩm thuỷ phân: 3.2 Xác định protein phản ứng Biurê: Trong ống nghiệm: 10 giọt dịch lọc giọt NaOH 10% (để trung hoà) 10 giọt thuốc thử Biurrê Lắc nhận xét màu 3.3 Xác định ribose phản ứng Orcin Trong ống nghiệm 1mL thuốc thử Orcin giọt dịch lọc Đun cách thuỷ sôi, đun trực tiếp thấy xuất màu xanh 3.4 Xác định acid phosphoric cách tạo thành amoniphosspho molypdat Trong ống nghiệm giọt dịch thuỷ phân 10 giọt thuốc thử molypden Đun cách thủy sơi, dịch có màu vàng chanh Để nguội có kết tủa màu vàng 3.5 Xác định base purin 154 Trong ống nghiệm: 1mL dịch thuỷ phân 0,5mL amoniac đặc giọt AgNO3 2N Lắc có tủa xốp trắng Để lâu ngồi ánh sáng tủa chuyển dần thành màu nâu xám Nhận xét giải thích II PHẢN ỨNG ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC TRONG HUYẾT THANH VÀ NƯỚC TIỂU Acid uric sản phẩm thoái hoá cuối base nitơ purin (adenin, guani) người Từ tổ chức, acid uric đưa vào màu đào thải khỏi thể qua đường nước tiểu Có thể định lượng acid uric huyết nước tiểu Nguyên tắc (phương pháp PAP) Acid uric tác dụng uricase bị oxy hoá tạo thành allantoin, CO2 H2O2 Tiếp theo, H2O2 phản ứng với acid 3,5-diclor-2-hydroxybenzensulfonic (DCHBS) 4aminophenazon (PAP) nhờ enzym peroxidase tạo phức chất màu tím đỏ Chuẩn bị: 2.1 Dụng cụ: - Bộ dụng cụ lấy máu tĩnh mạch dụng cụ lấy nước tiểu - Ống nghiệm to, giá đựng ống nghiệm - Cốc có mỏ - Micro pipet:10-100L, 100-1000L - Sổ, bút - Khay để dụng cụ, hóa chất 2.2 Hóa chất Thuốc thử (của hãng Human) RGT: - Đệm phosphat (pH 7.0) 50 mmol/L - 4-Aminophenazon 0,3mmol/L - DCHBS mmol/L - Uricase > 200 U/L - Peroxidase > 1000 U/L STD: - 3mL Standard acid uric 8mg/dL 476 mmol/L 0 Thuốc thử sau pha để 15 C – 25 C, tránh ánh sáng, RGT ổn định tuần 2.3 Bệnh phẩm - Huyết thanh, huyết tương chống đông heparin EDTA 155 - Nước tiểu: Pha loãng trước định lượng: thể tích nước tiểu + 10 thể tích nước cất Tiến hành - Dùng ống nghiệm có ghi số thứ tự: trắng, chuẩn, thử Cho dung dịch theo bảng: Ống nghiệm Trắng Thử Mẫu Thuốc thử - Mẫu chuẩn (STD) 20L - Huyết nước tiểu 20L - Thuốc thử RGT 1000L 1000L 1000L - Lắc, để 10 phút 200C – 250C, phút 370C - Đo mật độ quang học ống vòng 15 phút bước sóng 520nm đối chiếu với ống trắng Tính kết Nồng độ acid uric huyết E thử E thử C=8x mg/dL C = 476 x mol/L E mẫu E mẫu Nồng độ acid uric nước tiểu E thử E thử C = 88 x mg/dL C = 5235 x mol/L E mẫu E mẫu Chú ý: Kết xác nồng độ acid uric 20mg/dL 1190umol/L Khi nồng độ acid uric mẫu thử cao, vượt giới hạn phải pha loãng mẫu thử với nước muối 0,9% theo tỷ lệ 1/1 nhân kết với Nhận định kết Bình thường người: Huyết thanh: Nam: 3,4 – 7,0 mg/dL 200 – 420 mol/L Nữ: 2,4 – 5,7 mg/dL 140 – 340 mol/L Nước tiểu: 250-750 mg/24 1,5 – 4,5 mmol/24 Hàng ngày, lượng acid uric nước tiểu có tăng giảm theo chế độ ăn nhiều thịt hay nhiều rau Trong bệnh thống phong (Gout) lúc cơn, acid uric giảm đột ngột sau tăng cao Acid uric niệu gặp bệnh đa bạch cầu, bỏng nặng, viêm phổi 156 ... trị hố sinh y học - Hố sinh nghiên cứu chức phận thể, nhiệm vụ tế bào, mô, liên quan chúng với - Hóa sinh giúp y học tìm hiểu số bệnh sinh thay đổi bệnh lý chuyển hố chất - Hóa sinh giúp y học... Oxydoreductase - Enzym oxy hóa khử AH2 +B A + BH2 Transferase - Enzym vận chuyển nhóm AX + B A + BX Hydrolase- Enzym th? ?y phân AB + H2O Lyase - Enzym phân cắt AB A+B Izomerase - Enzym đồng phân hóa ABC BCA... hố Trình b? ?y chất hô hấp tế bào Trình b? ?y trình tạo thành CO2 H2O hơ hấp tế bào Trình b? ?y phosphoryl - oxy hoá loại liên kết phosphat Trình b? ?y giai đoạn chu trình acid citric nêu ý nghĩa chu trình