KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID I CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG Các alkaloid (alcaloid) base hữu thường dễ tan dung môi hữu (như ether, benzen, cloroform, aceton, methanol, ethanol…) Đa số alkaloid base thực tế không tan nước Một vài alkloid khơng có oxy tồn trạng thái lỏng tan nước Một số alkaloid dạng lỏng bay lơi theo nước Một số alkaloid khơng có oxy dạng rắn thăng hoa áp suất thường Một số alkaloid có –OH phenol tan phần dung dịch kiềm mạnh Dưới dạng muối, alkaloid thường tan nước, cồn (ethanol, methanol) hay hỗn hợp cồn nước; chúng không tan tan dung môi hữu phân cực (ether, benzen, chloroform…) II TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ALKALOID Alkaloid thường base yếu, tan dung môi hữu cơ, không tan nước Khi cho alkaloid tác dụng với acid thu alkaloid dạng muối Các muối alkaloid thường dễ tan nước Các muối dễ bị chất kiềm vô (NH4OH, NaOH) chí cá muối khác (Na2CO3, đơi NaHCO3) đẩy khỏi muối cho lại alkaloid ban đầu Alkaloid phản ứng với thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành muối khó tan (dạng kết tinh hay vơ định hình) ứng dụng định tính alkaloid Một số alkaloid hay nhóm alkaloid cho màu sắc đặc trưng với số thuốc thử gọi thuốc thử đặc hiệu alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng dụng định tính làm thuốc thử phát sắc ký III KIỂM ĐỊNH CÁC ALKALOID Trong kiểm định dược liệu chứa alkaloid, tiêu kiểm định chung cho dược liệu, người ta phải tiến hành định tính định lượng alkaloid dược liệu Có thể định tính alkaloid trực tiếp mơ thực vật hay dịch chiết dược liệu Để định tính alkaloid vi phẫu thực vật, người ta quan sát tủa alkaloid với thuốc thử Bouchardat kính hiển vi Đơi định tính trực tiếp alkaloid mặt cắt dược liệu thuốc thử đặc hiệu Để định tính alkaloid dịch chiết dược liệu, thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu sắc ký lớp mỏng phương pháp thường dùng Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid dược liệu phương pháp cân, phương pháp thể tích, phương pháp quang phổ Tùy trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích hợp Cũng kết hợp phương pháp phân tách (thường phương pháp sắc ký) với việc định lượng (thường phương pháp quang phổ) để định lượng riêng hay vài alkaloid hỗn hợp alkaloid tồn phần Kết biểu thị bằng: - % alkaloid tồn phần có dược liệu (phương pháp cân trực tiếp) - % cuả alkaloid tồn phần có dược liệu quy theo alkaloid (phương pháp cân gián tiếp, phương pháp chuẩn độ acid-base, phương pháp quang phổ) - % alkaloid có dược liệu (phương pháp kết hợp sắc ký- quang phổ) IV CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID Trong cây, alkaloid thường tồn dạng muối hòa tan với acid hữu vô hay dạng kết hợp với tanin Người ta chiết alkaloid khỏi nguyên liệu thực vật nhiều cách nhìn chung quy cách là: - Chiết alkaloid khỏi dược liệu dạng alkaloid base dung môi hữu - Chiết alkaloid khỏi dược liệu dạng muối dung môi phân cực (nước, cồn, hỗn hợp cồn nước acid hóa) Với vài alkaloid đặc biệt, người ta chiết xuất cách: - Phương pháp cất kéo lôi theo nước (chiết xuất nicotin từ Thuốc lá) - Phương pháp thăng hoa (chiết cafein từ Trà) Dựa vào tính tan khác dạng base dạng muối alkaloid dung mơi, người ta loại phần tạp chất khỏi dịch chiết trước định tính, định lượng hay phân lập alkaloid tinh khiết Các quy trình chiết thường sử dụng chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid Ghi chú: thể tích dung mơi chiết, thời gian chiết phương pháp thay đổi tùy thuộc vào dược liệu phương tiện sử dụng 1 Chiết dung môi hữu môi trường kiềm (Phương pháp 1) Bột dược liệu (5g) - Kiềm hóa NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm) - Chiết nóng 20-30ml CHCl3 (đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc chiết Sohxlet) Dịch chiết CHCl3 H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu NH4OH đậm đặc → pH 10 Chiết CHCl3 (10ml x 2-3 lần) Dịch chiết CHCl3 Định tính phương pháp sắc ký Bốc tới cắn khơ Cắn alkaloid base Định tính thuốc thử đặc hiệu Chiết nước acid (Phương pháp 2) Bột dược liệu (5g) Làm ẩm bột dược liệu 10 phút 20ml dung dịch H2SO4 2% Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20ml) Dịch chiết nước acid NH4OH đậm đặc → pH 10 CHCl310ml x lần Dịch chiết CHCl3 Định tính phương pháp sắc ký Định tính thuốc thử đặc hiệu H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu Chiết cồn acid (Phương pháp 3) Bột dược liệu (5g) Làm ẩm bột dược liệu 10 phút 20-30ml cồn có 5% acid (sulfuric, hydrochlorid, acetic) Đun hồi lưu/BM 10 phút, lọc Dịch chiết cồn acid - Trung hòa đến pH 5-6 (nếu cần) - Bay cồn bếp cách thủy đến cắn - Hòa tan cắn nước nóng (10mlx lần), lọc Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu NH4OH đậm đặc → pH 10 Chiết CHCl3 (10ml x 2-3 lần) Dịch chiết CHCl3 Chiết với H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid Định tính phương pháp sắc ký Định tính thuốc thử đặc hiệu Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu BÀI ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Chiết alkaloid khỏi dược liệu phương pháp thích hợp - Xác định alkaloid dịch chiết dược liệu thuốc thử chung - Phát alkaloid dược liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Định tính alkaloid thuốc thử chung Để phát alkaloid dược liệu phản ứng hóa học, thơng thường người ta chiết alkaloid khỏi quan thực vật phương pháp chiết thích hợp dùng thuốc thử để phát đánh giá sơ có mặt chúng dược liệu Tùy theo phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp Các phản ứng với thuốc thử chung thường thực với muối alkaloid môi trường nước acid Các thuốc thử chung cho với alkaloid tủa vơ định hình có màu sắc không đặc trưng thay đồi tùy theo thuốc thử Với số thuốc thử, tủa tan lại tỏng lượng thuốc thử thừa Trong điều kiện quy định lượng dược liệu, lượng dung môi, cách chiết thuốc thử sử dụng dựa vào mức độ tạo tủa, lượng thuốc thử sử dụng để đánh giá sơ hàm lượng alkaloid nguyên liệu Các thuốc thử thường dùng Bouchardat,Valse-Mayer, Dragendroff, Bertrand, Hager acid tanic Định tính alkaloid phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) SKLM sử dụng phương pháp phát có mặt, đồng thời đánh giá sơ thành phần alkaloid dược liệu sử dụng hệ dung mơi thích hợp Tiến hành sắc ký song song với alkaloid chuẩn cịn cho phép nhận định có mặt alkaloid dược liệu SKLM cịn hữu dụng việc xác định dược liệu sắc ký so sánh với dược liệu chuẩn Pha tĩnh: định tính alkaloid SKLM thường dùng silicagel G, F254, GF254 Các pha tĩnh khác nhôm oxyd, silicagel pha đảo dùng Dung môi khai triển Dung môi khai triển cho sắc ký alkaloid thường hỗn hợp hay dung môi hữu cơ; thường từ phân cực yếu tới phân cực trung bình (như hexan, benzen, ether ethylic, cloroform, dicloromethan, ethyl acetat) Có thể sử dụng thêm dung mơi hữu có tính kiềm (pyridin, dimethyl formamid, diethylamin, triethylamin) lượng nhỏ kiềm vô (thường amoniac đặc) cách pha thẳng vào hệ dung môi hay cách để bão hịa khí bình sắc ký Đơi khi, dung môi phân cực mạnh butanol, ethanol, methanol, nước, acid acid acetic, acid formic dùng alkaloid phân cực mạnh Mẫu thử Mẫu thử thường alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base tồn phần, hịa tan dung mơi phân cực dễ bay cloroform, ether… Các dung dịch alkaloid muối (pha EtOH, MeOH) sử dụng dung mơi khai triển hệ dung mơi phân cực mạnh, thường có thêm acid Phát vết Để phát vết alkaloid sắc ký người ta thường phun (hoặc nhúng) với thuốc thử Dragendroff Các alkaloid cho vết màu đỏ cam màu trắng Các cách phát thông thường soi đèn UV (254nm 365nm) hơ iod dùng phương pháp bổ sung không đặc hiệu Ghi nhận kết Ghi nhận số lượng vết quan sát sắc đồ màu sắc với phương pháp phát Rf tỉ lệ tương đối vết alkaloid hỗn hợp Rf chất A định nghĩa tỷ số đoạn đường di chuyển chất A (lA) đoạn đường di chuyển dung mơi (lO) tính từ mức xuất phát mẫu thử Trị số Rf < 1,00 ln có hai số lẻ (ví dụ 0,08; 0,72…) Trong điều kiện sắc ký định, giá trị Rf chất đặc trưng chất hệ dung mơi sử dụng Tuy nhiên, giá trị R f phụ thuộc vào nhiều yếu tố (bản chất, bề dày độ hoạt hóa pha tĩnh, pha động, mức độ bão hịa dung mơi, độ ẩm nhiệt độ mơi trường…) nên người ta sử dụng giá trị Rx ổn định để biểu thị đặc trưng chất Rx chất A so với chất quy chiếu X định nghĩa tỷ số đoạn đường di chuyển hóa chất A (lA) đoạn đường di chuyển chất quy chiếu X (lX) điều kiện (cùng sắc ký) Khác với Rf, trị số RX > 1,00 lấy số lẻ Chất quy chiếu thường dùng sắc ký alkaloid quinin, Rf alkaloid so với quinin ghi RQ II THỰC HÀNH Dược liệu - Bình vơi - Lá sen - Tâm sen Chiết xuất alkaloid Chiết dược liệu thuộc phương pháp để thực phản ứng định tính thuốc thử chung - Bình vơi: chiết alkaloid dung mơi hữu (phương pháp 1) Lấy dịch chiết nước acid để định tính với thuốc thử chung alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM - Lá sen: chiết nước acid (phương pháp 2) Lấy dịch chiết nước acid lần (sau giai đoạn cloroform) để định tính với thuốc thử chung alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM - Tâm sen: chiết cồn acid (phương pháp 3) Lấy dịch chiết nước acid (trong thực tập, lấy dịch chiết nước acid giai đoạn đầu tiên) để định tính với thuốc thử chung alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM Ghi chú: phương pháp chiết, lượng dung môi hóa chất dùng để làm ẩm, để chiết cho dược liệu thay đổi tùy thuộc vào loại dược liệu điều kiện thực tế Định tính alkaloid thuốc thử chung Lấy ống nghiệm nhỏ, cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết nước acid Cho riêng rẽ vào ống nghiệm giọt thuốc thử Bouchardat, Valse-Mayer, Dragendroff Hager, ống giữ làm ống chứng Lắc đều, quan sát nhận định kết Nếu cần cho thêm 1-2 giọt thuốc thử Nhận định kết (-) Dung dịch (+) Dung dịch đục mờ khơng lắng xuống (++) Dung dịch đục, có tủa lắng xuống sau vài phút (+++) Có tủa lắng xuống Dung dịch đục sau thêm giọt thuốc thử thứ (++++) Có tủa nhiều Định tính alkaloid phương pháp SKLM Chuẩn bị mỏng Có hai loại: mỏng tự tráng mỏng tráng sẵn Hiện nay, mỏng tráng sẵn sử dụng phổ biến Với mỏng tráng sẵn, dùng bàn cắt kéo cắt thành miếng có kích thước thích hợp (2,5 x 10cm), khơng cần sấy hoạt hóa Chuẩn bị dung mơi bình sắc ký Bình sắc ký rửa sấy nhẹ đến khơ Lót lịng bình giấy lọc Nhỏ lên miếng giấy lọc 3-4 giọt NH4OH đậm đặc lót dung mơi sắc ký vào bình (lớp dung mơi cao khoảng 0,5cm) Đậy nắp kín (nếu cần, thoa vaseline miệng bình), đặt nơi phẳng, để yên 30 phút trước triển khai Các hệ dung môi sử dụng S1 = benzen : aceton (1:4) S2 = CHCl3 : MeOH : NH4OH (50:9:1) Đưa mẫu lên mỏng, triển khai phát Dùng mao quản chấm lên sắc ký vết, từ trái sang phải dung dịch alkaloid base tồn phần cloroform Bình vơi Tâm sen Các vết chấm phải nhỏ, gọn (nên chấm thành vạch 1mm x 3mm), thẳng hàng cách nhau, vết cách vết ≥ 0,5cm;cách mép bên ≥ 0,5cm cách mép khoảng 1,5cm Tùy theo nồng độ dịch thử mà chấm với số lần thích hợp, cho sau triển khai phun thuốc thử vết khơng q mờ, khó phát không đậm, làm vết to, chồng lấn lên Đặt mỏng vào bình sắc ký, đậy kín nắp để yên (các vết chấm phải nằm cao lớp dung môi) Khi dung môi chạy cách mép khoảng 0,5cm, lấy mỏng ra, dùng bút chì đánh dấu mức dung mơi, để khô tự nhiên hay sấy nhẹ cho hết dung môi Phát vết sắc đồ cách: - Soi đèn UV 254nm 365nm - Phun (hoặc nhúng nhanh) thuốc thử Dragendroff (trong tủ hốt!) Vẽ sắc ký đồ phát UV 245nm thuốc thử Dragendroff Ghi nhận lại màu sắc vết UV 365nm sau phun thuốc thử Dragendroff Tính Rf vết màu với thuốc thử Dragendroff Ghi nhận xét  ... Bột dược liệu (5g) Làm ẩm bột dược liệu 10 phút 20ml dung dịch H2SO4 2% Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20ml) Dịch chiết nước acid NH4OH đậm đặc → pH 10 CHCl 310 ml x lần Dịch chiết CHCl3 Định tính... phương tiện sử dụng 1 Chiết dung môi hữu môi trường kiềm (Phương pháp 1) Bột dược liệu (5g) - Kiềm hóa NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm) - Chiết nóng 20-30ml CHCl3 (đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc chiết... đến cắn - Hòa tan cắn nước nóng (10 mlx lần), lọc Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu NH4OH đậm đặc → pH 10 Chiết CHCl3 (10 ml x 2-3 lần) Dịch chiết CHCl3